Phản ứng multiplex Real time RT-PCR cần được tối ưu các thành phần trong phản ứng cũng như chương trình luân nhiệt đểđạt hiệu quả cao nhất. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện của phản ứng như nhiệt độ lai, nồng độ MgCl2, nồng độ mồi và mẫu dò, nồng độ enzyme Taq polymerase… Ở mỗi thí nghiệm, giá trịđược chọn là giá trịtương ứng với giá trị Ct thấp nhất. Giá
trịđược chọn sẽđược sử dụng cho các bước tối ưu tiếp theo. Mẫu chứng được sử
dụng trong các thí nghiệm là mẫu vaccine EU và mẫu VR2332 (ATCC). Các
mẫu này được pha loãng trong các huyết thanh heo âm tính với PRRSV (Đã được kiểm tra kháng thể và phân lập virus bởi Công ty Thuốc Thú y Trung Ương – Navetco), và được tách chiết RNA bằng phương pháp Phenol-Chloroform. Cụ thể các thong sốđược khảo sát trong đề tài gồm:
− Nhiệt độ lai: khảo sát ở dãy nhiệt độ lai từ 55-650C. Các gradient nhiệt độ do máy CFX96 thiết lập. − Nồng độ MgCl2: tiến hành khảo sát ở ba nồng độ: 3,5 mM; 4,5 mM; 5,5 mM. − Nồng độ mồi: tiến hành khảo sát ba nồng độ mồi PR6: 200 nM, 300 nM và 400 nM − Nồng độ mẫu dò: tiến hành khảo sát ba nồng độ mẫu dò PR6-P1: 100 nM, 150 nM và 200 nM
− Nồng độ enzyme Taq polymerase: tiến hành khảo sát ở 4 nồng độ: 1unit, 1,5 unit, 2 unit và 2,5 unit.
2.3.7. Xác định ngưỡng phát hiện và sựđặc hiệu của quy trình
−Ngưỡng phát hiện: mẫu VR2332 được pha loãng bậc 10 trong huyết
thanh âm tính thành các mẫu có nồng độ từ 103,75 TCID50/0,2 ml đến 10-1,25
TCID50/0,2 ml. Các mẫu này được tách chiết RNA bằng phương pháp Phenol-
Chloroform rồi phiên mã ngư ợc thành cDNA. Cuối cùng, các cDNA được thực
hiện phản ứng multiplex Real time RT-PCR với các thành phần đã tối ưu ở trên. Ngưỡng phát hiện được xác định là nồng độ virus mà tại đó phản ứng Real time RT-PCR vẫn còn khảnăng phát hiện được virus có trong mẫu.
−Sựđặc hiệu của phản ứng trên các đối tượng vi sinh vật khác: thực hiện phản ứng multiplex Real time RT-PCR trên các mẫu chứa các vi khuẩn và virus
thường xuất hiện trên heo nhưng không nhiễm PRRSV gồm: Transmissible
gastroenteritis Coronavirus (TGEV, mẫu ATCC), Porcine Rotavirus (ATCC) và
Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV, mẫu tạo dòng); (2) các mẫu chứa các vi
khuẩn Clostridium perfringenes (mẫu tạo dòng), Salmonella spp.(ATCC) và E.
coli (ATCC). Phản ứng được xem là đặc hiệu khi không có tín hiệu huỳnh quang nào trên tất cả các mẫu chứa vi sinh vật khác.
2.3.8. So sánh hiệu quả phát hiện và phân type với kit thương mại
20 mẫu huyết thanh heo thực địa đã được kiểm tra bằng kháng thể kháng
PRRSV bằng phương pháp ELISA (Công ty thuốc Thú y Trung Ương-Navetco)
sẽđược sử dụng để so sánh sự phát hiện và phân type PRRSV bằng quy trình mà chúng tôi xây dựng với kit thương mại Real time RT-PCR của Shanghai ZJ Biotech.
