XÂY DỰNG QUY TRÌNH REALTIME PCR ĐỊNH LƯỢNG SỐ BẢN SAO GEN SMN1 GÂY BỆNH TEO CƠ TỦY SỐNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG SỐ BẢN SAO GEN SMN1 GÂY BỆNH TEO CƠ TỦY SỐNG Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ LI NA Niên khóa: 2006-2010 Tháng 07 năm 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG SỐ BẢN SAO GEN SMN1 GÂY BỆNH TEO CƠ TỦY SỐNG Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực Ths NGUYỄN THỤY DẠ THẢO NGUYỄN THỊ LI NA CN NGUYỄN VĂN HƯNG Tháng 07 năm 2010 LỜI CẢM ƠN Với tất lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Cơng nghệ sinh học, tất quý Thầy Cô truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học trường Em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến BGĐ Công ty Cổ Phần Công Nghệ Việt Á cho phép tạo điều kiện tốt cho em học tập, nghiên cứu hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thụy Dạ Thảo, CN Nguyễn Văn Hưng, chị Hồ Thị Thanh Thủy người hết lòng hướng dẫn, dạy dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn anh chị công ty Cổ Phần Công Nghệ Việt Á nhiệt tình giúp đỡ hỗ trợ nhiều điều cho em suốt thời gian thực khố luận Tơi xin cảm ơn bạn lớp DH06SH chia vui buồn thời gian học Với tất lòng kính trọng thương yêu cảm ơn cha mẹ em chăm sóc, động viên suốt năm tháng qua Sinh viên thực Nguyễn Thị Li Na i   TĨM TẮT “XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG BẢN SAO GEN SMN1 GÂY BỆNH TEO CƠ TỦY SỐNG” Teo tủy sống bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường có tần suất cao thứ hai giới, bệnh gây chết để lại di chứng ảnh hưởng nặng nề đến khả vận động bệnh nhân Bệnh chẩn đoán dựa triệu chứng lâm sàng, nhiên gây nhầm lẫn nhầm lẫn với triệu chứng bệnh teo khác Chính phương pháp chẩn đoán phân tử tỏ phương pháp hiệu Hơn nữa, xác định bệnh, phương pháp sinh học phân tử xác định thể mang, giúp đưa tư vấn cần thiết cho người có nhu cầu Trong khóa luận chúng tơi tiến hành xây dựng quy trình Real-time PCR định lượng số lượng gen SMN1 thu kết sau: Bước đầu xây dựng thành công quy trình Real-time PCR để định lượng gen SMN1 với hệ mồi mẫu dò có khả hoạt động tốt Xác định nhiệt độ lai thích hợp mà hệ mồi mẫu dò hoạt động tốt cho kết đặc hiệu 66 Xác định độ nhạy quy trình 102 Xây dựng cách tính gen SMN1 theo phương pháp ∆∆Ct Livak, 2001 Tiến hành chạy thực nghiệm quy trình xây dựng mẫu DNA genomecủa bệnh nhân teo tủy sống (SMA), mẫu DNA genome đại trà Đối với mẫu DNA genome bệnh nhân SMA, kết Real-time PCR khẳng định trường hợp đột biến đồng hợp tử gen SMN1 Đối với 23 mẫu DNA genome đại trà kết Real-time PCR cho biết trường hợp thể mang ii   SUMMARY “CONSTRUCTING REAL-TIME PCR PROCESS TO QUANTIFY THE SMN1 COPY NUMBER CAUSE SPINAL MUSCULAR ATROPHY” Spinal Muscular Atrophy is an autosomal recessive disease which has the 2nd frequency in the world; this disease can cause deaths or leave serious damages to the movement ability of the patients This disease can be diagnosed by clinical features, but it may cause confusion with the symptons of others atrophy diseases Because of this reason, nowadays, molecular diagnosis methods seem to be the most effective Moreover, molecular methods can not only diagnose the disease but also determine the carrier status in order to give out counsels for needed people In this research, we constructed Rel-time PCR process to quantify the SMN1 gene copy number and received the following results: Constructing successfully Real-time PCR process to quantify the copy number