local alignment search tool):
Blast là một công cụ cho phép tìm kiếm và so sánh sựtương đồng của một trình tự mục tiêu với các trình tự khác có trong cơ sở dữ liệu (GeneBank,
EMBL…). Cách tiến hành Blast được tiến hành như sau:
- Vào mục nucleotide trong địa chỉ
- Nhập trình tự mục tiêu vào mục “Enter query sequence”. - Trong mục “Data base” chọn “Others”. Chọn “Blast”.
Hình 2. 6. Kết quả Blast trình tự cần so sánh với các trình tự có trong ngân hàng gene (NCBI)
Kết quả Blast (hình 2.6) được trình bày theo thứ tự trình tự có mức độtương đồng từ cao đến thấp. Đầu tiên là các mã số (accession) cho phép truy cập vào các trình tự tương đồng trong GenBank. Tiếp theo là thông tin (Description) về nguồn gốc cũng như chức năng của các trình tựđó. Kếđến là các thông số cho ta biết mức độtương đồng của trình tự với trình tự mục tiêu bao gồm:
- Giá trị E value: cho biết xác suất của vùng tương đồng xuất hiện không ngẫu nhiên. Giá trị này càng nhỏ thì mức độtương đồng càng cao.
- Giá trị Max indent: cho biết phần trăm tương đồng của các trình tự. Giá trị
3.1.1. Thiết kế mồi và mẫu dò Taqman
PRRSV là virus có sự biến động về trình tự gene khá lớn giữa các type. Các công trình nghiên cứu cho thấy chỉ có khoảng 40-60 % sự tương đồng về mặt di truyền [21]. Điều này gây bất lợi cho việc thiết kế cặp mồi chung cho việc phát hiện PRRSV; nhưng mặt khác, đó lại là điểm có lợi trong việc phân type PRRSV. Hầu hết các kĩ thuật sinh học phân tử hiện nay đều sử dụng vùng trình tự ORF 7 của bộ gene PRRSV làm mục tiêu cho việc thiết kế mồi/mẫu dò vì đây là vùng trình tựđặc biệt, vừa có tính bảo tồn cao, vừa mang các vùng đặc trưng cho từng type [29], [32], [43], [45]. Do đó, ORF7 là vùng thích hợp cho việc thiết kế cặp mồi/mẫu dò có khảnăng đồng thời phát hiện và phân type PRRSV.
Để tiến hành đề tài này, chúng tôi sử dụng cặp mồi và mẫu dò PR4 (phần II, mục 1.2.1 ) được lấy từ công trình nghiên cứu của Egli C. et al (2001) [16];
đồng thời chúng tôi cũng t ự thiết kế cặp mồi và mẫu dò PR6 dựa trên cách tiếp cận của công trình trên. Kết quảđược trình bày trong hình 3.1.
Hình 3. 1: Kết quả sắp gióng cột trình tự mồi và mẫu dò PR6 bắt cặp đặc hiệu trên cả hai type PRRSV
PR6-R PR6-F PR6-P2 PR6-P1 EU NA
để tìm được một vùng hoàn toàn tương đồng giữa hai chủng PRRSV. Ngay cả trên những vùng tương đồng này cũng có m ột số nucleotide khác biệt giữa hai type. Do đó chúng tôi sử dụng các nucleotide thoái hóa tại các vị trí này, cụ thể là nucleotide R (A hoặc G) trong trình tự của mồi xuôi PR6-F; K (G hoặc T), M (A hoặc C), S(C hoặc G) trong trình tự của mồi ngược PR6-R, và R (A hoặc G) trong trình tự mẫu dò PR6-P1.
Tương tự, chúng tôi cũng tiến hành thiết kế các cặp mồi và mẫu dò chứng nội dùng để kiểm soát toàn bộ quy trình phát hiện PRRSV . Trong đề tài này,
chúng tôi sử dụng ba cặp mồi được lấy từ công trình Erkens T. et al (2006) và
Nygard A.B. et al (2006). Các cặp mồi này bắt cặp đặc hiệu trên gene biểu hiện
protein beta-actin (ACTB) và TATA box binding protein (TPB) và ribosomal protein L4 (RPL4). Đây là các protein có sự biểu hiện ổn định trong mô và huyết
thanh [17], [38]. Tiếp theo chúng tôi sử dụng phần mềm AlleleID 7.0 để thiết kế
các mẫu dòtương ứng.