2.3.9. Các bước chuẩn bị cho việc tạo kit chẩn đoán hoàn chỉnh
Sau khi đã xây dựng xong quy trình Real time RT-PCR đồng thời phát hiện và phân type PRRSV, do thời hạn đề tài có hạn nên chúng tôi tiến hành các bước khởi đầu cho việc tạo kit chẩn đoán hoàn chỉnh bao gồm so sánh hiệu quả
tách chiết RNA bằng phương pháp Phenol-Chlorofom và phương pháp Boom và
tạo chứng dương cho quy trình
2.3.9.1. So sánh hiệu quả tách chiết RNA bằng phương pháp
Phenol-Chlorofom
Nhằm đưa ra các lựa chọn cho người sử dụng, chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu quả tách chiết RNA bằng hai phương pháp: Phenol- Chloroform và Boom. Các mẫu chứng VR2332 với ba nồng độ pha loãng 102,75, 101,75 và 100,75 TCID 50/0,2 ml và các mẫu huyết thanh heo thực địa được tách chiết RNA bằng cảhai phương pháp. Sau đó tiến hành phản ứng Real time RT-PCR với các mẫu
trên. Hiệu quả tách chiết bằng hai phương pháp tách chiết được đánh giá thông qua giá trị Ct.
2.3.9.2. Phương pháp tạo dòng gene làm chứng dương
Nguyên tắc: tạo dòng gene là phương pháp nh ằm chèn một đoạn gene mục tiêu vào một vector có khảnăng sao chép độc lập với tế bào vật chủ. Vector sau khi được gắn chèn sẽ được đưa vào tế bào chủ để tiến hành nhân lên với số lượng lớn. Tạo dòng gene bao gồm các chiến lược: tạo dòng đầu bằng, tạo dòng đầu dính, tạo dòng đầu A-T. Tùy theo mục đích nghiên cứu mà lựa chọn phương pháp tạo dòng thích hợp.
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành tạo hai dòng plasmid chứa trình tự
mục tiêu của PRRSV type NA và PRRSV tye EU theo chiến lược đầu bằng. Sơ
đồ tạo dòng được trình bày trong hình 2.5.
Hình 2. 5. Sơ đồ tạo dòng PRRSV type EU và type NA làm chứng dương
2.1.1.1. Thu nhận vùng trình tự mục tiêu bằng phản ứng PCR
Thành phần phản ứng PCR nhân bản vùng trình tự ORF7 bằng cặp mồi
PR10 với enzyme Pfu DNA polymerase gồm:
Buffer Pfu 10X (Promega): 2,5 µl
Trình tự mục tiêu PRRSV được nhân bản bằng Pfu
pBluescript Sma I Sma I pBlue tái tổ hợp EU EU NA pBlue tái tổ hợp NA
dNTP 10mM (Promega – U1410): 1,0 µl
Mồi Pr-10_f 10µM: 1,0 µl
Mồi Pr-10_r 10µM: 1,0 µl
Mẫu cDNA (EU/NA) 1,0 µl
Pfu Polymerase (Promega- M7741) 0,5 µl
Dd H2O: 7,0 µl
Chương trình PCR như sau:
− Bước 1: 95oC trong 5 phút
− Bước 2 (lặp lại 35 chu kì) 94oC trong 30 giây 55oC trong 30 giây 72oC trong 1 phút
− Bước 3 72oC trong 6 phút
Sau khi PCR xong, kiểm tra kết quả phản ứng bằng cách điện di trên gel agarose 1,5%.
2.1.1.2. Phản ứng cắt plasmid pBluescript với enzyme Sma I
Buffer J 10X (Promega) 4,0 µl
Dung dịch BSA 10X (Promega) 4,0µl
Sma I 1,0 µl
Plasmid pBluescript (1µg/µl) 2,0 µl
Dd H2O 29 µl
Ủở 25oC trong 4 giờ.
2.1.1.3. Tinh sạch sản phẩm cắt
− Sản phẩm cắt được tinh sạch theo các bước sau:
− Cho vào một thể tích phenol: cloroform (1:1), vortex đều. − Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi phía trên. − Cho vào 200 ul cloroform. Vortex đều cho đến khi thấy trắng đục. − Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi
− Cho vào 1/10 thể tích dung dịch Natri acetate 3M, pH 5,2. − Cho thêm hai thể tích ethanol tuyệt đối
− Giữở -200C trong 2h
− Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, thu tủa.
