Xây dựng quy trình ASO PCR xác định điểm đa hình RS2231142 trên ABCG2

Protein ABCG2 (ATP binding cassette sub-family G member 2) là một protein vận chuyển nằm trên màng tế bào thuộc đại gia đình protein vận chuyển phụ thuộc ATP. Protein ABCG2 được mã hóa bởi gen ABCG2 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 4, có vai trò vận chuyển các thuốc hóa trị ung thư, nhiều nhóm thuốc và hợp chất nhau (statin, cimetidine, flavonoid…).

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ASO PCR XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐA HÌNH rs2231142 TRÊN ABCG2 Mai Phương Thảo*, Lê Thị Kim Hồng** TĨM TẮT Đặt vấn đề: Protein ABCG2 (ATP binding cassette sub-family G member 2) protein vận chuyển nằm màng tế bào thuộc đại gia đình protein vận chuyển phụ thuộc ATP Protein ABCG2 mã hóa gen ABCG2 nằm nhánh dài nhiễm sắc thể số 4, có vai trò vận chuyển thuốc hóa trị ung thư, nhiều nhóm thuốc hợp chất (statin, cimetidine, flavonoid…) Các nghiên cứu gần đây, phát vai trò vận chuyển tiết acid uric thận, gan, ruột não protein ABCG2 Gen ABCG2 có tính đa hình tương đối cao, r2231142 (Q141K, 421.C>A) điểm đa hình nghiên cứu nhiều có ý nghĩa quan trọng chuyển hóa thuốc acid uric Biến thể Q141K vừa làm giảm biểu protein ABCG2 vừa làm giảm hoạt động vận chuyển phụ thuộc ATP protein Việc xác định biến thể rs2231142 gen ABCG2 có ý nghĩa quan trọng dược động học, chuyển hóa đào thải loại thuốc chuyển hóa acid uric Có nhiều phương pháp để phát vị trí đột biến gen giải trình tự, ASO-PCR, RFLP PCR… đó, giải trình tự chuỗi DNA tiêu chuẩn vàng Tuy nhiên phương pháp có điểm hạn chế chi phí cao thời gian trả kết chậm Để khắc phục nhược điểm phương pháp giải trình tự DNA, yêu cầu đặt cần có phương pháp phát biến thể rs2231142 gen ABCG2 chi phí thấp hơn, thời gian trả kết nhanh đảm bảo độ xác Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình ASO PCR xác định điểm đa hình rs2231142 gen ABCG2 Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Phân tích mẫu máu ngoại vi bệnh nhân chẩn đoán Parkinson đến khám Phòng khám Thần kinh, Bệnh viện Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh Tiến hành tách chiết DNA, sử dụng kỹ thuật ASO-PCR xác định điểm đa hình, so sánh với kết giải trình tự Sanger Kết quả: Chúng xác định trình tự cặp mồi phản ứng ASO PCR nhận diện đặc hiệu nucleotide A vị trí 421 với độ nhạy đặc hiệu 100%, đồng thời thiết lập thành công điều kiện phản ứng tối ưu phản ứng ASO PCR xác định điểm đa hình rs2231142 (Q141K) gen ABCG2 Kết luận: Việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng ASO PCR xác định điểm đa hình gen cho phép phân tích gen nhanh chóng, tiết kiệm thời gian chi phí đảm bảo độ nhạy độ đặc hiệu cao Từ khóa: Bệnh Parkinson, biến thể ABCG2 (rs2231142), uric acid, ASO-PCR, giải trình tự Sanger ABSTRACT APPLICATION OF ASO-PCR FOR DETECTING SINGLE-NUCLEOTIDE POLYMORPHISM IN ABCG2 (rs2231142) Mai Phuong Thao, Le Thi Kim Hoang * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 2- 2018: 218 - 224 Introduction: ABCG2 belongs to ATP binding cassette sub-family G member 2, which is encoded by on chromosome and related to drugs-resistance and exporter Recent studies showed the function