Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định lượng clorpromazin trong huyết tương người

Bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO Bộ Y Tế tRƯờNG đạI HọC dƯợC hà NộI Nguyễn Trung Nghĩa nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định lượng clorpromazin huyết tương người Luận văn Thạc sĩ Dược học Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất Mã số : 60.73.15 Hà nội - 2006 Bộ GIáO DụC Và ĐàO TạO Bộ Y Tế tRƯờNG đạI HọC dƯợC hà NộI Nguyễn Trung Nghĩa nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định lượng clorpromazin huyết tương người Chuyên ngành: KiĨm nghiƯm thc - §éc chÊt M· sè : 60.73.15 Luận văn Thạc sĩ Dược học người hướng dẫn khoa häc: PGS TS TrÇn Tư An TS Ngun Thị Kiều Anh Hà nội - 2006 LI CM N Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Tử An TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người thầy tận tình hướng dẫn, bảo tơi suốt q trình học tập nghiên cứu thực đề tài Xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, cảm ơn thầy Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ mơn Phân tích Bộ môn khác trường Đại học Dược Hà nội tạo điều kiện tốt cho thời gian học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo cán Bộ mơn Hóa phân tích ln quan tâm tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành nhiệm vụ học tập nghiên cứu thời gian vừa qua Cuối tơi xin cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, bạn bè động viên, chia sẻ, khích lệ giúp đỡ để tơi có kết ngày hôm Hà Nội, ngày 26 tháng 12 năm 2006 Học viên cao học khóa 9, chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất Nguyễn Trung Nghĩa -I- BẢNG CHÚ THÍCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CBZ CPZ HPLC : : : HT LOQ MS PĐ PA RSD SD S/N TƯ t 1/2 t max UV VN : : : : : : : : : : : : : R R Carbamazepin Clorpromazin Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) Huyết tương Giíi hạn định lượng (Limit of Quantification) Khi ph (Mass Spectrometry) Pha động Tinh khiết phân tích (Pure for Analysis) Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) Tín hiệu/nhiễu đường (Signal/Noise) Trung Ương thời gian bán hủy thời gian đạt nồng độ thuốc cực đại Tử ngoại (Ultra Violet) Việt Nam -II- MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Clorpromazin 1.1.1 C«ng thøc 1.1.2 TÝnh chÊt 1.1.3 Động học, chế tác dụng dược lý 1.1.4 áp dụng lâm sàng 1.1.5 Một số dạng chế phẩm bào chế biệt dược chứa CPZ 1.2 Kü thuËt chiÕt láng - láng 1.3 Sắc ký lỏng hiệu cao 10 1.3.1 Nguyên lý 12 1.3.2 Thiết bị 15 1.4 Một số phương pháp HPLC định lượng clorpromazin Chng 2: I TNG - PHNG PHP NGHIấN CU 19 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Hoá chất - trang thiết bị 22 2.2.1 Hoá chất 22 2.2.2 Thiết bị - dụng cụ 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Xây dựng quy trình định lượng 23 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 25 2.3.3 Định lượng thăm dò CPZ huyết tương bệnh nhân 27 2.3.4 Phân tích số liệu thùc nghiÖm 27 