− Rửa tủa bằng 1 ml ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. − Để tủa khô, hòa trong 20 µl TE 1X.
2.1.1.4. Phản ứng nối: pBluescript đã cắt với SmaI 1 µl Sản phẩm PCR-NA/EU 3 µl Buffer 10X 1,0 µl T4 ligase (3u/µl) 1,0 µl ddH2O 4,0 µl
Đặt phản ứng ở 160C trong 16 giờ. Sau đó biến nạp toàn bộ sản phẩm của phản ứng nối với tế bào E.coli khả nạp
2.1.1.5. Biến nạp hỗn hợp phản ứng nối vào tế bào E.coli DH5α
Nguyên tắc
Phương pháp biến nạp Calcium chloride (CaCl2) lạnh dựa trên hiện tượng ion Ca2+ có thể gây ra những xáo trộn trên màng tế bào làm cho DNA xâm nhập vào tế bào E.coli dễ dàng hơn. Tiếp theo là giai đoạn sốc nhiệt nhằm kích thích sự chuyển của phân tử plasmid vào trong tế bào. Môi trường dinh dưỡng được thêm vào sau đó cho phép tế bào hồi phục và plasmid tiến hành sao chép, phiên mã, dịch mã genee để tạo nên các protein tương ứng. Tùy thuộc vào đặc điểm của vector dùng trong tạo dòng mà ta chọn môi trường trãi đĩa thích h ợp nhằm tạo điều kiện dễ dàng cho việc sàng lọc.
Quy trình biến nạp bao gồm các bước sau :
Bước 1 : Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5α
− Cấy chuyền các tế bào E. coli DH5α từ ống nghiệm giữ giống vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LB. Tiến hành nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC.
− Cấy 500 µl dịch nuôi cấy trên vào 50 ml môi trường LB, nuôi cấy lắc ở 37oC trong 2 giờđến khi đạt giá trị OD600 từ 0,3-0,6.
− Tiến hành ly tâm thu sinh khối tế bào ở vận tốc 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC.
− Hòa sinh khối trong 25 ml dung dịch CaCl2 100 mM lạnh. Ủ trong đá 30 phút
− Ly tâm thu sinh khối tế bào với vận tốc 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC.
− Huyền phù nhẹ nhàng sinh khối tế bào trong 1 ml dung dịch CaCl2 100 mM. Giữ tế bào khả nạp trên đá nhằm chuẩn bịcho bước biến nạp.
Bước 2: Biến nạp hỗn hợp phản ứng nối vào tế bào E.coli DH5α khả nạp
− Cho toàn bộ phản ứng nối vào 100 µl tế bào khả nạp. − Ủtrong đá 30 phút.
− Sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây. − Chuyển vào khay đá, ủ trong 2 phút.
− Bổsung 900 µl môi truong dinh dưỡng LB và nuôi ủ hoạt hóa trong 1 giờ − Ly tâm thu sinh khối ở vận tốc 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Cô đ ặc và trãi hết dịch vi khuẩn trên đĩa môi trư ờng LB Agar Ampicillin/IPTG/Xgal, ủ ở 37oC trong 16 giờ.
2.1.1.6. Sàng lọc khuẩn lạc có chứa plasmid tái tổ hợp
Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc gồm:
− Master mix 2x (h-tag): 12,5 µl
− Mồi T7 promoter 10µM: 1,0 µl
− Mồi Pr10-r 10µM: 1,0 µl
− DNA Mẫu 1 ít tế bào vi khuẩn
− Dd H2O: 10,5 µl
2.1.1.7. Kiểm tra kết quả tạo dòng bằng giải trình tự plasmid tái tổ hợp
Plasmid tái tổ hợp được gửi giải trình tự bằng phương pháp Sanger (Macrogene-Hàn Quốc). Kết quả giải trình tự được phân tích bằng Blast nhằm kiểm tra khẳng định đã tạo dòng đúng trình tự mục tiêu.