of SMN1 gene with workable set of primers and probes Determining that 66°C is the proper annealing temperature in which the set of primers and probes work well and has high specification Determining that the sensitivity of the process is 102 Construting the formulating method to quantify the copy number of SMN1 gene by ∆∆Ct method (Livak, 2001) Practical implementing the process on the DNA genome samples of SMA patients and normal individuals The results confirm that DNA genome samples of SMA patients are homozygous deletion of SMN1 gene of 23 DNA samples of normal people are determined carrier Keys words: Spinal Muscular Atrophy, SMN1 gene, Real-time PCR iii   MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu bệnh teo tủy sống 2.1.1 Teo tủy sống type I (SMA I) 2.1.2 Teo tủy sống type II (SMA II) 2.1.3 Teo tủy sống type III (SMA III) 2.1.4 Teo tủy sống type IV (SMA IV) 2.2 Gene SMN: Nguyên nhân gây bệnh teo tủy sống 2.2.1 Gene Survival motor neuron (SMN) 2.2.1.1 Vị trí cấu trúc gen SMN .3 2.2.1.2 Quá trình ghép nối gene SMN 2.2.1.3 Chức gen SMN vai trò protien SMN bệnh teo tủy sống 2.2.2 Đột biến gen SMN1: nguyên nhân gây bệnh teo tủy sống 2.2.2.1 Đột biến lớn (đột biến đột biến hoán chuyển) 2.2.2.2 Đột biến nhỏ .7 2.2.2.3 Đột biến de novo 2.3 Kiểu gen bệnh nhân teo tủy sống thể mang 2.3.1 Kiểu gen bệnh nhân teo tủy sống iv   2.3.2 Kiểu gen thể mang SMA 2.4 Chẩn đoán SMA 2.4.1 Chẩn đoán lâm sàng 2.4.2 Chẩn đốn sử dụng cơng cụ sinh học phân tử 10 2.4.2.1 Phương pháp phân tích liên kết (linkage analysis) 10 2.4.2.2 Phương pháp PCR-SSCP 11 2.4.2.3 Phương pháp PCR-RFLP (SMN1 deletion assay) 11 2.4.2.4 Phương pháp Realtime-PCR 12 2.4.2.5 Phương pháp MLPA 13 2.4.2.6 Phương pháp DHPLC 13 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 14 3.2 Vật liệu thiết bị 14 3.2.1 Mẫu 14 3.2.2 Hóa chất 14 3.2.2.1 Hóa chất dùng tách chiết DNA .14 3.2.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng Realtime-PCR 14 3.2.3 Dụng cụ thiết bị 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu 15 3.3.1 Phương pháp thiết kế mồi, mẫu dò 15 3.3.1.1 Các phần mềm sử dụng 15 3.3.1.2 Tiêu chuẩn thiết kế mồi 15 3.3.1.3 Tiêu chuẩn thiết kế mẫu dò 16 3.3.1.4 Phương pháp tiến hành .16 3.3.2 Phương pháp tách chiết DNA 16 3.3.2.1 Nguyên tắc 16 3.3.2.2 Phương pháp tiến hành .17 3.3.3 Phương pháp allele specific realtime-PCR 17 3.3.4 Khảo sát hoạt động mồi mẫu dò 18 3.3.4.1 Nguyên tắc 18 3.3.4.2 Phương pháp tiến hành .18 v   3.3.5 Khảo sát độ đặc hiệu kết hợp khảo sát Tm thích hợp cho mồi mẫu dò 19 3.3.6 Khảo sát độ nhạy quy trình 19 3.3.7 Phương pháp tính tốn kết 20 3.3.7.1 Nguyên tắc 20 3.3.7.2 Phương pháp tiến hành .20 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Kết thiết kế mồi mẫu dò cho gene SMN1 gene ß-actin 21 4.2 Kết khảo sát đặc tính hệ mồi mẫu dò lý thuyết 22 4.2.1 Kết khảo sát tiêu mồi mẫu dò 22 4.2.2 Các tiêu cấu trúc thứ cấp 23 4.2.3 Kết kiểm tra độ tương đồng hệ mồi mẫu dò với trình tự đích 24 4.2.4 Kiểm tra độ đặc hiệu hệ mồi mẫu dò lý thuyết 25 4.3 Khảo sát hoạt động mồi mẫu dò 30 4.3.1 Khảo sát hoạt động mồi mẫu dò phản ứng singleplex 30 4.3.1.1 Khảo sát hoạt động mồi mẫu dò gene ß-actin .30 4.3.1.2 Khảo sát hoạt động mồi mẫu dò gen SMN1 31 4.3.2 Khảo sát hoạt động mồi mẫu dò phản ứng multiplex 32 4.4 Khảo sát nhiệt độ lai độ đặc hiệu 33 4.5 Kết khảo sát độ nhạy quy trình 35 4.5.1 Kết khảo sát độ nhạy gen ß-actin 35 4.5.2 Kết khảo sát độ nhạy gen SMN1 36 4.6 Kết xây dựng cách tính số lượng gen SMN1 