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 -III- 3.1 Phương pháp định lượng clorpromazin huyết tương 28 3.1.1 Phương pháp chiết CPZ từ huyết tương 28 3.1.2 Các điều kiện sắc ký chương trình HPLC để định lượng CPZ 34 3.2 Kết thẩm định phương pháp định lượng 38 3.2.1 Tính phù hợp cđa hƯ thèng s¾c ký 38 3.2.2 TÝnh chän läc 40 3.2.3 Khoảng nồng độ tuyến tính 43 3.2.4 Giới hạn định lượng 48 3.2.5 Độ - độ xác - độ tìm lại 49 3.2.6 Độ ổn định 53 3.3 Kết sơ định lượng CPZ huyết tương bệnh nhân 54 3.4 Bàn luận 56 3.4.1 Về xây dựng thẩm định phương pháp định lượng CPZ/HT 56 3.4.2 Về kết sơ định lượng CPZ/HT bệnh nhân 60 Chng 4: KT LUN V ĐỀ XUẤT 62 4.1 KÕt ln 62 4.2 §Ị xt 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN -IV- Bảng Nội dung Trang 1.1 Một số phương pháp HPLC định lượng clorpromazin 19 3.2 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống sắc ký 32 3.3 Sự phụ thuộc diện tích pic nồng độ CPZ huyết tương 44 3.4 Kết xác định giới hạn định lượng 48 3.5 Kết xác định độ đ úng phương pháp phân tích 49 3.6 Kết xác định độ lặp ngày phép phân tích 50 3.7 Kết khảo sát độ lặp lại khác ngày 51 3.8 Kết xác định hiệu suất chiết CPZ 52 3.9 Kết khảo sát độ ổn định CPZ thời gian phân tích 53 3.10 Kết khảo sát độ ổn định CPZ thời gian bảo quản 54 3.11 Kết đ ịnh lượng thăm dò CPZ huyết tương bệnh nhân 55 -V- DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Hình Nội dung Trang 1.1 Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 15 3.2 Sơ đồ quy trình chiết CPZ huyết tương 30 3.3 Kết khảo sát tìm dung mơi chiết CPZ huyết tương 31 3.4 Sắc ký đồ khảo sát thời gian lắc xoáy 32 3.5 Sắc ký đồ khảo sát nhiệt độ cô bay dung môi 33 3.6 Kết khảo sát cột sắc ký hệ pha động cho định lượng CPZ/HT 36 3.7 Phổ hấp thụ UV CPZ hệ pha động 37 3.8 Sắc đồ khảo sát phù hợp hệ thống sắc ký 39 3.9 Các sắc ký đồ thể tính chọn lọc phương pháp 42 3.10 So phổ UV pic có R t = 4,820 phút với phổ CPZ chuẩn 43 3.11 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích nồng độ CPZ 44 R R huyết tương 3.12 Các sắc đồ khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính CPZ huyết tương 47 đặt vấn đề Clorpromazin dẫn chất nhóm phenothiazin có tác dụng hướng thần kinh điển, sử dụng rộng rãi Việt Nam Tuy nhiên, liên quan nồng độ thuốc huyết tương với liều dùng khác cá thể, mặt khác mối liên hệ nồng độ thuốc huyết tương với đáp ứng lâm sàng không rõ ràng nên liều clorpromazin xảy phổ biến Các triệu chứng ngộ độc nặng clorpromazin xảy với liều nhỏ 0,1g/lần bệnh nhân phải dùng tới liều 1g/ngày chí 2g/ngày cao [6], [19] Nồng độ clorpromazin huyết tương với liều điều trị dao động tõ 0,03 0,3μg/mL, triƯu chøng ngé ®éc cã thĨ xt nồng độ từ 0,5 - 2g/mL nồng độ 2g/mL gây tử vong Một nghiên cứu ca tử vong cho thấy nồng độ clorpromazin máu toàn phần dao động từ - 35g/mL (trung bình 17g/mL) [18], [28] Với mục đích góp phần vào việc xác định nồng độ thuốc clorpromazin máu phục vụ cho việc theo dõi nồng độ thuốc máu bệnh nhân điều trị bệnh viện, tiến