2.1.2. Phương pháp phân tích kết quả giải trình tự bằng Blast (Basic local alignment search tool): local alignment search tool):
Blast là một công cụ cho phép tìm kiếm và so sánh sựtương đồng của một trình tự mục tiêu với các trình tự khác có trong cơ sở dữ liệu (GeneBank,
EMBL…). Cách tiến hành Blast được tiến hành như sau:
- Vào mục nucleotide trong địa chỉ
- Nhập trình tự mục tiêu vào mục “Enter query sequence”. - Trong mục “Data base” chọn “Others”. Chọn “Blast”.
Hình 2. 6. Kết quả Blast trình tự cần so sánh với các trình tự có trong ngân hàng gene (NCBI)
Kết quả Blast (hình 2.6) được trình bày theo thứ tự trình tự có mức độtương đồng từ cao đến thấp. Đầu tiên là các mã số (accession) cho phép truy cập vào các trình tự tương đồng trong GenBank. Tiếp theo là thông tin (Description) về nguồn gốc cũng như chức năng của các trình tựđó. Kếđến là các thông số cho ta biết mức độtương đồng của trình tự với trình tự mục tiêu bao gồm:
- Giá trị E value: cho biết xác suất của vùng tương đồng xuất hiện không ngẫu nhiên. Giá trị này càng nhỏ thì mức độtương đồng càng cao.
- Giá trị Max indent: cho biết phần trăm tương đồng của các trình tự. Giá trị
3.1.1. Thiết kế mồi và mẫu dò Taqman
PRRSV là virus có sự biến động về trình tự gene khá lớn giữa các type. Các công trình nghiên cứu cho thấy chỉ có khoảng 40-60 % sự tương đồng về mặt di truyền [21]. Điều này gây bất lợi cho việc thiết kế cặp mồi chung cho việc phát hiện PRRSV; nhưng mặt khác, đó lại là điểm có lợi trong việc phân type PRRSV. Hầu hết các kĩ thuật sinh học phân tử hiện nay đều sử dụng vùng trình tự ORF 7 của bộ gene PRRSV làm mục tiêu cho việc thiết kế mồi/mẫu dò vì đây là vùng trình tựđặc biệt, vừa có tính bảo tồn cao, vừa mang các vùng đặc trưng cho từng type [29], [32], [43], [45]. Do đó, ORF7 là vùng thích hợp cho việc thiết kế cặp mồi/mẫu dò có khảnăng đồng thời phát hiện và phân type PRRSV.
Để tiến hành đề tài này, chúng tôi sử dụng cặp mồi và mẫu dò PR4 (phần II, mục 1.2.1 ) được lấy từ công trình nghiên cứu của Egli C. et al (2001) [16];
đồng thời chúng tôi cũng t ự thiết kế cặp mồi và mẫu dò PR6 dựa trên cách tiếp cận của công trình trên. Kết quảđược trình bày trong hình 3.1.
Hình 3. 1: Kết quả sắp gióng cột trình tự mồi và mẫu dò PR6 bắt cặp đặc hiệu trên cả hai type PRRSV
PR6-R PR6-F PR6-P2 PR6-P1 EU NA
để tìm được một vùng hoàn toàn tương đồng giữa hai chủng PRRSV. Ngay cả trên những vùng tương đồng này cũng có m ột số nucleotide khác biệt giữa hai type. Do đó chúng tôi sử dụng các nucleotide thoái hóa tại các vị trí này, cụ thể là nucleotide R (A hoặc G) trong trình tự của mồi xuôi PR6-F; K (G hoặc T), M (A hoặc C), S(C hoặc G) trong trình tự của mồi ngược PR6-R, và R (A hoặc G) trong trình tự mẫu dò PR6-P1.