of ABCG2 in the transportation and excretion of urate in renal, liver, colon and brain rs2231142 is a common variant of ABCG2 in which glutamine at codon 141 is mutated to lysine (Q141K) The resultant missense polymorphism at codon 141 (Q141K) has been shown to be a loss-of-function mutation The detection of ABCG2 variant (rs2231142) plays an important role in evaluating the metabolism of different drugs and even uric acid There are various * Khoa Xét nghiệm, BV đa khoa Đồng Tháp, Tác giả liên lạc: TS Mai Phương Thảo 224 **Bộ môn Sinh lý học, Đại Học Y Dược TP.HCM ĐT: 0918329999 Email:maithao292@gmail.com Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học methods in detecting single-point mutation, such as gene sequencing, ASO-PCR, RFLP PCR…., the most valuable standard among of which is gene sequencing However, this technique is time-consuming and high cost From this issue, it is necessary to find out a method which allows the result faster, low-cost, sensitive and specific Objectives: Establish ASO-PCR procedure to analyze the single-nucleotide polymorphism rs2231142 (Q141K) of ABCG2 Materials and Methods: DNA was extracted from mL of peripheral blood sample of 30 Parkinson patients in the Department of Neurology, University Medical Center These DNA were respectively applied to ASO-PCR, and then compared to Sanger sequencing results Results: We identified specific primers of ASO-PCR that allows the detection of rs2231142 (Q141K) Conclusion: The application of ASO- PCR method to analyze ABCG2 polymorphism rs2231142 gives the result less time-consuming, low-cost, highly sensitive and specific Keywords: Parkinson’s Disease, ABCG2 variant (rs2231142), uric acid, ASO-PCR, Sanger sequencing acid uric có chức bảo vệ bệnh lý ĐẶT VẤN ĐỀ Parkinson, mở hướng nghiên cứu nhằm làm Protein ABCG2 (ATP binding cassette subrõ chế sinh bệnh yếu tố liên family G member 2) protein vận chuyển quan đến nồng độ acid uric máu bệnh nằm màng tế bào thuộc đại gia đình protein Parkinson Các cơng trình nghiên cứu phát vận chuyển phụ thuộc ATP, phát lần người mang biến thể rs2231142 đầu vào năm 1998 với vai trò vận chuyển gen ABCG2 có nồng độ acid uric thuốc hóa trị ung thư mitoxantrone, máu cao dẫn đến nguy mắc bệnh gout cao doxorubicin, daunorubicin… khỏi tế bào lại giảm nguy mắc bệnh ung thư vú MCF-7/AdrVp dẫn đến tình trạng Parkinson so với người không mang biến kháng thuốc tế bào Vì vậy, thời thể điểm phát hiện, chúng đặt tên Việc xác định biến thể rs2231142 gen protein đề kháng ung thư vú (BCRP: breast ABCG2 có ý nghĩa quan trọng dược động cancer resistance protein)(1) Các nghiên cứu gần học, chuyển hóa đào thải loại thuốc phát vai trò protein ABCG2 chuyển hóa acid uric Cho đến nay, có vận chuyển tiết acid uric thận, gan, ruột nhiều phương pháp để phát biến thể, não đó, giải trình tự chuỗi DNA tiêu chuẩn Gen ABCG2 mã hóa protein nằm nhánh vàng Tuy nhiên phương pháp có nhiều dài nhiễm sắc thể số có tính đa hình tương đối điểm hạn chế chi phí cao, tốn thời gian cao với 80 điểm đa hình nucleotide đơn, trả kết chậm Để khắc phục nhược điểm đó, rs2231142 (Q141K) điểm đa hình phương pháp giải trình tự DNA, nghiên cứu nhiều có ảnh hưởng u