Để chứng minh sựđặc hiệu của quy trình, chúng tôi tiến hành tách chiết và thực hiện phản ứng Real time RT-PCR trên các hai nhóm mẫu: (1) các mẫu chứa
các chủng virus: Transmissible gastroenteritis Coronavirus (TGEV, mẫu
ATCC), Porcine Rotavirus (ATCC) và Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV, mẫu tạo dòng); (2) các mẫu chứa các vi khuẩn Clostridium perfringenes (mẫu tạo
dòng), Salmonella spp.(ATCC) và E. coli (ATCC). Đây là các vi sinh vật thường
xuất hiện ở heo và là tác nhân gây bệnh tiêu chảy cấp ở heo.
Đối với nhóm virus thì chúng tôi tách chiết RNA rồi phiên mã ngược thành
cDNA. Đối với nhóm vi khuẩn thì chúng tôi tách chiết DNA. Các cDNA và
DNA này được sử dụng để kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng multiplex Real
103,75 102,75 101,75 100,75 10-0,25 10-1,25 NA 26,01 29,13 32,11 34,20 38,10 40,25 IC7 33,29 33,13 33,16 33,18 32,57 33,06 Nồng độ NA (TCID50/0,2 ml) Giá trị Ct trung bình
3.10.
Nhận xét:
Kết quả Real time RT-PCR trên hình 3.10 cho thấy không có tín hiệu xuất hiện ở tất cả các mẫu chứa E. coli , Salmonella spp, Clostridium perfringenes, TGEV, PEDV và Porcine Rotavirus. Nhưng đồng thời ở tất cả các mẫu này đều xuất hiện các tín hiệu điện di duy nhất trên bản gel agarose khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho từng đối tượng (hình 3.11).
Từ các kết quả trên hình 3.10 và 3.11, chúng tôi có thể kết luận quy trình
multiplex Real time RT-PCR đồng thời phát hiện và phân type PRRSV của
chúng tôi có độ đặc hiệu cao, chỉ cho phép phát hiện PRRSV, không phát hiện các chủng vi sinh vật thường xuất hiện ở heo.
Hình 3. 10: Kiểm tra độ đặc hiệu của quy trình Real time RT-PCR
TGEV
Clostridium perfringenes
PEDV
Salmonella spp TGEV
Hình 3. 11: Kết quảđiện di sản phẩm PCR từ các vi khuẩn và virus
Ghi chú:
- Giếng 1: thang kích thước DNA 1 kp
- Giếng 2: sản phẩm PCR từ E. coli có kích thước 113 bp.
- Giếng 3: sản phẩm PCR từ Salmonella spp có kích thước 570 bp
- Giếng 4: sản phẩm PCR từ Clostridium perfringenes có kích thước 327 bp - Giếng 5: sản phẩm PCR từ TGEV có kích thước168 bp
- Giếng 6: sản phẩm PCR từ PEDV có kích thước 651 bp
- Giếng 7: sản phẩm PCR từ Porcine Rotavirus có kích thước 356 bp
3.4.3. Đánh giá khảnăng phát hiện và phân type của phản ứng multiplex Real Time RT-PCR trên mẫu có sự hiện diện đồng thời PRRSV type