Tương tự, chúng tôi cũng tiến hành thiết kế các cặp mồi và mẫu dò chứng nội dùng để kiểm soát toàn bộ quy trình phát hiện PRRSV . Trong đề tài này,
chúng tôi sử dụng ba cặp mồi được lấy từ công trình Erkens T. et al (2006) và
Nygard A.B. et al (2006). Các cặp mồi này bắt cặp đặc hiệu trên gene biểu hiện
protein beta-actin (ACTB) và TATA box binding protein (TPB) và ribosomal protein L4 (RPL4). Đây là các protein có sự biểu hiện ổn định trong mô và huyết
thanh [17], [38]. Tiếp theo chúng tôi sử dụng phần mềm AlleleID 7.0 để thiết kế
các mẫu dòtương ứng.
Như vậy sau khi thực hiện các bước trên chúng tôi thu được các cặp mồi/mẫu dò có khảnăng bắt cặp đặc hiệu trên cảhai type PRRSV đồng thời cho phép phân biệt từng type. Ngoài ra, chúng tôi cũng thiết kếđược ba bộ mồi/mẫu dò làm chứng nội nhằm kiểm soát toàn bộ qui trình phát hiện PRRSV. Trình tự của các cặp mồi và mẫu dò được mô tả trong chương 2, bảng 2.1 . Các mồi và mẫu dò này sẽ được sử dụng để đánh giá khả năng hoạt động trên thực nghiệm trong các bước sau.
3.1.2. Đánh giá khảnăng hoạt động của bộ mồi PR4 và bộ mồi PR6
Đểđánh giá khảnăng hoạt động của các cặp mồi và mẫu dò trên mẫu thực tế như thế nào, chúng tôi tiến hành so sánh hiệu quả phát hiện và phân type của hai bộ mồi/mẫu dò PR4 và PR6. Hiệu quả hoạt động của cặp mồi /mẫu dò được đánh giá thông qua khả năng phân type PRRSV và giá trị chu kì ngưỡng (Ct) thấp nhất. Phản ứng monoplex Real time RT-PCR với từng cặp mẫu dò riêng biệt
và vaccine Amervac (PRRSV type EU) với kết quảđược trình bày trong hình 3.2 và bảng 3.1.
Hình 3. 2: So sánh bộ mồi PR4 và PR6. A: Mẫu vaccine EU; B: Mẫu vaccine NA; C và D: mẫu chứng âm .
Bảng 3. 1: Giá trị Ct của các mẫu chứng khi so sánh hai bộ mồi PR4 và PR6
Tên bộ
mồi/mẫu dò
Vaccine EU Vaccine NA Chứng âm
PR4 29,95 32,72 39,57 (VIC)
PR6 31,42 33,92 N/A
Nhận xét
Bộ mồi PR4 với hai mẫu dò được gắn màu VIC và FAM cho sự nhận biết lần lượt sản phẩm nhân bản của PRRSV type EU và NA. Tương tự, bộ mồi PR6 với hai mẫu dò PR6 được gắn màu HEX và FAM. Chất dập quỳnh quang dùng
cho mẫu dò PR4 là TAMRA và chất dập quỳnh quang dùng cho PR6 là BHQ -1.
D C B PR6 PR4 A PR4 PR6 D
mồi và mẫu dò (PR4 và PR6) đều có khảnăng phát hiện và phân type PRRSV. Dựa vào bảng 3.1 cho thấy bộ mồi PR4 có giá trị Ct thấp hơn bộ mồi PR6 trên cả hai mẫu vaccine EU và vaccine NA. Tuy nhiên, bộ mồi PR4 thường cho kết quả dương tính ở mẫu chứng âm. Chúng tôi đã kiểm tra lặp lại trên 12 mẫu chứng âm (chỉ cho nước), kết quả cho thấy tín hiệu dương tính xuất hiện 8/12 mẫu. Hai nguyên nhân có thể giải thích cho trường hợp này là: (1) mẫu dò của bộ mồi PR4 đã bị phân hủy; (2) các mẫu dò PR4 sử dụng chất dập quỳnh quang là
TAMRA. Theo các nghiên cứu cho thấy đây là chất dập quỳnh quang không ổn
định và không thích hợp với màu VIC [8], [33], do đó có khả năng trong quá trình luân nhiệt, chất dập TAMRA không hấp thụ hoàn toàn chất phát huỳnh quang màu VIC. Kết quả là ở những mẫu âm tính (không có cDNA của virus),