cầu đặt cần có phương pháp phát đến chuyển hóa thuốc acid uric thể biến thể rs2231142 gen ABCG2 chi phí thấp Biến thể Q141K vừa làm giảm biểu protein hơn, thời gian trả kết nhanh ABCG2 vừa làm giảm hoạt động vận chuyển đảm bảo độ xác Trong nghiên cứu này, phụ thuộc ATP protein Người mang áp dụng kỹ thuật ASO-PCR (Allele biến thể rs2231142 có nồng độ acid uric máu cao Specific Oligonucleotide Polymerase) xác định có nguy mắc bệnh gout cao 53% oligonucleotide đặc trưng alen, dựa ngun so với nhóm khơng mang biến thể(3) Ngồi vai tắc phản ứng khuếch đại gen sử dụng cặp mồi trò quan trọng bệnh gout yếu tố đặc hiệu nhận diện vị trí đột biến Sau sản liên quan đến bệnh lý tim mạch chuyển hóa, Chuyên Đề Nội Khoa 225 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 phẩm khuếch đại đem điện di xác định kiểu gen dựa sản phẩm điện di quan sát soi gel GelDoc-It TS 310 (UVP, Mỹ) ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Phân tích kết điện di sản phẩm ASO PCR Mồi WT nhận diện alen C, cặp mồi đột biến nhận diện alen A với cách thiết kế khác nhau, kết hợp hai alen từ mồi WT đột biến cho kiểu gen mẫu DNA Nếu mồi đột biến cho sản phẩm điện di có kiểu gen giống với kết giải trình tự mồi xem đặc hiệu Đối tượng nghiên cứu Mẫu DNA từ máu ngoại vi bệnh nhân Parkinson đến khám Phòng khám Thần kinh Bệnh viện Đại học Y Dược TPHCM Phương pháp nghiên cứu Tách chiết genomic DNA từ máu ngoại vi Quy trình tách chiết DNA từ 200 µl máu ngoại vi tiến hành theo hướng dẫn sử dụng kit DNA Blood SV mini (GeneAll® Exgene™) DNA tiến hành đo nồng độ độ tinh sạch, mẫu sử dụng phải có tỷ lệ mật độ quang đo bước sóng 260/280 đạt ≥ 1,8 Thiết kế mồi Cặp mồi sử dụng đề khuếch đại giải trình tự exon nhận diện nucleotide vị trí 421 gen ABCG2 thiết kế đặc hiệu dựa trình tự chuẩn NG_032067.2 GenBank Thiết lập điều kiện cho PCR khuếch đại tương ứng với cặp mồi 25 l phản ứng với thành phần phản ứng chu trình luân nhiệt theo hướng dẫn nhà sản xuất (Hot Start Taq Polymerase, Takara) Kiểm tra sản phẩm PCR điện di Kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel agarose 2% có nhuộm ethium bromide KẾT QUẢ Thiết kế mồi phản ứng ASO-PCR nhận diện điểm đa hình rs2241142 gen ABCG2 Để thiết kế mồi cho phản ứng ASO PCR thiết kế mồi thủ công kiểm tra mồi dựa vào phần mềm Oligo Analyzer 3.1(IDT) (sg.idtdna.com/calc/analyzer) Chọn vùng trình tự để thiết kế mồi tính từ vị trí đột biến lên phía khoảng 18 đến 25 nucleotide Tất cặp mồi có chung mồi ngược mồi phản ứng PCR khuếch đại Cặp mồi (mồi WT): mồi xuôi nhận diện nucleotide không đột biến; Cặp mồi (mồi F2.1): mồi xi nhận diện vị trí đột biến; Cặp mồi (mồi F2.2): mồi xuôi vừa nhận diện vị trí đột biến vừa gây sai lệch thêm vị trí đột biến kế bên vị trí SNP; Cặp mồi (mồi F2.3): mồi xi vừa nhận diện vị trí đột biến vừa gây sai lệch thêm vị trí đột biến cách hai nucleotide so với vị trí SNP; Cặp mồi (mồi F2.4): mồi xi vừa nhận diện vị trí đột biến vừa gây sai lệch thêm vị trí đột biến cách ba nucleotide so với vị trí SNP Bảng Trình tự mồi dùng cho phản ứng PCR-giải trình tự ASO PCR (F:mồi xi, R: mồi ngược, WT: mồi nhận diện nucleotide C vị trí 421) Ký hiệu Mồi phản ứng PCR khuếch đại exon Mồi phản ứng ASO PCR 226 F