36 4.7 Tiến hành chạy thực nghiệm với quy trình xây dựng mẫu đại trà 39 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Đề nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 vi   DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AS PCR: Allele Specific Polymerase Chain Reaction ASF/SF2: alternative splicing factor/splicing factor Ct: chu kỳ ngưỡng DHPLC: Denaturing High-performance Liquid Chromatography EMG: Electromyography testing ESE: Exonic Splicing Enhancer ESS: Exonic Splicing Silencer hnRNPs: heterogeneous nuclear ribonucleoproteins ISSs: Intronic Slicing Silencers MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification PCR-SSCP: Polymerase Chain Reaction / Single-Strand Conformation Polymorphism PCR-RFLP: Polymerase Chain Reaction / Restriction Fragment Length Polymorphism SMA: Spinal Muscular Atrophy SMN: Survival motor neuron SMN1: Survival motor neuron SMN2: Survival motor neuron snRNP: uridine-rich small nuclear ribonucleoprotein particle vii   DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1 Trình tự hệ mồi mẫu dò sử dụng 21  Bảng 4.2 Kết kiểm tra đặc tính mồi mẫu dò 22  Bảng 4.3 Kết số thứ cấp 23  Bảng 4.4 Kết chạy phản ứng Real-time đơn cho gen ß-actin 31  Bảng 4.5 Kết chạy Real-time PCR đơn cho gen SMN1 31  Bảng 4.6 Kết chạy phản ứng Real-time PCR multiplex 32  Bảng 4.7 Kết khảo sát nhiệt độ lai độ đặc hiệu gen SMN1 34  Bảng 4.8 Kết khảo sát nhiệt độ lai gen ß-actin 35  Bảng 4.9 Kết khảo sát độ nhạy gen ß-actin 35  Bảng 4.10 Kết khảo sát độ nhạy gen SMN1 36  Bảng 4.11 Kết phản ứng Real-time PCR mẫu chứng 38  Bảng 4.12 Kết phản ứng Real-time PCR mẫu thực nghiệm 39  viii   ứng, hoạt động mồi mẫu dò đặt hoạt động tốt, chúng tơi tiếp tục sử dụng mồi mẫu dò gen ß-actin cho phản ứng sau Bảng 4.4 Kết chạy phản ứng Real-time đơn cho gen ß-actin Chu kì ngưỡng Gen ß-actin 26,76 Chứng âm (-) ß-actin Chứng âm Hình 4.9 Kết chạy Real-time đơn cho gen ß-actin 4.3.1.2 Khảo sát hoạt động mồi mẫu dò gen SMN1 Tiến hành thực phản ứng Real-time PCR mẫu genome người bình thường có hai gen SMN1 Kết khảo sát cho thấy chu kì ngưỡng gen SMN1 29,93, chứng âm cho kết âm tính chứng tỏ khơng xảy tạp nhiễm trình thực phản ứng, hoạt động mồi mẫu dò đặt hoạt động tốt Bảng 4.5 Kết chạy Real-time PCR đơn cho gen SMN1 Chu kì ngưỡng Gen SMN1 29,93 Chứng âm (-) 31   gen SMN1 Chứng âm Hình 4.10 Kết chạy Real-time PCR đơn cho gen SMN1 4.3.2 Khảo sát hoạt động mồi mẫu dò phản ứng multiplex Tiếp theo thực phản ứng Multiplex Real-time PCR mẫu genome người bình thường người có hai gen SMN1, gen ßactin với tỉ lệ mồi mẫu dò hai gen 1:1 Phản ứng chạy đồng thời với hai phản đơn để làm đối chứng Kết khảo sát trình bày bảng sau: Bảng 4.6 Kết chạy phản ứng Real-time PCR multiplex Ct phản ứng đơn Ct phản ứng multiplex Gen SMN1 25 26.67 Gen ß-actin 27,88 29.67 Chứng âm gen SMN1 (-) (-) Chứng âm gen ß-actin (-) (-) Gen ß-actin Gen SMN1 Chứng âm Hình 4.11 Kết chạy multiplex Real-time PCR 32   Theo kết cho thấy chứng âm cho kết âm tính chứng tỏ khơng xảy tạp nhiễm q trình thực phản ứng Cả gen ß-actin SMN1 cho kết dương tính cho thấy mồi mẫu dò hai gen hoạt động tốt, so sánh chu kì ngưỡng gen phản ứng multiplex singleplex cho thấy khơng có khác biệt đáng kể, khơng có ức chế mồi mẫu dò hai gen Kết luận: quy trình multiplex Real-time PCR định lượng gen SMN1, sử dụng gen tham chiếu ß-actin với tỉ lệ mồi mẫu dò hai gen 1:1 cho kết mức chấp nhận Khơng có khác biệt đáng kể khả hoạt động hai hệ mồi mẫu dò phản ứng singleplex phản