Để tiến hành tạo dòng PRRSV cho mục đích làm chứng dương, đầu tiên
chúng tôi thu nhận trình tự mục tiêu từ hai dòng với vaccine Amervac đại diện
cho PRRSV type EU và chủng VR2332 (ATCC) đại diện cho PRRSV type NA.
Kết quả trên hình 3.12 chứng tỏ chúng tôi đã thu nhận được trình tự mục tiêu type EU với kích thước 660 bp (giếng 2) và trình tự mục tiêu type NA với kích thước 637 bp (giếng 3).
Hình 3. 12: Kết quảđiện di sản phẩm PCR từ mẫu EU và mẫu NA
Giếng 1: chứng âm
Giếng 2: sản phẩm PCR từ mẫu EU Giếng 3: sản phẩm PCR từ mẫu NA
Giếng 3; Thang kích thước DNA 1kb (Solgent)
1 2 3 4
cắt giới hạn Sma I với các thành phần như mục 2.7.2. Phản ứng cắt được thực hiện ở 40C trong 4 giờ. Sau đó, tiến hành tinh sạch sản phẩm cắt bằng phương pháp Phenol-Chloroform theo quy trình ở mục 2.7.3. Kết quả cắt plasmid
pBluescript SK II được trình bày trong hình 3.13 cho thấy chúng tôi đã thu nhận được plasmid pBluescript SK II ở dạng mạch thẳng với kích thước tương đương 2961 bp (giếng 3).
Hình 3. 13: Kết quả phản ứng cắt giới hạn plasmid pBluescript SK II
Giếng 1: Thang kích thước DNA 1kb –Promega
Giếng 2: Plasmid pBluescript không thực hiện phản ứng cắt Giếng 3: Plasmid pBluescript sau khi thực hiện phản ứng cắt
Sau khi thu nhận plasmid pBluescript II SK và trình tự mục tiêu (PRRSV type EU và PRRSV type NA) ở dạng mạch thẳng với hai đầu bằng, chúng tôi thực hiện phản ứng nối và biến nạp vào tế bào khả nạp E.coli DH5α. Trải tế bào biến nạp trên môi trường dinh dưỡng LB agar Ampiciline/IPTG/Xgal và ủ 16 giờ ở 37oC.Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp là khuẩn lạc có màu trắng.
Tiếp theo chúng tôi tiến hành sàng lọc dòng chứa plasmid tái tổ hợp mang trình tự EU (pBlue-EU) và dòng plasmid tái tổ hợp mang trình tự NA (pBlue- NA). Việc sàng lọc được tiến hành theo ba phương pháp: (1) PCR khuẩn lạc với
mồi T7 promoter và mồi PR10-R (hình 3.14); (2) Real time PCR plasmid tái tổ
1 2 3
và hình 3.17).
Hình 3. 14: Kết quảđiện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi T7 promoter
và PR10-R. A: PRRSV type EU; B: PRRSV type NA
Giếng 1: chứng âm
Giếng 2-7: Sản phẩm PCR trực tiếp trên các khuẩn lạc trắng ( khoảng 670 bp) Giếng 8: Thang kích thước DNA 1kb (Promega)
Kết quả PCR khuẩn lạc trên các khuẩn lạc từ hai nguồn tạo dòng với cặp mồi T7 promotet và PR10-R cho thấy đố chúng tôi thu nhận được hai dòng chứa plasmid tái tổ hợp pBlue-EU (A) và 4 dòng chứa plasmid tái tổ hợp pBlue-NA. Từđại diện của mỗi dòng, chúng tôi thực hiện phản ứng Real time PCR với cặp mồi PR6. Kết quả cho thấy phản ứng multiplex Real time PCR của chúng tôi chỉ cho tín hiệu huỳnh quang phát hiện EU đối với plasmid pBlue-EU và tín hiệu huỳnh quang phát hiện NA đối với plasmid pBlue-NA. (hình 3.15).
Hình 3. 15: Kết quả phản ứng Real time PCR trên plasmid tái tổ hợp
pBlue-EU EU pBlue-NA NA A B 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 8 1 8 2 3 4 5 6 7 B
chắc chắn dòng plasmid tái tổ hợp. Kết quả giải trình tựđược so sánh sự tương đồng với các trình tự đã được công bố trên NCBI bằng công cụ Blast. Kết quả Blast cho thấy:
- Dòng pBlue-EU có sự tương đồng 99% với chủng Amervac
(GU067771.1) và 96 % với chủng Lelystad. Ngoài ra pBlue-EU còn có độ
tương đồng với các trình tự có nguồn gốc PRRSV type EU khác từ 94- 99% (hình 3.16).
- Dòng pBlue-NA có sự tương đồng 99% với chủng VR2332 và nhiều
chủng khác (hình 3.17).
Hình 3. 16: Kết quả Blast trình tự plasmid pBue-EU với các trình tựđã công bố trên NCBI
Hình 3. 17: Kết quả Blast trình tự plasmid pBue-NA với các trình tựđã công bố trên NCBI
Như vậy, từ những kết quả kiểm tra trên chúng tôi khẳng định chúng tôi
đã tạo dòng thành công plasmid mang trình tự PRRSV đặc trưng cho từng type
(EU và NA). Các plasmid này sẽđược sử dụng làm chứng dương trong quy trình Real time RT-PCR sau này.
