Xây dựng quy trình PCR điện di phát hiện virut gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp trung đông

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm thiết lập phương pháp PCR phiên mã ngược phát hiện virut gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp Trung Đông (MERS-CoV). Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐIỆN DI PHÁT HIỆN VIRUT GÂY HỘI CHỨNG VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP TRUNG ĐÔNG Ngơ Tất Trung*; Trần Thị Thu Hiền*; Phan Quốc Hồn*; Lê Hữu Song* TÓM TẮT Đặc điểm lâm sàng chứng viêm đường hô hấp cấp Trung Đông (Middle East respiratory syndrome gây Middle East respiratory syndrome coronavirus MERS-CoV) dễ nhầm với hội chứng viêm đường hô hấp cấp (Severe acute respiratory syndrome - SARS) Tại thời điểm tại, chưa có cơng cụ chẩn đốn phát tác nhân gây bệnh nguy hiểm Thiết lập quy trình PCR điện di phát virut gây hội chứng MERS-CoV Phần mềm Invitrogene vector NTI-11.2 bệnh phẩm chuẩn âm thu thập Bệnh viện TWQĐ 108 Tổng hợp cADN phiên mã ngược PCR điện di vòng Kết cho thấy mồi SHPT108@MERSCoV-L, SHPT108@MERS-CoV-S hồn tồn có khả phát có mặt đoạn ARN coronavirus mật độ copy ARN virut/1.000 copy ARN đối chứng, đồng thời không tạo băng PCR phụ không bắt cặp chéo vào khu vực có tính tương đồng thấp hệ gen người Kết luận: kỹ thuật PCR điện di phát ARN coronavirus thiết kế thành công * Từ khóa: Hội chứng viêm đường hơ hấp cấp Trung Đông; Betacoronarivus ESTABLISH A PCR ASSAY FOR DIAGNOSING MIDDLE EAST RESPIRATORY SYNDROME BETA-CORONAVIRUS SUMMARY Middle East respiratory syndrome is clinically similiar to severe acute respiratory syndrome (SARS) hence, but the tool to differentiate the two diseases is unavailable at the moment The aim of this study is to build up a simple screening procedure for beta-coronavirus (MERS-CoV) The reverse transcriptase followed by polymerase chain reaction (PCR): Results shown that the two primer set SHPT108@MERS-CoV-L, SHPT108@MERS-CoV-S were optimized that allow to detect presence of one betacoronavirus RNA copy out of 1,000 ABL RNA copies without any mis-amplification from MERS-CoV free samples * Key words: Middle East respiratory syndrome; Betacoronavirus ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng viêm đường hô hấp cấp Trung Đông (gây Middle East respiratory syndrome coronavirus [MERS-CoV]) Đây ARN betaconarvirus có đặc điểm di truyền học gần với virut gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp (SARS) Virut bác sĩ Ali Moh Zaki - nhà virut học người Ai Cập phân lập lần từ bệnh nhân (BN) 60 tuổi suy thận kèm viêm phổi cấp, BN sau tử vong [1] * Bệnh viện TWQĐ 108 Người phản hồi (Corresponding): Ngô Tất Trung (ntattrung@yahoo.com) Ngày nhận bài: 23/05/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 03/07/2014 Ngày báo đăng: 23/09/2014 50 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 Cho đến nay, gen MERS-CoV (còn gọi với tên khác HCoVEMC/2012) giải trình tự hồn tồn, bao gồm 30.119 nucleotide chứa khoảng 10 khung đọc mở (open reading frames) Phân tích phả hệ dựa gen coronaviruses replicase cho thấy MERSCoV có đặc điểm di truyền học gần với Tylonycteris bat coronavirus HKU4 (BtCoVHKU4) Pipistrellus bat coronavirus HKU5 (BtCoV-HKU5) khu trú dơi Trước kia, người ta cho coronavirus có khả xâm nhiễm vào người động vật, gây biến chứng không trầm trọng Tuy nhiên, bùng phát virut gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp SARS-CoV vào năm 2002 - 2003 HCoV-EMC/2012 vào năm 2012 cho thấy coronavirus thật có khả gây bệnh nặng, chí gây tử vong cho người [2] Theo Cơ quan Kiểm soát bệnh Hoa Kỳ (Center For Disease Control - CDC), tính đến tháng năm 2014) có 618 BN dương tính 192 BN tử vong MERSCoV, đa số phát nước châu Âu Ả Rập [3] Đặc