ứng multiplex 4.4 Khảo sát nhiệt độ lai độ đặc hiệu Tiến hành khảo sát nhiệt độ lai độ đặc hiệu theo phương pháp trình bày phần vật liệu phương pháp Tiến hành phản ứng Real-time PCR hai mẫu DNA chứng cung cấp giáo sư Renata Lonigro, đại học Udine, Italia, mẫu DNA genome có khơng gen SMN1 có hai gen SMN2 mẫu DNA genome có khơng gen SMN2 có hai gen SMN1, phản ứng chạy theo gradient nhiệt từ 60 - 70°C, tỉ lệ mồi mẫu dò loại gen 1:1 thu kết sau: Theo kết cho thấy từ nhiệt độ 60 – 63,9°C tất giếng cho kết dương tính, hệ mồi mẫu dò hoạt động tốt nhiệt độ này, nhiên trường hợp mồi khơng khuếch đại đặc hiệu mẫu có gen SMN2 cho kết âm tính Ở nhiệt độ từ 68,3 - 70°C tất giếng cho kết âm tính, chứng tỏ nhiệt độ hệ mồi mẫu dò khơng khả hoạt động điều kiện nhiệt độ khắc nghiệt Ở nhiệt độ từ 66,4 – 68,3°C giếng chứa mẫu có gen SMN2 có kết âm, kết dương tính thu giếng chứa mẫu có gen SMN1 Vậy khoảng nhiệt độ từ 66,4 – 68,3°C hệ mồi mẫu dò hoạt động tốt cho kết đặc hiệu Với kết thu chọn nhiệt độ lai cho hệ mồi mẫu dò 66,4°C, nhiệt độ hệ mồi mẫu dò hoạt động tốt, chuyên biệt cho tín hiệu phát chu kỳ ngưỡng thấp (Ct = 26,7) so với nhiệt độ 68,3°C (Ct = 33,1) 33   Bảng 4.7 Kết khảo sát nhiệt độ lai độ đặc hiệu gen SMN1 Giếng Tên Ct Nhiệt độ A02 SMN2 (-) 70,0 A04 SMN1 (-) 70,0 B02 SMN2 (-) 69,5 B04 SMN1 (-) 69,5 C02 SMN2 (-) 68,3 C04 SMN1` 33,1 68,3 D02 SMN2 (-) 68,3 D04 SMN1 26,7 66,4 E02 SMN2 34,8 63,9 E04 SMN1 25,8 63,9 F02 SMN2 34,8 62,1 F04 SMN1 25,8 62,1 G02 SMN2 35,2 60,8 G04 SMN1 26,2 60,8 H02 SMN2 35,1 60,0 H04 SMN1 26,4 60,0 H03 Chứng âm (-) 60,0 Tiến hành khảo sát đồng thời nhiệt độ lai cho hệ mồi mẫu dò ß-actin, thực phản ứng Real-time PCR mẫu DNA genome người bình thường sử dụng hệ mồi mẫu dò ß-actin, chạy gradient nhiệt từ 60 - 70°C Trong đó, từ giếng A02H02 giếng chứa mẫu, giếng H03 giếng chứng âm Kết trình bày bảng 4.8 Nhận xét: Tất giếng ngoại trừ chứng âm cho kết dương tính, hệ mồi mẫu dò gen ß-actin hoạt động tốt gradient nhiệt từ 60.0º 70.0ºC, nhiệt độ 66,4°C hệ mồi mẫu dò hoạt động cho tín hiệu chu kỳ ngưỡng Ct = 26,1, không sai lệch nhiều so với Ct nhiệt độ khác, 66,4°C nhiệt độ lai thích hợp cho hệ mồi mẫu dò gen ß-actin 34   Bảng 4.8 Kết khảo sát nhiệt độ lai gen ß-actin Giếng Tên Ct Nhiệt độ (°C) A02 ß-actin 26,2 70 B02 ß-actin 26,2 69,5 C02 ß-actin 25,8 68,3 D02 ß-actin 26,1 66,4 E02 ß-actin 25,4 63,9 F02 ß-actin 24,9 62,1 G02 ß-actin 27,6 60,8 H02 ß-actin 25,9 60 H03 Chứng âm (-) 60 Kết luận: Nhiệt độ 66,4°C nhiệt độ lai thích hợp cho hoạt động hai hệ mồi SMN1 ß-actin, nhiệt độ đồng thời hệ mồi SMN1 cho kết khuếch đại chuyên biệt Như chọn nhiệt độ 66°C làm nhiệt độ lai cho quy trình 4.5 Kết khảo sát độ nhạy quy trình Như đề cập phần vật liệu phương pháp, tiến hành thực phản ứng multiplex sử dụng mẫu DNA genome chứng người bình thường, sử dụng mẫu DNA có nồng độ biết trước 107 copies/ml, tiến hành pha loãng theo bậc mười mẫu DNA thu mẫu DNA nồng độ 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, thực phản ứng Real-time PCR cho mẫu nồng độ thu kết sau 4.5.1 Kết khảo sát độ nhạy gen ß-actin Bảng 4.9 Kết khảo sát độ nhạy gen ß-actin Kết Ct 101 102 103 104 105 106 107 Chứng âm - + + + + + + - No Ct 37,57 34,03 31,30 22,21 22,93 18,15 No Ct 35   Hình 4.14 Kết khảo sát độ nhạy gen ß-actin 4.5.2 Kết khảo sát độ nhạy gen SMN1 Bảng 4.10 Kết khảo sát độ nhạy gen SMN1 Kết Ct 101 102 103 104 105 106 107 Chứng (-) - + + + + + + - No Ct 37,93 35,16 31,73 28,7 25,49 19,89 No Ct Hình 4.15 Kết khảo sát độ nhạy gen