R WT F2.1 F2.2 F2.3 F2.4 Trình tự mồi (5’- 3’) GCAGGTTCATCATTAGCTAG CAGGGAAAGTCCTACTTATG GACGGTGAGAGAAAACTTAC GACGGTGAGAGAAAACTTAA GACGGTGAGAGAAAACTTCA GACGGTGAGAGAAAACTGAA GACGGTGAGAGAAAACCTAA Kích thước (bp) Sản phẩm PCR (bp) Ghi 20 339 20 Tất phản ứng 20 183 Cặp mồi 20 183 Cặp mồi 20 183 Cặp mồi 20 183 Cặp mồi 20 183 Cặp mồi Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 PCR khuếch đại giải trình tự Sanger Sản phẩm khuếch đại exon gen ABCG2 kiểm tra điện di cho băng sản phẩm Nghiên cứu Y học kích thước ước đốn Giải trình tự Sanger cho phép xác định trình tự nucleotide vị trí 421 (Hình 1) Hình Kết điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại exon (trái) giải trình tự Sanger xác định kiểu gen CC, CA, AA (phải) A không xuất băng mẫu DNA có kiểu Phân tích kiểu gen dựa kết điện di sản gen CC Mồi wide-type nhận diện C xuất phẩm phản ứng ASO-PCR băng, mồi nhận diện A có xuất băng Mỗi phản ứng ASO PCR thực mẫu DNA có kiểu gen CA Mồi wide-type với hai cặp mồi, cặp mồi nhận diện vị trí nhận diện C khơng xuất băng nên C cặp mồi nhận diện vị trí A Mồi widenucleotide C đột biến thành A, mồi nhận diện type nhận diện C xuất băng, mồi nhận diện Chuyên Đề Nội Khoa 227 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 A có băng sản phẩm điện di alen A, nên có kiểu gen AA (Hình 2) Hình Phân tích kết điện di sản phẩm ASOPCR xác định kiểu gen CC, AA CA So sánh kết ASO-PCR với giải trình tự Sanger xác định cặp mồi đặc hiệu nhận diện điểm đa hình rs2231142 Mồi wild-type nhận diện C tất 30 mẫu DNA phương pháp ASO PCR Bốn cặp mồi nhận diện vị trí đột biến có hai cặp mồi F2.3 F2.4 cho kết nhận diện giống nhau, cặp mồi F2.2 nhận diện không giống hai cặp mồi F2.3 F2.4 tất mười vị trí, cặp mồi F2.1 nhận diện khơng giống vị trí Trong cặp mồi nhận diện vị trí đột biến, tất bốn cặp mồi có độ đặc hiệu 100%; hai cặp mồi F2.3 F2.4 nhận diện vị trí A có độ nhạy 100%, cặp mồi F2.1 có độ nhạy 93,75% cặp mồi F2.2 có độ nhạy 60% (Bảng 2) BÀN LUẬN Trong năm gần đây, có nhiều phương pháp phân tích biến thể nucleotide khác RFLP, AFLP, giải trình tự gen tiêu chuẩn vàng mô tả Mặc dù phương pháp cho hiệu cao so với phân tích kiểu gen truyền thống khác điện di, việc trang bị nhiều thiết bị đặc biệt đắt tiền, thời gian trả kết chậm… hạn chế việc sử dụng 228 phương pháp phòng thí nghiệm Phương pháp ASO PCR đặc hiệu phát triển để phân tích alen đột biến có ý nghĩa lâm sàng Chúng tơi tiến hành nghiên cứu phương pháp ASO PCR bệnh nhân Parkinson nhằm khuếch đại exon gen ABCG2 tìm alen A mẫu phân tích, so sánh với kết giải trình tự Đối với phản ứng ASO PCR, quan trọng thiết kế mồi đặc hiệu để nhận diện điểm đa hình Trong nghiên cứu này, điểm đa hình mà chúng tơi muốn xác định rs2231142 gen ABCG2 nghĩa phát đột biến làm thay đổi nucleotide C thành A vị trí nucleotide 421 exon gen ABCG2 nên tiến hành thiết kế mồi nhận diện nucleotide C có trình tự nucleotide bình thường mồi nhận diện nucleotide bị biến đổi C thành A Có nhiều cách thiết kế khác để nhận diện nucleotide bị biến đổi C thành A Thông thường, thiết kế ngồi vị trí đột biến cần nhận diện cần gây thêm vị trí đột biến khác tùy vị trí gây thêm mà xác định cặp mồi đặc hiệu Trong nghiên cứu này, thiết kế cặp mồi nhận diện nucleotide bị biến đổi C thành A với vị trí thêm vào đột biến khác Trong nghiên cứu này, ghi nhận thiết kế mồi nhận diện vị trí đột biến cần gây thêm vị trí đột biến khác cách nucleotide kể từ vị trí đột biến cần nhận diện đặc hiệu Kết chúng tơi hồn tồn phù hợp với kết tác giả Jing Liu cộng (2012) việc gây thêm vị trí đột biến nucleotide thứ từ đầu 3’, có độ đặc hiệu alen cao (81,9%)(2) Tuy nhiên, tác giả Jing Liu cộng áp dụng kỹ thuật ASO PCR đối tượng khác với Từ kết so sánh độ nhạy độ đặc hiệu mồi với giải trình tự kỹ thuật Sanger, chúng tơi nhận thấy giải trình tự tiêu chuẩn vàng có nhược điểm nhiều thời gian qua nhiều giai đoạn dẫn đến chi phí cao thời gian trả kết chậm 02 ngày kỹ thuật ASO PCR rút ngắn thời Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 gian trả kết nên hạn chế nhược điểm qui trình phức tạp đòi hỏi chun mơn cao tốn nhiều thời gian giải trình tự kỹ thuật Sanger ASO PCR tốn tối đa khoảng - Nghiên cứu Y học kết với quy trình đơn giản, dễ tiến hành giải trình tự kỹ thuật Sanger (Hình 3) Bảng Kết so sánh độ nhạy độ đặc hiệu bốn cặp mồi sử dụng phản ứng ASO-PCR Chuyên Đề Nội Khoa 229 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Hình Thời gian tiến hành thực phản ứng ASO PCR (5 giờ) pháp PCR giải trình gen kỹ thuật Sanger Kỹ thuật ASO PCR tương đối sau: chưa áp dụng rộng rãi giới Việt Nam Trên giới có nhiều cơng trình nghiên cứu gen ABCG2 đa số nghiên cứu mối liên quan gen ABCG2 bệnh lý, nhiên kỹ thuật phát đột biến sử dụng kỹ thuật khác Hiện chưa ghi nhận trường hợp phát biến thể Q141K kỹ thuật ASO PCR giới Việt Nam nên chúng tơi chưa có liệu để so sánh kết với tác giả khác KẾT LUẬN Qua kết nghiên cứu xác định hai cặp mồi nhận diện nucleotide A vị trí 421 gen ABCG2 với độ nhạy độ đặc hiệu 100% giá trị chẩn đoán âm 100%, cho kết hoàn toàn trùng hợp với phương 230 Mồi xuôi: GACGGTGAGAGAAAACTGAA GACGGTGAGAGAAAACCTAA Mồi ngược: CAGGGAAAGTCCTACTTATG TÀI LIỆU THAM KHẢO Doyle LA, et al (1998), "A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells" Proc Natl Acad Sci U S A, 95 (26),pp.15665-70 Jing L, et al (2012), "An improved allele-specific PCR primer design method for SNP marker analysis and its application" Plant Methods, (1),pp.1 Woodward OM, Köttgen A, Coresh J, Boerwinkle E, Guggino WB, Köttgen M (2009), "Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout" Proceedings of the National Academy of Sciences, 106 (25),pp.10338-10342 Ngày nhận báo: 16/11/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 17/11/2017 Ngày báo đăng: 15/03/2018 Chuyên Đề Nội Khoa ... kiểu gen AA (Hình 2) Hình Phân tích kết điện di sản phẩm ASOPCR xác định kiểu gen CC, AA CA So sánh kết ASO- PCR với giải trình tự Sanger xác định cặp mồi đặc hiệu nhận diện điểm đa hình rs2231142. .. với kết giải trình tự Đối với phản ứng ASO PCR, quan trọng thiết kế mồi đặc hiệu để nhận diện điểm đa hình Trong nghiên cứu này, điểm đa hình mà chúng tơi muốn xác định rs2231142 gen ABCG2 nghĩa... tính đa hình tương đối điểm hạn chế chi phí cao, tốn thời gian cao với 80 điểm đa hình nucleotide đơn, trả kết chậm Để khắc phục nhược điểm đó, rs2231142 (Q141K) điểm đa hình phương pháp giải trình