biệt, số nước châu Á nằm gần Việt Nam Malaysia hay Philippines ghi nhận trường hợp dương tính tử vong [7] Việt Nam chưa ghi nhận trường hợp nhiễm MERS-CoV, nhiên, chủng virut có độc lực mạnh, có khả lây nhiễm từ người sang người, thế, việc chẩn đốn sớm xác tác nhân điều cần làm Hơn nữa, chưa có sở y tế cơng bố thiết lập phương pháp chẩn đốn chủng virut 51 Mục tiêu nghiên cứu nhằm: Thiết lập phương pháp PCR phiên mã ngược phát virut gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp Trung Đông (MERS-CoV) VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu - Các đoạn ARN mã hóa cho phần gen (MERS-CoV), phân lập từ dịch phế quản BN lưu trữ Trung tâm Lưu trữ virut châu Âu (European Virus Archive EVA), Tiến sỹ Tobias Bleicker tặng Khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện TWQĐ 108 - Máy Thermocycler Eppendorff (Hamburg, CHLB Đức) - Máy chụp hình gel (EC3 imaging system Mỹ) - Phần mềm Invitrogene vector NTI-11.2 - Hóa chất: Tris-base, taq-polymerase, Trizol (Sigma, Mỹ) - Các bệnh phẩm huyết dương tính với HBV, HCV, mẫu cADN bạch cầu tủy mạn thu thập Bệnh viện TWQĐ 108 sinh phẩm chuẩn cho thí nghiệm sinh học phân tử Phƣơng pháp nghiên cứu Mẫu ARN chuẩn dương ARN bệnh phẩm dùng làm khuôn cho phản ứng phiên mã ngược tổng hợp cADN bổ sung cADN lại dùng cho phản ứng PCR điện di, với cặp mồi đặc hiệu cho khu vực mã hóa đầu nguồn (upstream coding region) HCoV-EMC/2012 Để tiện cho thảo luận sau này, chúng tơi gọi mồi SHPT108@MERS-CoV-L SHPT108@MERS-CoV-S) với trình tự sau: TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 SHPT108@MERS-CoV-L UpE-Fwd2 GTGCCTGCAACGCGCGATTCAGTT UpE-Rev2 GATTAGCCTCTACACGGGACCCATAG SHPT108@MERS-CoV-S ORF1b-Fwd TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT ORF1b-Rev TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Khả phát mồi SHPT108@MERS-CoV-L SHPT108@MERSCoV-S Theo hướng dẫn chẩn đoán cúm Tổ chức Y tế Thế giới ban hành, để khẳng định tồn chủng virut cúm mẫu bệnh phẩm, cần thực phản ứng PCR với mồi khác biệt Vì thế, thiết kế thử nghiệm hai cặp mồi khác SHPT108@MERS-CoV-L, SHPT108@MERS-CoV-S bắt vào khu vực HCoVEMC/2012 Kết điện di cADN không xuất băng phụ (sản phẩm cADN) không đặc hiệu Điều khẳng định tính đặc hiệu mồi chúng tơi sử dụng Hình 1: Khả phát mồi dùng chẩn đốn HCoV-EMC/2012 Tính chất đặc hiệu trình tự gen mồi chẩn đốn khuếch đại Hình 2: Tính chất đặc hiệu trình tự gen mồi chẩn đốn khuếch đại 52 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 Để khẳng định mồi sử Phản ứng PCR điện di sử dụng mồi dụng (SHPT108@MERS-CoV-L) khơng SHPT108@MERS-CoV-L hồn tồn có khả cho kích thước với thiết kế phát vật liệu di truyền ARN mà trình tự tương đồng với thông tin coronavirus mức copy ARN virut/1.000 coronavirus lưu trữ Ngân hàng ARN người khỏe mạnh Gen, chúng tơi tiến hành giải trình tự đoạn amplicon mồi SHPT108@MERS-CoV-L BÀN LUẬN khuếch đại Kết cho thấy, phổ sắc ký Việc chẩn đoán virut cúm H5N1, giải trình tự rõ ràng (hình 2, panel trên) H7N9, H8N10 đòi hỏi xét nghiệm định danh trình tự thu có tính tương đồng gần mức độ phân tử Riêng betacoronavirus tuyệt đối so với trình tự gen coronavirus chủng virut đặc biệt nguy hiểm lây từ lưu trữ Ngân hàng NCBI (hình 2, panel lạc đà dơi sang người [4], chủng virut panel dưới) gây triệu chứng lâm sàng giống Ngƣỡng phát PCR Để xác định mật độ tối thiểu số copy ARN coronavirus mà xét nghiệm chúng tơi có khả phát được, tiến hành pha lỗng đoạn ARN mã hóa cho gen Upstream coding region vào ARN tổng số tách từ người khỏe mạnh nồng độ khác nhau, sau tiến hành tách ARN tổng số dùng làm khn cho phản ứng phát coronavirus Kỹ thuật nhằm tạo sản phẩm chứa ARN virut có nồng độ gần tương đồng BN nhiễm virut thực tế lâm sàng hội chứng SARS Tuy nhiên, nước ta chưa có sở y tế