hành đề tài: "Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định lượng clorpromazin huyết tương người" Để thực mục đích trên, đề tài nghiên cứu gồm nội dung sau: - Khảo sát quy trình chiết clorpromazin huyết tương người xây dựng chương trình HPLC để định lượng clorpromazin - Thẩm định chương trình xây dựng áp dụng định lượng clorpromazin huyết tương bệnh nhân - Chương 1: Tổng quan 1.1 Clorpromazin 1.1.1 Công thức - Clorpromazin CH3 N CH3 N Cl S C 17 H 19 ClN S (M=318,9) R R R R R R 2-Chloro-10-(3-dimethylaminopropyl) phenothiazin [12], [17], [35], [36] - Clorpromazin embonat (C 17 H 19 ClN S) C 23 H 16 O (M=1026.1) R R R R R R R R R R R R R R Trong thực tế thường gặp thuốc dạng hydroclorid - Clorpromazin hydroclorid C 17 H 19 ClN S.HCl R R R R R R 1.1.2 TÝnh chÊt - Clorpromazin + Dạng bột trắng đến trắng kem, không mùi, bị phân hủy dần tác dụng ánh sáng (trở nên sẫm màu) + Thực tế không tan nước, tan ethanol vµ ether (1/3), tan cloroform vµ benzen (1/2) Dễ tan acid vô loãng, thực tế không tan hydroxyd kiềm loãng + Nhiệt ®é nãng ch¶y: 560 - 600C P P P P 54 Bảng 3.10 Kết xác định độ ổn định cđa CPZ thêi gian b¶o qu¶n U U Thêi gian (ngày) Nồng độ CPZ/HT (g/mL) % CPZ tính theo mẫu phân tích Lượng CPZ thay đổi (%) 1,018 100 1,012 99,4 - 0,6 14 1,003 98,5 - 1,5 21 0,986 96,9 - 3,1 NhËn xét: kết nghiên cứu từ bảng 3.10 cho thấy, nồng độ CPZ/HT U U giảm < 5% thời gian bảo quản Vậy CPZ ổn định thời gian bảo quản 21 ngày nhiệt độ -30oC, mẫu huyết tương sau lấy 21 ngày, P P bảo quản điều kiện cho kết chấp nhận 3.3 Kết sơ định lượng CPZ huyết tương bệnh nhân Tiến hành lấy máu định lượng CPZ huyết tương 18 bệnh nhân sử dụng chế phẩm có chứa CPZ (viên nén Aminazin hàm lượng 25 mg) Các bệnh nhân điều trị nội trú bệnh viện Tâm thần Trung ương máu lấy giai đoạn bệnh nhân bác sỹ điều trị đánh giá có đáp ứng tốt với thuốc dùng thuốc với liều ổn định Mỗi bệnh nhân lấy máu thời điểm, trước ng thc 30 vµ sau ng thc giê Các bệnh nhân đánh số mã hóa mÉu m¸u theo thêi gian lÊy m¸u LÊy m¸u tÜnh mạch cánh tay vào ống nghiệm có chứa EDTA, ly tâm lấy huyết tương xử lý mẫu theo sơ đồ hình 3.2 tiến hành sắc ký theo điều kiện mục 3.1.2 Kết phân tích trình bày bảng 3.11 55 Bảng 3.11 Kết định lượng thăm dò CPZ huyết tương bệnh nhân U U STT LiỊu dïng Nång ®é CPZ/HT (μg/mL) Aminazin thời điểm lấy máu Trước uống thuốc 30 phút Sau uèng thuèc giê 25 mg x viªn 0,032 0,251 25 mg x viªn 0,057 0,324 25 mg x viªn 0,044 0,307 25 mg x viªn 0,041 0,286 25 mg x viªn 0,064 0,348 25 mg x viªn 0,039 0,293 25 mg x viªn 0,037 0,310 25 mg x viªn 0,052 0,321 25 mg x viªn 0,028 0,277 10 25 mg x viªn 0,033 0,284 11 25 mg x viªn 0,045 0,304 12 25 mg x viªn 0,056 0,343 13 25 mg x viªn 0,021 0,332 14 25 mg x viªn 0,063 0,362 15 25 mg x viªn 0,047 0,295 16 25 mg x viªn 0,041 0,388 17 25 mg x viªn 0,058 0,457 18 25 mg x viªn 0,062 0,379 56 Nhận xét: kết khảo sát cho thấy nồng độ CPZ/HT bệnh U U nhân nằm khoảng tuyến tính khảo sát Tại thời điểm trước uống thuốc 30 phút, đa số mẫu