Khảo sát các điều kiện tối ưu xây dựng quy trình tách và xác định đồng thời một số kháng sinh họ b - lactam bằng phương pháp điện di

Trong nghiên cứu, thiết lập điều kiện để tách các kháng sinh họ β – lactam bởi sắc ký điện di mao quản . Được thực hiện trên hệ thống điện di 1602A 3D của hãng Agilent, mao quản có lớp phủ silica với chiều dài 75,5cm. Sử dụng dung dịch đệm Natritetraborat 15mM với 75mM SDS, pH= 6,8: Amocillin; Ampicillin; Cloxacilin; Cephacilin; Oxacillin và Penicillin-G trong đó Ampicilin được tách ra ở 16 phút. Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp là ≤ 0,7 µg/ml cho mỗi kháng sinh. Rồi áp dụng phương pháp này để xác định trong mẫu dược phẩm với độ thu hồi từ 94,2- 105,8%.

Nguyễn Thị Ánh Tuyết Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 89(01/2): 295 – 299 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH HỌ β-LACTAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI Nguyễn Thị Ánh Tuyết1, Nguyễn Văn Ri2 Trường Đại học Y Dược – Đại học Thái Nguyên Đại học quốc gia Hà Nội TÓM TẮT Trong nghiên cứu, thiết lập điều kiện để tách kháng sinh họ β – lactam sắc ký điện di mao quản Được thực hệ thống điện di 1602A 3D hãng Agilent, mao quản có lớp phủ silica với chiều dài 75,5cm Sử dụng dung dịch đệm Natritetraborat 15mM với 75mM SDS, pH= 6,8: Amocillin; Ampicillin; Cloxacilin; Cephacilin; Oxacillin Penicillin-G Ampicilin tách 16 phút Giới hạn phát (LOD) phương pháp ≤ 0,7 µg/ml cho kháng sinh Rồi áp dụng phương pháp để xác định mẫu dược phẩm với độ thu hồi từ 94,2105,8% Từ khóa: Mao mạch phát giới hạn, phục hồi MỞ ĐẦU β- lactam dùng thuốc kháng khuẩn từ 80 năm mà nhóm quan trọng kháng sinh Mỗi loại kháng sinh lại có tác dụng định, hạn chế hay tiêu diệt mầm bệnh y học, chăn nuôi hay sản xuất[1] Tuy nhiên liều lượng để lại hậu lớn sức khỏe người, việc xác định hàm lượng kháng sinh cần thiết Bên cạnh kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao, điện di mao quản kỹ thuật đầy triển vọng để tách chất phân tích có mang điện tích trung tính ứng dụng nhiều lĩnh vực khác Trong năm gần phương pháp thu hút nhiều nhà khoa học ưu điểm bật kỹ thuật dể sử dụng, tính linh hoạt cao, tiết kiệm hóa chất khả tách tốt phương pháp cho độ tin cậy cao[2,3] Trong nghiên cứu này, công bố điều kiện tách xác định số kháng sinh họ β – lactam phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu mixen(dùng mao quản Highsensitip) PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp tách xác định β-Lactam sử dụng chất hoạt động bề mặt, sodium dodecyl sunfate- SDS làm pha tĩnh, mixen mang điện tích âm, gọi pha tĩnh giả Các mixen mang tính anion, pha chế dung dịch đệm, chứa mao quản hẹp silic, có đường kính 50 µm Áp vào hai đầu mao quản trường điện áp cao (10-30KV), dung dịch đệm di chuyển từ cực dương sang cực âm, mixen di chuyển phía cực âm có tốc độ khác với tốc độ dung dịch đệm Các mixen có chức hấp thu chất phân tích mức độ khác tùy thuộc vào tính tương tự độ phân cực mixen chất phân tích Hình Tách β-Lactam phương pháp MEKC* * 295 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễn Thị Ánh Tuyết Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ Nhờ phân bố khác nhau, β-Lactam di chuyển với tốc độ khác nhau, tách khỏi Điều kiện quan trọng giá trị pH, nồng độ đệm, điện di để phương pháp tách có hiệu cao THỰC NGHIỆM Thiết bị hóa chất - Máy điện di model 1602A hãng Agilent, HP3D, detector DAD, mao quản silica trần d=50µm, chiều dài 75.5 cm, hiệu dụng 70 cm - Axít Boric H3BO3, muối natri tetraborat Na2B4O7.10H2O, chất hoạt động bề mặt SDS, NaOH … hãng Merk Nước deion lọc qua giấy lọc 0.45µm hãng Millipore Các chất chuẩn: amoxicillin – AMO, ampicillin – AMP, penicillin G – PENG, oxacillin – OXA, cloxacillin – CLO, cephalexin – CEP, Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế cung cấp Nghiên cứu điều kiện tách β- Lactam phương pháp điện di Ảnh hưởng pH dung dịch đệm điện di đến khả tách β- Lactam Nghiên cứu này, ảnh hưởng pH dung dịch đệm điện di khảo sát với dung dịch điện di chứa chất kháng sinh nồng độ µg/ml, 15mM đệm Borat + 75mM SDS Mao quản đặt nhiệt độ 280C, điện áp phân cực 22kV Mẫu bơm áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 10s Các giá trị pH thay đổi 6,5; 6,8; 7,0; 7,2 Trong nghiên cứu này, cặp CEP-AMP có ∆t giảm dần theo chiều tăng pH, cặp OXACLO có ∆t thay đổi không đáng kể Sự thay đổi pH làm thay đổi lớp điện kép thành mao quản, làm ảnh hưởng đến điện di chất 89(01/2): 295 – 299 Như tăng pH dung dịch đệm, rút ngắn thời gian phân tích, nhiên khả tách giảm, nên phải chọn giá tri pH phù hợp Ở pH = 6,5 β- Lactam tách tốt có píc nhỏ dính vào píc PEN-G làm cho diện tích píc khơng xác nên chọn pH = 6,8 để tách β-Lactam nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đệm Chất điện ly pha động có vai trò quan trọng chất dẫn điện, tạo dòng điện di thẩm thấu Trong thực tế, người ta cố gắng chọn chất đệm pH đồng thời chất điện giải sắc ký điện di Chúng chọn Natritetraborat vừa chất đệm pH vừa chất điện giải Khảo sát nồng độ đệm gía trị 10mM; 15mM; 20 mM; 25mM với 75mM SDS, pH = 6,8 Thế điện di 22kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 250C Các chất kháng sinh nồng độ 1µg/ml Kết cho thấy tăng nồng độ đệm độ điện di hiệu dụng kháng sinh βLactam tăng, thời gian lưu chất tan tăng hiệu tách không tốt Theo dõi chênh lệch thời gian lưu (∆tR) cặp: CEP-AMP; PENG- OXA cho thấy quy luật biến đổi ∆tR theo nồng độ dung dịch đệm không giống (bảng 2) Nồng độ đệm 20mM, lực ion thấp hơn, giảm dòng điện di, tăng hấp phụ mẫu lên thành mao quản, tốc độ di chuyển chất tan nhanh hiệu tách kém, hai pic CEP AMP dính vào Chúng tơi chọn nồng độ 15mM đệm Borat điều kiện tối ưu Bảng Khảo sát ảnh hưởng pH đến thời gian di chuyển β-Lactam pH t0 7,2 6,253 Khoảng cách pic, ∆tR 7,0 6,960 Khoảng cách pic ,∆tR 6,8 7,368 Khoảng cách pic, ∆tR 6,5 7,594 Khoảng cách pic, ∆tR Thời gian di chuyển β-Lactam, phút AMO PENG OXA CLO 7,889 10,283 10,699 11,717 0,416 1,018 0,731 0,306 8,896 11,345 11,613 12,612 0,268 0,999 0,792 0,568 9,466 12,342 12,908 14,229 0,566 1,321 0,564 0,732 9,505 12,536 13,160 14,622 0,624 1,362 1,345 0,805 CEP 12,448 AMP 12,754 13,404 13,972 14,793 15,525 15,967 16,772 296 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễn Thị Ánh Tuyết Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ 89(01/2): 295 – 299 Bảng Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đệm tới thời gian lưu (phút) Nồng độ đệm t0 10 mM 6,958 ∆tR β-Lactam 15 mM 7,363 ∆tR β-Lactam 20 mM 7,403 ∆tR β-Lactam 25 mM 7,505 ∆tR β-Lactam AMO 8,896 9,375 9,576 10,012 Thời gian di chuyển β-Lactam, phút PENG OXA CLO 11,345 11,613 12,612 0,268 12,087 12,881 14,178 0,794 12,238 12,542 14,231 0,304 12,879 12,932 15,375 0,053 CEP 13,404 0,586 14,990 0,835 16,013 0,069 16,873 0,061 AMP 13,972 15,825 16,082 16,934 Hình Sắc đồ điện di kháng sinh họ β-lactam điều kiện tối ưu: pH = 6,8; 15 mM đệm borat, 75 mM SDS, 22 kV, nhiệt độ mao quản 250C, bơm mẫu 8s, nồng độ chất 2µg/ml Thứ tự chất: 1- AMO; 2- PENG; 3-OXA; 4-CLO; 5-CEP 6- AMP Khảo sát ảnh hưởng điện di điều kiện khác Khi tăng điện từ 18kV đến 25kV thời gian di chuyển β-Lactam giảm độ linh động điện di tỷ lệ thuận với Mặt khác cao, nhiệt sinh mao quản tăng, làm cho chênh lệch nhiệt độ thành mao quản lòng nó, dẫn đến độ nhớt chênh lệch nguyên nhân làm giảm hiệu tách Tại 18kV 20kV đạt hiệu tách tốt, thời gian lưu lớn (20,6 phút cho AMP), 25kV thời gian lưu ngắn hiệu tách hơn, pic CEP CLO dính chân vào Vì chúng tơi chọn 22kV phù hợp để tách β-Lactam Để có píc rõ ràng độ hấp thụ píc cao thời gian bơm mẫu cần 8s cho nồng độ từ 0,2- 15 µg/ml ,nồng độ SDS 75mM, nhiệt độ mao quản 250C Đánh giá phương pháp phân tích Tiến hành lập đường chuẩn chất kháng sinh β-lactam nồng độ khác nhau: với AMO, CEP, CLO nồng độ khảo sát từ 0,210µg/ml chất AMP, OXA PEN-G nồng độ khảo sát từ 0,3-10µg/ml Mỗi nồng độ đo lặp lại lần lấy kết trung bình Sử dụng origin 8.0 xử lý, kết thu trình bày bảng Để đánh giá độ xác phương pháp phân tích, chúng tơi tiến hành chọn mẫu tương ứng với điểm đầu, điểm điểm cuối khoảng tuyến tính 1µg/ml; 5µg/ml 10µg/ml Tiến hành đo mẫu với điều kiện tối ưu, mẫu đo lặp lại lần Kết cho thấy độ xác nằm giới hạn cho phép