SMN1 Kết luận: Dựa vào kết dương tính nồng độ, chúng tơi nhận thấy nồng độ tối thiểu cho kết dương tính 102 gen SMN1 ß-actin 4.6 Kết xây dựng cách tính số lượng gen SMN1 Tiến hành khảo sát cách định lượng tương đối số lượng gen SMN1, sử dụng phương pháp gen tham chiếu ∆∆Ct Livak, 2001 36   Đầu tiên kiểm tra hiệu khuếch đại hệ mồi mẫu dò hai gen SMN1 ß-actin Tiến hành pha lỗng mẫu DNA genome chuẩn có hai gen SMN1, gen ß-actin thành ba nồng độ, tiến hành phản ứng multiplex ba mẫu pha lỗng thu kết Tiếp theo tiến hành xây dựng đường chuẩn khuếch đại cho hai gen dựa vào kết thu trên, tiến hành tính hiệu khuếch đại cho gen thu kết hình sau: Hình 4.16 Kết xây dựng đường chuẩn gen SMN Hình 4.17 Kết hiệu suất khuếch đại gen β-actin Nhận xét: Theo kết thu gen SMN1 có hiệu khuếch đại 101,8%, gen ß-actin có hiệu khuếch đại 98,9, hiệu khuếch đại hai gen cao nằm khoảng cho phép phản ứng Real-time PCR định lượng từ 95-110% Như hiệu khuếch đại hai gen đạt yêu cầu phương pháp ∆∆Ct Livak, 2001 để tính số lượng Tiếp theo, tiến hành thực phản ứng multiplex Real-time PCR mẫu chứng (gồm hai mẫu có hai gen SMN1(mẫu 94 101), hai mẫu có gen SMN1 (mẫu 88 90), ba mẫu có khơng gen SMN1(mẫu 80, 82 37   125 ) cung cấp giáo sư, tiến sĩ Renata Lonigro, đại học Udine, Italia Sau thu nhận kết quả, sử dụng mẫu 94 làm mẫu chuẩn để tính tốn số lượng gen SMN1 theo cơng thức nêu Bảng 4.11 Kết phản ứng Real-time PCR mẫu chứng Stt Mẫu Ct ß-actin Ct ∆Ct ∆∆Ct 2(-∆∆Ct) Số SMN1 94 18,8 21,6 2,8 2 101 20 23 0,24 0,87 88 20 25,5 5,5 2,74 0,15 90 18 23 2,24 0,22 80 20 No Ct 82 20 No Ct 125 19 No Ct Chứng (-) No Ct No Ct Nhận xét: Đối với trường hợp không gen SMN1 tín hiệu huỳnh quang gen ß-actin cho kết dương tính bình thường, gen SMN1 cho kết âm tính Đối với trường hợp gen SMN1 hai gen cho kết dương tính chu kỳ ngưỡng cách biệt từ đến 5,5, cho kết tỉ số 2(-∆∆Ct) từ 0,15 đến 0,22 Theo lý thuyết thể mang có tỉ số nằm khoảng từ 0,1-0,5, với kết tối ưu 0,5 So sánh với lý thuyết tỉ lệ chưa đạt mức tối ưu nằm khoảng cho phép Đối với trường hợp hai gen SMN1 hai gen cho kết dương tính với chu kỳ ngưỡng cách biệt khoảng 2,8 – cho kết tỉ số 2(-∆∆Ct) 0,87 – Theo lý thuyết người có hai gen SMN1 có tỉ số nằm khoảng lớn 0,5 nhỏ 1,5, với tỉ lệ tối ưu So sánh với lý thuyết tỉ lệ nằm khoảng cho phép Kết luận: Phương pháp sử dụng dùng để định lượng tương đối số gen SMN1 kết thu phù hợp với kết giáo sư Renata Lonigro 38   4.7 Tiến hành chạy thực nghiệm với quy trình xây dựng mẫu đại trà Sau hồn thành quy trình tiến hành chạy thực nghiệm 30 mẫu, gồm 23 mẫu DNA genome bệnh nhân bình thường tách chiết theo phương pháp tủa, mẫu DNA genome (của bệnh nhân SMA) cung cấp giáo sư Maria Jădrzejowska thuộc viện Neuromuscular Unit, Mossakowski Medical Research Center, Ba Lan, chạy mẫu chuẩn có hai gen SMN1 mẫu 94 (cung cấp giáo sư Renata, Lonigro, đại học Udine, Italia), với mẫu chứng âm chứa nước cất Kết trình bày bảng 4.12: Bảng 4.12 Kết phản ứng Real-time PCR mẫu thực nghiệm ∆Ct ∆∆Ct 2(-∆∆Ct) Số (4) (5) (6) (7) (8) 20,46 23,22 2,76 552 33 35,41 2,41 -0,35 1,27 548 32,5 36 3,5 0,74 0,60 538 30 36 3,24 0,11 571 31,5 35 3,5 0,74 0,60 560 31,6 35 3,4 0,64 0,64 598 32,5 35 2,5 -0,26 1,20 572 33 36 0,24 0,85 566 28 30,5 2,5 -0,26 1,20 10 499 28 31 0,24 0,85 11 623 26 29 0,24 0,85 12 561 30 33 0,24 0,85 13 562 31,4 34 2,6 -0,16 1,12 14 309 35 38 0,24 0,85 15 311 27,4 30,58 3,18 0,42 0,75 16 319 32,4 35,47 3,07 0,31 0,81 17 321 28,5 31,52 3,02 0,26 0,84 18 360 30,5 33 2,5 -0,26 1,20 19 367 