huyết tương ®Ịu cã nång ®é n»m kho¶ng nång ®é ®iỊu trị, riêng bệnh nhân số 13 có nồng độ CPZ/HT 0,028g/mL 0,021g/mL thấp khoảng điều trị (0,03 - 0,3 g/mL) Đối với mẫu huyết tương lấy sau thời điểm uống thc giê th× cã tíi 12 mÉu cã nång độ lớn vượt khoảng nồng độ điều trị (> 0,3g/mL), nhiên mẫu có nồng độ nằm khoảng gây triệu chứng ngộ độc 3.4 Bàn luận 3.4.1 Về xây dựng thẩm định phương pháp định lượng CPZ/HT 3.4.1.1 Về xây dựng phương pháp định lượng * Phương pháp xử lý mẫu: để tạo điều kiện tối ưu cho định lượng CPZ huyết tương người (có nồng độ thấp, mẫu phức tạp) đạt kết tốt, quy trình xử lý mẫu phải có khả loại tạp tốt hiệu suất chiết cao Tuy nhiên với đa số bệnh nhân điều trị CPZ bệnh nhân tâm thần, thường có hoàn cảnh phức tạp bị người nhà bỏ rơi, nên lựa chọn phương pháp chiết lỏng - lỏng để tách CPZ/HT mà không dùng phương pháp chiết pha rắn tác giả [29], [34] nhằm giảm chi phí cho trình phân tích, chiết lỏng - lỏng không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt, quy trình tiến hành đơn giản, dễ triển khai - áp dụng xử lý đồng thời nhiều mẫu Trong quy trình chiết, CPZ cã h»ng sè pK a = 9,3 nªn ban đầu phải R R tiến hành kiềm hóa để đưa CPZ dạng base tan dung môi hữu cơ, nghiên cứu cho thấy pH = 10,6 tối ưu để chuyển CPZ dung dịch dạng phân tử Lựa chọn kiềm hóa dung dịch NaOH 2M dung 57 dịch đệm carbonat thấy sử dơng hƯ ®Ưm carbonat dƠ ®iỊu chØnh pH vỊ ®óng mức mong muốn so với dùng dung dịch NaOH 2M Tiếp theo, so sánh sử dụng dung môi chiết cloroform, dicloromethan hỗn hợp dung m«i isopropanol : n-pentan : dicloromethan (5 : 49 : 46), kết cho thấy hỗn hợp dung môi isopropanol : n-pentan : dicloromethan (5 : 49 : 46) cã hiệu suất chiết cao (96,8%-99,1%), tạp, độ lặp lại tốt, trình chiết bị nhũ hóa so với cloroform dicloromethan Về thời gian lắc xoáy, kết khảo sát cho thấy thời gian lắc xoáy phút lượng CPZ chiết hẳn, thời gian lắc chưa đủ để chuyển hết CPZ/HT sang pha dung môi Khi thời gian lắc xoáy tăng lên 10 phút lượng CPZ chiết không nhiều so với lắc xoáy thời gian phút Do vậy, thời gian lắc xoáy phù hợp quy trình phút Chiết lỏng - lỏng sử dụng dung môi hữu có khả làm giàu mẫu trình bay dung môi - cô đặc mẫu Tuy nhiên, trình bay dung môi, sử dụng nhiệt 80oC bắt đầu thấy có phân hủy P P nhiệt CPZ phân hủy tăng lên sử dơng nhiƯt ë 100oC V× vËy, P P bay dung môi, nhiệt độ sử dụng cho phép 50oC, trình bay P P dung môi chậm nên quy trình xử lý mẫu tương đối lâu thời gian * Phương pháp HPLC định lượng CPZ/HT: phương pháp HPLC để định lượng CPZ dịch sinh học nghiên cứu công bố nhiỊu tµi liƯu [16], [20], [21], [22], [23], [25], [27], [29], [30], [31], [34] Tuy nhiên, nghiên cứu th­êng sư dơng detector hnh quang hc MS điều kiện thực tế phòng thí nghiệm Việt Nam thường trang bị detector UV Thêm nữa, điều kiện sắc ký kết định lượng tốt lại phụ thuộc vào quy trình xử lý mẫu mẫu Dựa vào tài liệu công bố, kết hợp với điều kiện sẵn có tiến hành khảo sát điều kiện 58 sắc ký phần 2.3.1.3 Kết đánh giá thông qua xác