Như vậy sau khi thực hiện các bước trên chúng tôi thu được các cặp mồi/mẫu dò có khảnăng bắt cặp đặc hiệu trên cảhai type PRRSV đồng thời cho phép phân biệt từng type. Ngoài ra, chúng tôi cũng thiết kếđược ba bộ mồi/mẫu dò làm chứng nội nhằm kiểm soát toàn bộ qui trình phát hiện PRRSV. Trình tự của các cặp mồi và mẫu dò được mô tả trong chương 2, bảng 2.1 . Các mồi và mẫu dò này sẽ được sử dụng để đánh giá khả năng hoạt động trên thực nghiệm trong các bước sau.
3.1.2. Đánh giá khảnăng hoạt động của bộ mồi PR4 và bộ mồi PR6
Đểđánh giá khảnăng hoạt động của các cặp mồi và mẫu dò trên mẫu thực tế như thế nào, chúng tôi tiến hành so sánh hiệu quả phát hiện và phân type của hai bộ mồi/mẫu dò PR4 và PR6. Hiệu quả hoạt động của cặp mồi /mẫu dò được đánh giá thông qua khả năng phân type PRRSV và giá trị chu kì ngưỡng (Ct) thấp nhất. Phản ứng monoplex Real time RT-PCR với từng cặp mẫu dò riêng biệt
và vaccine Amervac (PRRSV type EU) với kết quảđược trình bày trong hình 3.2 và bảng 3.1.
Hình 3. 2: So sánh bộ mồi PR4 và PR6. A: Mẫu vaccine EU; B: Mẫu vaccine NA; C và D: mẫu chứng âm .
Bảng 3. 1: Giá trị Ct của các mẫu chứng khi so sánh hai bộ mồi PR4 và PR6
Tên bộ
mồi/mẫu dò
Vaccine EU Vaccine NA Chứng âm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
PR4 29,95 32,72 39,57 (VIC)
PR6 31,42 33,92 N/A
Nhận xét
Bộ mồi PR4 với hai mẫu dò được gắn màu VIC và FAM cho sự nhận biết lần lượt sản phẩm nhân bản của PRRSV type EU và NA. Tương tự, bộ mồi PR6 với hai mẫu dò PR6 được gắn màu HEX và FAM. Chất dập quỳnh quang dùng
cho mẫu dò PR4 là TAMRA và chất dập quỳnh quang dùng cho PR6 là BHQ -1.
D C B PR6 PR4 A PR4 PR6 D
mồi và mẫu dò (PR4 và PR6) đều có khảnăng phát hiện và phân type PRRSV. Dựa vào bảng 3.1 cho thấy bộ mồi PR4 có giá trị Ct thấp hơn bộ mồi PR6 trên cả hai mẫu vaccine EU và vaccine NA. Tuy nhiên, bộ mồi PR4 thường cho kết quả dương tính ở mẫu chứng âm. Chúng tôi đã kiểm tra lặp lại trên 12 mẫu chứng âm (chỉ cho nước), kết quả cho thấy tín hiệu dương tính xuất hiện 8/12 mẫu. Hai nguyên nhân có thể giải thích cho trường hợp này là: (1) mẫu dò của bộ mồi PR4 đã bị phân hủy; (2) các mẫu dò PR4 sử dụng chất dập quỳnh quang là
TAMRA. Theo các nghiên cứu cho thấy đây là chất dập quỳnh quang không ổn
định và không thích hợp với màu VIC [8], [33], do đó có khả năng trong quá trình luân nhiệt, chất dập TAMRA không hấp thụ hoàn toàn chất phát huỳnh quang màu VIC. Kết quả là ở những mẫu âm tính (không có cDNA của virus), vẫn có một lượng nhỏ huỳnh quang phát ra và cho dấu hiệu dương tính. Vì thế, bộ mồi/mẫu dò PR4 bị loại và bộ mồi/mẫu dò PR6 được chọn cho việc phát hiện và phân type PRRSV.
Để kiểm chứng kết quả phát hiện và phân type, chúng tôi gửi giải trình tự sản phẩm PCR từ hai mẫu vaccine trên (Macrogene-Hàn Quốc) và một mẫu thực địa. Từ kết quả giải trình tự , chúng tôi sử dụng công cụ Blast để tiến hành so sánh sự tương đồng với các trình tự đã đư ợc công bố trên ngân hàng gene (NCBI). Kết quảđược trình bày trong hình 3.3, hình 3.4 và hình 3.5.
Hình 3. 3: Kết quả Blast trình tự sản phẩm PCR từ mẫu vaccine EU bằng mồi PR6 (F+R) với các trình tựđược công bố trên NCBI
Hình 3. 4: Kết quả Blast trình tự sản phẩm PCR từ mẫu vaccine NA bằng mồi PR6 (F+R) với với các trình tựđược công bố trên NCBI
Hình 3. 5: Kết quả Blast trình tự sản phẩm PCR từ mẫu thực địa bằng mồi PR6 (F+R) với với các trình tựđược công bố trên NCBI
PR6 từ mẫu vaccine EU và mẫu vaccine NA đều tương đồng với các trình tự có nguồn gốc từ PRRSV tương ứng với type đó. Giá trị Max indent ở các trình tự đều đạt 95% (EU) và 99% (NA) và giá trị E value thấp nhất gần bằng 0. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã thiết kế thành công cặp mồi cho phép phát hiện đồng thời PRRSV trên cả hai type; đồng thời thiết kế thành công hai mẫu dò có khả năng bắt cặp đặc hiệu trên từng type PRRSV.
Bên cạnh đó, kết quả Blast sản phẩm PCR từ mẫu thực địa (Hình 3.5) cho thấy PRRSV thuộc chủng Châu Mỹ, có trình tự tương đồng lớn (100%) với các PRRSV có nguồn gốc từ Trung Quốc. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của công trình của Youjun Feng (2008) và Nguyễn Ngọc Hải (2011) khi phân tích di truyền của các chủng virus PRRSV ở Việt Nam.
3.1.3. Đánh giá hiệu quả hoạt động của ba bộ mồi/mẫu dò chứng nội
Trong phản ứng Real time RT-PCR, chứng nội (intrenal control-IC) được sử dụng để kiểm soát toàn bộ quy trình phát hiện như chất lượng của các thành phần nguyên liệu, lượng nguyên liệu đầu vào, sai sót trong quá trình xử lí mẫu, sự hiện diện của các chất ức chế trong mẫu, bước phiên mã không thành công, cũng như các sự cố trong quá trình luân nhiệt...Gene được sử dụng làm chứng nội nội sinh trong phản ứng Real time RT-PCR đòi hỏi phải có sự biểu hiện ổn định, không bị điều hòa hay ảnh hưởng các quá trình sinh học khác trong tế bào [38],[42] . Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành đánh giá khảnăng hoạt động của ba bộ mồi và mẫu dò bằng phản ứng Real time RT-PCR trên 8 mẫu huyết thanh heo. Giá trị Ct ổn định, sai khác không quá 1Ct được sử dụng làm chỉ tiêu đánh giá hiệu quả hoạt động của bộ mồi và mẫu dò. Kết quảđược trình bày trong hình 3.6 và bảng 3.2.
Hình 3. 6: Kết quả phản ứng Real time RT-PCR của các mồi /mẫu dò chứng nội trên mẫu huyết thanh heo
Bảng 3. 2: Giá trị Ct của ba bộ mồi và mẫu dò chứng nội Tên mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 Giá trị Ct trung bình SD Giá trị Ct IC5 31,58 32,38 32,42 33,39 31,73 30,68 31,98 32,36 32,06 ±0,74 IC6 34,11 31,88 32,79 33,78 34,86 33,04 33,85 34,10 33,55 ±0,87 IC7 31,08 30,47 29,51 32,32 31,74 30,11 32,01 31,66 31,11 ±0,93 Ghi chú: SD: độ lệch chuẩn
Kết quả trên hình 3.6 cho thấy cả ba cặp mồi/mẫu dò IC5, IC6 và IC7 đều cho tín hiệu huỳnh quang trên cùng một mẫu huyết thanh heo. Thông qua bảng 3.2 cho thấy cả ba loại protein TATA box binding protein, Beta actin protein và Ribosomal protein L4 đều có giá trị Ct ổn định với độ lệch chuẩn (SD) nhỏ hơn 1. Do đó, có thể kết luận rằng cả ba bộ mồi và mẫu dò IC5, IC6 và IC7 đ ều có thể sử dụng làm chứng nội cho quy trình PCR. Tuy nhiên dựa vào kết quả trên hình và bảng, chúng tôi thấy rằng cặp mồi và mẫu dò IC7 cho giá trị Ct thấp hơn giá trị Ct của hai cặp mồi/mẫu dò còn lại. Vì vậy chúng tôi chọn cặp mồi và mẫu
IC 7 (RPL4) IC 6 (TPB)
bằng phương pháp Real time RT-PCR.
Tóm lại, dựa vào các kết quả nêu trên, chúng tôi có thể kết luận chúng tôi đã thiết kế thành công cặp mồi/mẫu dò PR6 có khả năng đồng thời phát hiện và phân type PRRSV với độ đặc hiệu sản phẩm cao, đồng thời chọn được cặp mồi và mẫu dò chứng nội IC7 (RPL4) cho phép kiểm soát toàn bộ quy trình.Các mồi và mẫu dò được chọn này sẽđược
Tiếp theo chúng tôi tiến hành phối hợp các mồi/mẫu dò trong một phản ứng để tạo phản ứng multiplex Real time RT- PCR.
3.2. Phản ứng Multiplex Real time RT-PCR
Sau khi đã thiết kế thành công các cặp mồi, mẫu dò đặc hiệu, chúng tôi tiến hành thiết lập phản ứng multiplex các cặp mồi và mẫu dò trên.
Đầu tiên, để mô phỏng mẫu thực địa, chúng tôi tiến hành pha loãng mẫu chuẩn VR2332 (ATCC) đại diện cho PRRSV type NA (viết tắt là mẫu EU) và mẫu vaccine Amervac đại diện cho PRRSV type EU (viết tắt là mẫu EU) trong mẫu huyết thanh heo âm tính với PRRSV (mẫu từ heo sạch bệnh được kiểm tra với kháng thể bằng bộ kit ELISA). Mẫu huyết thanh âm tính này được cung cấp bởi Công ty thuốc Thú Y Trung Ương -Navetco. Thực hiện phản ứng multiplex Real time RT-PCR với các thành phần cơ bản tương tự như trong phản ứng monoplex. Kết quảđược trình bày trong hình 3.7 và bảng 3.3.
VR2332 IC7 Mẫu EU EU IC7 Mẫu NA
Bảng 3. 3: So sánh kết quả monoplex và multiplex Real-time RT PCR Phản ứng
Giá trị Ct (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Monoplex Real time RT-PCR
Multiplex Real time RT-PCR
Mẫu EU 31,42 34,68
Mẫu NA 33,92 35,36
Chứng nội IC7 31,30 32,52
Kết quả trong hình 3.7 cho thấy phản ứng multiplex Real time RT-PCR chỉ
phát hiện PRRSV type EU trong mẫu EU và PRRSV type NA trong mẫu NA.
Điều này cho thấy phản ứng multiplex Real time RT-PCR có thể phát hiện và phân type PRRSV đúng với từng loại mẫu chứng. Tuy nhiên, khi so sánh với kết quả monoplex (bảng 3.3), chúng tôi thấy rằng sau khi tổ hợp nhiều thành phần với nồng độ giống như phản ứng monoplex, giá trị Ct của cả hai mẫu chứng EU và NA đều giảm từ 2-3 Ct. Đó là do trong phản ứng multiplex, có nhiều thành phần nên gây cạnh tranh lẫn nhau. Điều này có thể khắc phục bằng các bước tối ưu hóa phản ứng.