cơng bố cơng cụ chẩn đốn chủng virut nguy hiểm [5] Thơng thường, để phát khẳng định tác nhân gây bệnh mới, người ta phải khuếch đại đoạn gen đặc hiệu, sau tiến hành giải trình tự so sánh với trình tự biết ngân hàng gen Cách làm phù hợp với nghiên cứu khám phá khơng phù hợp với quy trình chẩn đốn bệnh thường quy, hội chứng viêm đường hơ hấp virut cúm bao gồm virut SARS betacoronavirus thường có diễn biến cấp, BN can thiệp cách ly sớm, hạn chế nguy lan rộng dịch cộng đồng Vì vậy, để đạt mục tiêu đó, việc chẩn đốn nhanh xác betacoronavirus cần thiết Cho đến nay, quy trình chẩn đốn virut cúm nói chung H1N1, H5N1, H7N9 hướng đến việc khuếch đại phát gen đích, việc chẩn đốn betacoronavirus khơng nằm ngoại lệ Trung tâm Lưu trữ virut châu Hình 3: Khả phát ARN virut hòa lỗng ARN người 53 Âu tổ chức chuẩn hóa phương TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 pháp RT-PCR sử dụng đồng thời gen thể nhiễm MERS-CoV nào, thế, để kiểm đích upE open read-ing frame (ORF) 1b chứng phương pháp, cần nhiều gen làm đích phân tử [6] Hơn nữa, MERS- hợp tác với trung tâm ngoại CoV chủng virut bùng phát, nên kiểm có uy tín giới ngồi phương pháp Trung tâm Lưu trữ virut châu Âu đề xuất, quan kiểm dịch quan trọng khác giới Tổ chức Y tế Thế giới, Cơ quan Kiểm sốt bệnh Hoa Kỳ (CDC) chưa có khuyến cáo chi tiết phương pháp xét nghiệm cụ thể mức độ phân tử cho chủng virut độc Vì thế, Khoa Sinh học Phân tử, Bệnh viện TWQĐ 108 tiến hành hợp tác với EVA KẾT LUẬN Kỹ thuật RT-PCR với mồi SHPT108 @MERS-CoV-L, SHPT108@MERS-CoV-S có khả phát ARN coronavirrus mật độ copy virut/1.000 copy ARN tổng số người khỏe mạnh Kết thực nghiệm không tạo sản phẩm cADN phụ không bắt cặp chéo vào khu vực có tính tương đồng thấp hệ gen người Thông qua hợp tác này, đoạn ARN mã TÀI LIỆU THAM KHẢO hóa gen đích upE open reading frame Zaki AM et al Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia N Engl J Med 2012, 367 (19), pp.18141820 (ORF) 1b gen chuyển Việt Nam an toàn, từ chúng tơi thiết lập quy trình chẩn đoán betacoronavirus với độ nhạy kỹ thuật copy ARN virut/1.000 copy ARN người khỏe mạnh (chúng lặp lại ngưỡng 91/95 lần thử nghiệm) Đặc biệt, mẫu bệnh phẩm có nồng độ ARN MERS-CoV chí khơng có MERS-CoV SHPT108@MERS-CoV ARN mồi không khuyếch đại bất đặc hiệu đoạn gen người (từ 30 mẫu bệnh phẩm bạch cầu tủy mạn) đoạn gen ARN virut khác HCV (50 mẫu), H1N1 (15 mẫu) Điều thể tính đặc hiệu cao mồi SHPT108@MERS-CoV Tuy nhiên, đến Việt Nam chưa gặp trường hợp BN có 54 Van Boheemen S et al Genomic characterization of a newly discovered coronavirus associated with acute respiratory distress syndrome in humans MBio 2012, (6) Assiri A et al Hospital outbreak of Middle East respiratory syndrome coronavirus N Engl J Med 2013 Azhar EI et al Evidence for camel-tohuman transmission of MERS coronavirus N Engl J Med 2014 Hui DS, ZA Memish, A Zumla Severe acute respiratory syndrome vs the Middle East respiratory syndrome Curr Opin Pulm Med 2014 Palm D et al Laboratory capability for molecular detection and confirmation of novel coronavirus in Europe November 2012 Euro Surveill 2012, 17 (49)  ... vật, gây biến chứng không trầm trọng Tuy nhiên, bùng phát virut gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp SARS-CoV vào năm 2002 - 2003 HCoV-EMC/2012 vào năm 2012 cho thấy coronavirus thật có khả gây. .. với nghiên cứu khám phá không phù hợp với quy trình chẩn đốn bệnh thường quy, hội chứng viêm đường hô hấp virut cúm bao gồm virut SARS betacoronavirus thường có di n biến cấp, BN can thiệp cách... chủng virut 51 Mục tiêu nghiên cứu nhằm: Thiết lập phương pháp PCR phiên mã ngược phát virut gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp Trung Đông (MERS-CoV) VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu