NA và PRRSV type EU
Do việc sử dụng đồng thời các nguồn vaccine nhược độc có nguồn gốc từ
PRRSV type EU và PRRSV type NA, nên có khảnăng ởnước ta đang lưu hành
đồng thời cả hai type PRRSV. Chính vì vậy sẽ có thể có một tỉ lệ nhỏtrường hợp đồng nhiễm cả hai type trên cùng một mẫu heo nuôi. Trường hợp này đã được báo cáo trong công trình của Li V.Y.Y. et al (Hội nghị quốc tế vềPRRS năm
ủ ễ ọ ả ộ ự(2011) khi đánh giá t
100 bp 500 bp 1000 bp
ghi nhận 6/20 mẫu thực địa có sựđồng nhiễm cả hai type PRRSV [1]. Việc đồng nhiễm cả hai type PRRSV có thể dẫn đến nguy cơ tái tổ hợp giữa hai type
PRRSV [30]. Do đó, chúng tôi tiến hành kiểm tra xem phản ứng Multiplex Real Time RT-PCR mà chúng tôi xây dựng có khảnăng phát hiện được sự hiện diện của hai type PRRSV trong cùng một mẫu hay không?
Đầu tiên chúng tôi tiến hành tạo các mẫu đồng nhiễm: (1) mẫu ES1 có nồng độ virus NA cao và virus EU thấp và (2) mẫu ES2 có nồng độ virus NA thấp và virus EU cao. Sau đó tiến hành phản ứng Real time RT-PCR đối chiếu giữa mẫu đồng nhiễm với các mẫu đơn nhiễm chứa lượng virus tương đương. Kết quảđược trình bày trong bảng 3.9:
Bảng 3. 9: Giá trị Ct của mẫu đồng nhiễm và đơn nhiễm PRRSV
Tên mẫu EU NA ES1 ES2
Giá trị Ct 35,22 28,52 38,02/30,10
27,84 38,54 28,57/37,64
Nhận xét:
Kết quả trong bảng 3.9 cho thấy quy trình của chúng tôi có khảnăng phát hiện ở những mẫu chứa vật liệu di truyền của cả hai type PRRSV. So sánh giá trị Ct giữa mẫu đồng nhiễm và mẫu đơn nhiễm cho thấy ở mẫu đồng nhiễm có sựgia tăng giá trị từ 1-3 Ct (giảm độ nhạy) chứng tỏ có sự cạnh tranh giữa các mồi và mẫu dò. Kết quảđánh giá tương tự cũng đã được chứng minh trong công trình của Egli C. et al (2001).
Như vậy, qua thí nghiệm trên chúng tôi có thể kết luận phản ứng
multiplex Real Time RT-PCR mà chúng tôi xây dựng có thể phát hiện và phân type được mẫu huyết thanh đơn nhiễm cũng như đồng nhiễm hai type PRRSV.
Để kiểm tra khả năng phát hiện và phân type PRRSV của quy trình
Multiplex Real time RT-PCR mà chúng tôi xây dựng trên mẫu heo nuôi thực địa,
chúng tôi tiến hành so sánh quy trình với kit Real time thương mại (kit PRRSV
Real time RT-PCR của Shanghai ZJ Biotech Co., Ltd, Trung Quốc) trên 20 mẫu
thực địa đã được kiểm tra bằng kháng thể ELISA (kit Herdchek*PRRS 2XR của
IDEXX) do công ty Thuốc Thú y Trung Ương-Navetco. Kết quả được trình bày
trong bảng 3.10.
Nhận xét:
Kết quả trên bảng 3.10 cho thấy quy trình Real time RT-PCR của chúng tôi cho kết quảtương đồng cả trên 20/20 mẫu heo với Kit PRRSV Real Time
RT-PCR của Shanghai ZJ Biotech Co., Ltd. Trong 20 mẫu heo được kiểm tra, có
6 mẫu âm tính, 1 mẫu dương tính PRRSV type EU và 13 mẫu dương tính với
PRRSV type NA.
Riêng đối với Kit Herdchek*PRRS 2XR của IDEXX phát hiện kháng thể PRRSV theo nguyên tắc ELISA, quy trình của chúng tôi chỉ cho kết quảđồng nhất trên 16/20 mẫu heo. 4 mẫu cho kết quả không trùng khớp là mẫu 5, 6, 10 và 16. Trong trường hợp mẫu heo âm tính với kháng thể PRRSV (mẫu 5 và 6) nhưng dương tính với hai quy trình Real Time RT-PCR, nguyên nhân của sự không đồng nhất có thểlà do độ nhạy của kit Herdchek*PRRS 2XR. Trường hợp ngược lại, mẫu heo dương tính với kháng thểPRRSV nhưng âm tính với hai quy
trình Real Time RT-PCR, nguyên nhân có thể là do kháng thể PRRSV trong mẫu
heo nuôi có nguồn gốc từvaccine nhược độc.
Như vậy, qua kết quả so sánh với hai bộ kit thương mại, chúng tôi có thể
kết luận quy trình multiplex Real Time RT-PCR của chúng tôi có khả năng đưa
vào ứng dụng thực tiễn trong việc phát hiện và phân type PRRSV, góp phần phát hiện sớm đàn heo mang mầm bệnh đồng thời góp phần theo dõi dịch tễđàn heo.
Số thứ tự Tên mẫu Herdchek*PRRS 2XR PRRSV Real Time RT-PCR (Shanghai ZJ Biotech Co., Ltd)
Quy trình Real time RT-PCR phát hiện và phân type PRRSV 1 2 + + (NA) + (NA) 2 5 - + (NA) + (NA) 3 6 - + (NA) + (NA) 4 9 + +(NA) + (NA) 5 10 + - - 6 11 + + (NA) + (NA) 7 12 + + (NA) + (NA) 8 13 + + (NA) + (NA) 9 14 + + (NA) + (NA) 10 15 + + (NA) + (NA) 11 16 + - - 12 17 + + (NA) + (NA) 13 18 + + (NA) + (NA) 14 19 + + (NA) + (NA) 15 20 + + (NA) + (NA) 16 S5 - - - 17 S7 - - - 18 S8 - - - 19 S10 - - - 20 41 + (EU) + (EU)