Như vậy, về cơ bản phản ứng multiplex Real time RT-PCR của chúng tôi đã thực hiện được nhiệm vụ của nó là đồng thời phát hiện và phân type PRRSV.
3.3. Tối ưu hóa phản ứng Multiplex Real time RT-PCR
Đểtăng cường độ nhạy của phản ứng multiplex Real time RT-PCR, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa phản ứng với các thông số về nhiệt độ lai, nồng độ các thành phần nguyên liệu như MgCl2, mồi, mẫu dò, Taq DNA polymerase. Ở mỗi thông số, chúng tôi khảo sát các giá trị khác nhau, đồng thời giữ nguyên giá trị của các thông số đã được tối ưu trước đó. Giá trị nào có Ct thấp nhất sẽ được chọn làm giá trị tối ưu cho thông số đó. Các thí nghiệm được khảo sát trên hai mẫu chứng: mẫu EU và mẫu NA được pha loãng trong huyết thanh âm tính.
Đầu tiên, chúng tôi tiến hành khảo sát một dãy nhiệt độ để chọn ra nhiệt độ lai tối ưu cho quy trình. Nhiệt độ lai là một nhân tố quan trọng cần phải được tối ưu trong phản ứng PCR. Nhiệt độ lai thấp làm mồi gắn vào mạch khuôn không đặc hiệu và do đó tạo ra những sản phẩm kí sinh. Nhiệt độ lai quá cao tạo điều kiện khắc nghiệt hơn cho mồi khi gắn vào mạch khuôn, vì thế sản phẩm sẽ có ít hoặc thậm chí không tạo thành được sản phẩm. Trong thí nghiệm này chúng tôi chọn dãy nhiệt độ từ 55-650C làm nhiệt độ khảo sát. Gradient nhiệt độ giữa các thí nghiệm do máy CFX 96 (Biorad) thiết lập. Kết quả được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3. 4: Giá trị Ct của mẫu EU và mẫu NA ở các nhiệt độ lai khác nhau Tên mẫu Nhiệt độ (0C) Mẫu EU Mẫu NA Chứng nội 65,0 36,07 34,16 N/A 64,5 36,83 33,94 N/A 63,3 35,13 34,05 37,13 61,4 34,44 35,04 32,50 59,0 33,72 33,51 31,36 57,0 33,93 33,86 30,98 55,7 34,08 32,62 31,09 55,0 34,27 33,86 30,86 Nhận xét
Dựa vào bảng giá trị Ct trên bảng 3.5, chúng tôi nhận thấy:
− Mẫu EU: Giá trị Ct cho kết quả tốt nhất ở khoảng nhiệt độ từ 57-590C. Nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn 57-590C đều cho giá trị Ct càng cao (độ nhạy càng giảm).
Nhiệt độcàng tăng thì giá trị Ct càng tăng, độ nhạy càng giảm.
− Chứng nội IC7: Giá trị Ct cho kết quả tốt nhất tương ứng với nhiệt độ lai từ 55-570C. Khi nhiệt độ lai tăng, giá trị Ct càng tăng cho đến không thể phát hiện ở nhiệt độ 64,5-650C.
Như vậy, trong cùng một phản ứng, để đồng thời có một nhiệt độ lai tối ưu cho cả ba đối tượng cần phát hiện là PRRSV type EU, PRRSV type NA và chứng nội IC7, chúng tôi chọn nhiệt độ 570C làm nhiệt độ lai cho quy trình multiplex Real time RT-PCR.
3.3.2. Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: nồng độ MgCl2
Thông số tiếp theo mà chúng tôi khảo sát là nồng độ MgCl2. MgCl2 là thành phần cần thiết cho hoạt động của enzyme DNA polymerase vì là cofactor
của enzyme này. Nếu thành phần MgCl2 không đủ sẽ làm cho enzyme
polymerase hoạt động không hiệu quả, giảm độ nhạy của phản ứng. Nếu thành