30 33,5 3,5 0,74 0,60 20 414 30,6 36 5,4 2,64 0,16 Stt Mẫu Ct ß-actin Ct SMN1 (1) (2) (3) 94 39   Bảng 4.12 (tt) Kết phản ứng Real-time PCR mẫu thực nghiệm (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) 21 410 32,23 35 2,77 0,01 0,99 22 438 32 35 0,24 0,85 23 439 29 32,5 3,5 0,74 0,60 24 550 28 31,5 3,5 0,74 0,60 25 23 No Ct 26 22 No Ct 27 23 No Ct 28 24 No Ct 29 25 No Ct 30 23 No Ct 31 22 No Ct 32 Chứng âm No Ct (-) Nhận xét: Chứng âm cho kết âm tính chứng tỏ q trình thực phản ứng không bị tạp nhiễm Đối với mẫu cung cấp giáo sư Maria Jădrzejowska, tất cho kết dương tính Kết phù hợp mẫu DNA genome bệnh nhân teo tủy sống Đối với 23 mẫu DNA genome ngẫu nhiên người bình thường chúng tơi nhận thấy có 21 mẫu có hai gen SMN1(có tỉ số 2(-∆∆Ct) nằm khoảng 0,6 – 1,27, phù hợp với tỉ số lý thuyết), hai mẫu có gen SMN1(có tỉ số 2(∆∆Ct) 0,11 0,16, phù hợp với tỉ số lý thuyết) Kết luận: Từ kết thu kết luận tỉ lệ thể mang mẫu nghiên cứu 8,7% 40   Thảo luận Trong nghiên cứu thành công việc xây dựng quy trình Allele Specific Real-time PCR nhằm định lượng gen SMN1 người Việc thêm mismatch vào vị trí -3, đầu 3’ mồi xi SMN1 có tác dụng ngăn khuếch đại khơng đặc hiệu gen SMn2 đồng thời không làm giảm đáng kể khả khuếch đại gen SMN1 Điều đáng quan tâm nghiên cứu tác giả Ilsa Gómez-Curet ctv., (nghiên cứu mà tham khảo cặp mồi mẫu dò cho gen SMN1) nhiệt độ lai mà hệ mồi mẫu dò hoạt động tốt cho độ đặc hiệu cao 60°C, thấp nhiệt độ khảo sát 6°C Như điều kiện nhiệt độ lai dể đạt độ đặc hiệu khóa luận khắc ngiệt Do điều kiện không cho phép nên chưa có khả khảo sát kỹ nồng độ mồi, mẫu dò, tỉ lệ mồi mẫu dò cho hai gen SMN1 SMN2 Nếu có điều kiện phát triển đề tài việc nghiên cứu kỹ vấn đề giúp hồn thiện quy trình Trong khóa luận độ nhạy quy trình khảo sát 102 copies/ml, với phương pháp Real-time PCR kết mà thu tốt Khi khảo sát cách tính tương đối số gen SMN1 sử dụng gen tham chiếu ß-actin theo cơng thức ∆∆Ct Livak, nhận thấy phương pháp áp dụng thành công Khi khảo sát cách tính tương đối số theo cơng thức ∆∆Ct Livak, 2001, nhận thấy phương pháp áp dụng thành cơng mục đích tính số lượng gene SMN1 sử dụng gene tham chiếu ß-actin Kết thực nghiệm 23 mẫu DNA genome người bình thường cho thấy có hai trường hợp thể mang Do giới hạn cỡ mẫu nên đưa tỉ lệ thể mang có tính phổ qt dân số Việt Nam 41   Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Trong nội dung khóa luận chúng tơi xây dựng thành cơng quy trình Real-time PCR định lượng số lượng gen SMN1 khảo sát nhiệt độ lai thích hợp cho hai gen SMN1 ß-actin 66,4 °C, đồng thời nhiệt độ lai hệ mồi mẫu dò gen SMN1 hoạt động với độ đặc hiệu cao Xác định độ nhạy quy trình 102 copies/ml, độ nhạy thích hợp phản ứng Real-time PCR Xây dựng cách tính số lượng gen SMN1 theo phương pháp ∆∆Ct Livak, 2001 tiến hành chạy thực nghiệm mẫu DNA genome bệnh nhân SMA giáo sư Maria Jădrzejowska cung cấp mẫu DNA genome đại trà công ty Cổ phần Công Nghệ Việt Á Kết thu mẫu DNA gemome bệnh nhân SMA phù hợp với kết giáo sư Maria Jădrzejowska, mẫu DNA đại trà cung cấp công ty Cổ phần Cơng Nghệ Việt Á, xác định tỉ lệ thể mang 8,7 % 5.2 Đề nghị Trong giới hạn khóa luận thực nội dung trên, tiếp tục nghiên cứu chúng tơi xin có đề nghị sau: Khảo sát nồng độ mồi mẫu dò tỉ lệ mồi mẫu dò cho hai gen SMN1 nhằm hồn thiện tối ưu quy trình Tiến hành nghiên cứu cỡ mẫu lớn để khảo sát đưa tỉ lệ 2∆∆Ct thực nghiệm mang tính phổ quát hơn, từ hồn thành quy trình định lượng Áp dụng quy trình để nghiên cứu lượng mẫu đại trà lớn nhằm đưa tỉ lệ thể mang dân số Việt Nam 42   TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước BS CK II Lê Minh, Bộ môn Nội Thần kinh, Trường ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh, BS Huỳnh Văn Phụng, BV Hồn Mỹ, BS Võ Đôn, BV Nhân dân 115 Bệnh teo tủy sống type III: Nhận xét hai trường hợp điểm lại y văn 2003 Y Học TP Hồ Chí Minh, tập san đặc biệt thần kinh, tập 7, số 4: 150-155 Trần Diệp Tuấn 2008 Góp phần khảo sát chế di truyền bệnh teo tủy sống type I (werdnig - hoffmann) Y Học TP Hồ Chí Minh, Tập 12, Số Tài liệu nước Athanasios I Tsirikos, Alexander D.L Baker 2006 Spinal muscular atrophy: Classification, aetiology, and treatment of spinal deformity in children and adolescents Current Orthopaedics 20: 430 – 445 Bradley J Turner, Nicholas J Parkinson, Kay E Davies, Kevin Talbot 2009 Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model Neurobiology of Disease 34: 511 – 517 Brunhilde Wirth, M Herz,1 A Wetter, S Moskau, E Hahnen, S RudnikSchoăneborn, T Wienker, and K Zerres 1999 Quantitative Analysis of Survival Motor Neuron Copies: Identification of Subtle SMN1 Mutations in Patients with Spinal Muscular Atrophy,Genotype-Phenotype Correlation, and Implications for Genetic Counseling Am J Hum Genet 64:1340 – 1356 Brunhilde Wirth, PhD, Lars Brichta, MSc, and Eric Hahnen, PhD 2006 Spinal Muscular Atrophy: From Gene to Therapy Semin Pediatr Neurol 13:121 - 131 Burglen, L et al 1997 The gene encoding p44, a subunit of the transcription factor TFJIH, is involved in large scale deletions asscociated with Werdnig-Hoffmann disease Am J Hum Genet 60: 72 - 79 Cartegni L., and Krainer A.R.2002 Disruption of an SF2/ASFdependent exonic splicing enhancer in SMN2 causes spinal muscular atrophy in the absence of SMN1 Nat Genet 30: 377 – 384 Dirk Anhuf,Thomas Eggermann, Sabine Rudnik-Schoăneborn, and Klaus Zerres 2003 Determination of SMN1 and SMN2 Copy Number Using TaqMant Technology Human Mutation 22:74 - 78 10 Hahnen E, Wirth B 1996 Frequent DNA variant in exon 2a of the survival motor neuron gene: a further possibility for distinguishing the two copies of the gene Hum Mol Genet 9:122 – 123 11 Ilsa Gómez-Curet, Karyn G Robinson and Vicky L Funanage, Thomas O Crawford, Mena Scavina, Wenlan Wang.2007 Robust quantification of the SMN gene copy number in spinal muscular atrophy Neurogenetics 8: 271 – 278 12 Kashima T., and Manley J.L 2003 A negative element in SMN2 exon inhibits splicing in spinal muscular atrophy Nat Genet 34: 460 – 463 13 Kenneth J Livak and Thomas D Schmittgen, 2001, Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-∆∆Ct Method Method 25: 402 – 408 43   14 Kenneth J Livak 1999 Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5’ nuclease assay Genetic Analysis: Biomolecular Engineering 14: 143 – 149 15 Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S, Clermont O, Burlet P, Viollet L, Benichou B, Cruaud C, Millasseau P, Zeviani M, Le Paslier D, Frezal J, Cohen D, Weissenbach J, Munnich A, Melki J 1995 Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene Cell 80: 155 – 165 16 Mitchell R Lunn, Ching H Wang 2008 Spinal muscular atrophy Lancet 371: 20 – 33 17 Nadia Passon, Federico Pozzo, Cristiano Molinis, Elisa Bregant,1 Cinzia Gellera, Giuseppe Damante,1 and Renata I Lonigro 2009 A Simple Multiplex Real-Time PCR Methodology for the SMN1 Gene Copy Number Quantification Genetic Testing And Molecular Biomarkers 13 18 Oronzo Scarciolla, Liborio Stuppia, Maria Vittoria De Angelis, Stefania Murru, Chiara Palka, Rossella Giuliani, Marta Pace, Antonio Di Muzio, Isabella Torrente, Annunziata Morella, Paola Grammatico, Manlio Giacanelli, Maria Cristina Rosatelli, Antonino Uncini, Bruno Dallapiccola, 2006, Spinal muscular atrophy genotyping by gene dosage using multiple ligation-dependent probe amplification Neurogenetics 7: 269 – 276 19 Pearn, J 1980 Classification of spinal muscular atrophies Lancet 1: 919 – 922 20 Scheffer H, Cobben JM, Matthijs G, Wirth B 2001 Best practice guidelines for molecular analysis in spinal muscular atrophy Eur J Hum Genet 9:484 – 491 21 Shu-Chin Chien, Yi-Ning Su 2005 Current aspects in the molecular genetics and Diagnostics of spinal muscular atrophy Taiwanese J Obstet Gynecol 44:201–208 22 Shuji Ogino, Robert B Wilson 2002 Genetic testing and risk assessment for spinal muscular atrophy (SMA) Hum Genet 111 :477 – 500 23 Tran Van Khanh, Yasuhiro Takeshima, Yosuke Harada, Hisahide Nishio, Nguyen Thi Ngoc Dao, Nguyen Thi Hoan, Bui Phuong Thao, and Masafumi Matsuo 2002 Molecular Genetic Analyses of Five Vietnamese Patients with Spinal Muscular Atrophy Kobe J Med Sci 48: 177 - 182 24 Umrao R Monani 2005 Spinal Muscular Atrophy: A Deficiency in a Ubiquitous Protein;a Motor Neuron-Specific Disease, review Neuron 48: 885 – 896 25 Van der Steege G, Grootscholten P, van der Vlies P, Draaijers TG, Osinga J, Cobben JM, Scheffer H, Buys CHCM 1995 PCR based DNA test to confirm clinical diagnosis of autosomal recessive spinal muscular atrophy Lancet 345: 985 – 986 26 Wirth B, Schmidt T, Hahnen E, Rudnik-Schöneborn S, Krawczak M, MullerMyhsok B, Schonling J, Zerres K 1997 De novo rearrangements found in 2% of index patients with spinal muscular atrophy: mutational mechanisms, parental origin, mutation rate, and implications for genetic counseling Am J Hum Genet 61: 1102 – 1111 27 Wirth B 2000 An update of the mutation spectrum of the survival motor neuron gene (SMN1) in autosomal recessive spinal muscular atrophy (SMA) Hum Mutat 15:228 – 237 28 Yi-Ning Su, Chia-Cheng Hung, Hung Li, Chien-Nan Lee, Wen-Fang Cheng, PoNien Tsao, Ming-Cheng Chang, Chia-Li Yu, Wu-Shiun Hsieh, Win-Li Lin, and Su-Ming Hsu, 2005 Quantitative Analysis of SMN1 and SMN2 Genes Based on 44   DHPLC: A Highly Efficient and Reliable Carrier-Screening Test Human Mutation 25: 460 - 467 29 Yolanda Martín, Ana Valero, Emilia del Castillo, Samuel I Pascual, Concepción Hernández-Chico 2002 Genetic study of SMA patients without homozygous SMN1 deletions: identification of compound heterozygotes and characterization of novel intragenic SMN1 mutations Hum Genet 110: 257 – 263 Sách tham khảo Sambrook J, Russel DW (2001) Molecular cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, pp A8.9–A8.10 Tài liệu tham khảo từ internet http://www.fightsma.org/index.php?spinal-muscular-atrophy-diagnosis-tests 45   ... Phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 (IDT, Hoa Kỳ) 3.3.1.2 Tiêu chuẩn thi t kế mồi (Livak, 1999) Mồi nên có %GC khoảng 30 - 80% Khơng nên thi t kế mồi có nhiều nucleotide G li n tiếp Nhiệt độ... 06/2010 3.2 Vật li u thi t bị 3.2.1 Mẫu Mẫu sử dụng gồm hai loại: Mẫu DNA chuẩn gồm DNA genome khơng gen SMN1 (có hai gen SMN2), gen SMN1, hai gen SMN1(không gen SMN2) cung cấp giáo sư Renata Lonigro,... sinh thi t sử dụng 2.4.2 Chẩn đoán sử dụng công cụ sinh học phân tử 2.4.2.1 Phương pháp phân tích li n kết (linkage analysis) Thơng thường gen nằm cạnh nhiễm sắc thể thường có xu hướng li n kết