4.1. KẾT LUẬN
Trong khuôn khổ thực hiện đề tài này, chúng tôi đã thu nh ận được các kết quả sau:
1) Thiết kếđược cặp mồi PR6 cho phép phát hiện PRRSV và hai mẫu dò đặc hiệu cho từng type PRRSV. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng thiết kế được mẫu dò chứng nội IC7 bắt cặp đặc hiệu trên gene mã hóa ribosomal protein L4 (RPL4). Cùng với cặp mồi IC7 được lấy từ công trình của Nygard A.B. et al (2006) [38], bộ mồi và mẫu dò IC7 đư ợc sử dụng làm chứng nội nội sinh, nhằm kiểm soát toàn bộ quy trình phát hiện.
2) Phản ứng multiplex Real time RT-PCR phát hiện và phân type PRRSV
được tối ưu với các thành phần có nồng độ cuối cho thể tích 25µl như sau:
Taq polymerase 1,5 u; MgCl2 4,5 mM; dNTPs 200 µM; các loại mẫu dò
0,1 µM (PP6-P1, PR6-P2, IC7-P) , mồi PR6-F và PR6-R 0,4 µM, mồi
IC7-F và IC7-R 0,2 µM; 2,5 µl cDNA . Hỗn hợp phản ứng được tiến hành luân nhiệt với nhiệt độ lai tối ưu là 570
C.
3) Khảo sát ngưỡng phát hiện và sự đặc hiệu của quy trình multiplex Real time RT- PCR. Qua đó cho thấy quy trình của chúng tôi có thể phát hiện virus PRRSV ở liều lượng 0,3 TCID50/ml và có độ đặc hiệu cao, chỉ cho
phép phát hiện mẫu có chứa virus PRRSV, không cho tín hiệu huỳnh
quang trên mẫu chứa các vi sinh vật thường xuất hiện ở heo .
4) Kết quả so sánh hiệu quả phát hiện và phân type PRRSV trên 20 mẫu heo chăn nuôi với hai loại kit thương mại (Herdchek*PRRS 2XR của IDEXX
và kit phát hiện và phân type PRRSV bằng phương pháp Real time RT-
PCR của Shanghai ZJ Biotech, Co., Ltd) cho thấy quy trình mà chúng tôi
xây dựng có hiệu quả phát hiện tương đồng trên 20/20 mẫu so với kit thương mại của Shanghai XJ Biotech (13 mẫu dương tính với PRRSV
type NA, 1 mẫu dương tính với PRRSV type EU và 6 mẫu âm tính) và
5) Chuẩn bịcác bước khởi đầu cho việc tạo kit chẩn đoán hoàn chỉnh với các kết quả sau:
−Có thể sử dụng cả hai phương pháp Boom và Phenol-Chloroform cho việc tách chiết RNA với hiệu quảtương đương.
−Thu nhận được hai dòng plasmid tái tổ hợp chứa trình tự mục tiêu PRRSV đặc trưng cho từng type (pBlu-EU và pBlu-NA). Hai dòng plasmid tái tổ hợp này được sử dụng làm chứng dương cho quy trình phát hiện và phân type PRRSV.
Tóm lại, quy trình Real time RT-PCR phát hiện và phân type PRRSV mà chúng
tôi xây dựng được mô tảtrong sơ đồ sau:
+ Thiết kế mồi và mẫu dò + Giải trình tự sản phẩm nhân bản + Tạo dòng PRRSV
Mẫu huyết thanh heo
Tách chiết RNA + Boom
+ Phenol-Chlroform
Phiên mã ngược
+ Tối ưu nhiệt độ lai, nồng độ
MgCl2, mồi, mẫu dò, Taq polymerase + Xác định ngưỡng phát hiện, độđặc hiệu Phản ứng multiplex Real time RT-PCR Áp dụng trên mẫu thực địa, so sánh với kit thương mại
+ Kit ELISA (INDEXX, Mỹ) + Real time RT-PCR 1 bước (Shanghai ZJ Biotech, Trung Quốc)
iScriptTM cDNA synthesis Kit của Bio-Rad
4.2. ĐỀ NGHỊ
Từ kết quảthu được chúng tôi đưa ra một sốđề nghịnhư sau:
- Cần khảo sát quy trình trên sốlượng mẫu heo lớn hơnđểnâng độ tin cậy. - Cần giải trình tự một số mẫu heo cho kết quả không tương đồng với kit thương mại.
- Cần tiến hành khảo sát quy trình trên các loại mẫu khác như mẫu tinh dịch, mẫu mô và mẫu thịt. Điều này sẽ mang ý nghĩa l ớn trong việc kiểm soát nguồn heo giống sạch bệnh cũng như nguồn thịt xuất nhập khẩu.
- Khảo sát độ ổn định của quy trình đ ể có thể phát triển thành bộ kit chẩn đoán hoàn chỉnh.