định tính phù hợp hệ thống sắc ký, đánh giá độ lệch chuẩn tương đối thông số thời gian lưu, giá trị đáp ứng chất phân tích, khả tách pic chất phân tích khỏi chất khác, hình ảnh cân đối, gọn, sắc nét hay không pic chất phân tích sắc ký đồ thời gian lưu phù hợp để có thời gian phân tích hợp lý Qua kết phần 3.1.2 3.2.1, thấy chương trình sắc ký sử dụng đề tài phù hợp để phân tích định lượng CPZ huyết tương người Pic CPZ có thời gian lưu ngắn ( 4,8 phút), tách riêng biệt khỏi chất khác, pic cân đối, gọn, RSD thông số thời gian lưu, diện tích pic CPZ < 2% thời gian sắc ký không dài 3.4.1.2 Về thẩm định phương pháp định lượng Sau xây dựng xong quy trình phân tích, để đảm bảo áp dụng quy trình vào phân tích thực tế cách xác, cho kết tin cậy, cần thẩm định lại phương pháp với đầy đủ tiêu như: tính chọn lọc - đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn định lượng, độ - độ xác, độ ổn định mẫu phân tích * Tính chọn lọc: xác định vị trí tương øng víi thêi gian l­u cđa pic CPZ cđa mÉu trắng, kết cho thấy không xuất pic lạ thời điểm đáp ứng thành phần cản trở mẫu trắng thấp giới hạn phát Khi thêm vào mẫu chứa CPZ thành phần khác CBZ pic chất tách rêi râ rƯt Khi qt phỉ UV cđa mÉu có chứa CPZ pic có thời gian lưu tương ứng CPZ khoảng từ 210 - 400nm so sánh với phổ UV CPZ chuẩn thấy giống víi hƯ sè match lµ 998,239 59 Nh­ vậy, phương pháp HPLC với detector UV - DAD áp dụng cho định lượng CPZ/HT xây dựng đề tài có tính chọn lọc cao * Khoảng nồng độ tuyến tính: khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính đề tài cho thấy nồng độ CPZ/HT tuyến tính nồng độ thấp khoảng nồng độ tương đối rộng, từ 0,01g/mL - 1g/mL Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng: Y = 772,34X + 10,971 cã hƯ sè t­¬ng quan > 0,99 (R2 = 0,9987) chứng tỏ tương quan tuyến P P tính chặt Khoảng nồng độ tuyến tính phù hợp với kết công trình nghiên cứu tác giả [23], [29] định lượng clorpromazin huyết tương số bệnh nhân điều trị với CPZ viện Tâm thần TƯ kết nằm khoảng tuyến tính đề tài * Giới hạn định lượng dưới: đề tài này, giới hạn định lượng xác định điểm có giá trị thấp đường chuẩn tuyến tính, có nồng độ 0,01g/mL (10ng/mL), điểm giá trị đáp ứng CPZ có độ lệch chuẩn tương đối < 20% Giới hạn định lượng đề tài tương đương với kết nghiên cứu tác giả Tadashi Ohkubo [29], chưa đạt giá trị tác giả H Kirchherr [23] Tác giả H Kirchherr xác định giá trị LOQ = 0,27ng/mL, nhiên tác giả sử dụng phương pháp HPLC - MS đề tài phương pháp thường có độ nhạy cao nhiều so với HPLC - UV * Độ - độ xác: 60 - Độ đúng: tiến hành xác định phần 2.3.2.5 kết phần 3.2.5 cho thấy phương pháp nghiên cứu có độ cao với giá trị biến thiên từ 95,6% - 100,6%, độ lệch nằm giới hạn cho phép (15%) Như vậy, theo tài liệu [2], [32], phương pháp định lượng đề tài nghiên cứu đạt tiêu chuẩn độ cho phương pháp phân tích dịch sinh học áp dụng để định lượng clorpromazin huyết tương người - Độ xác: đề tài tiến hành thẩm định độ xác theo tiêu chí: độ lặp lại ngày độ lặp lại khác ngày (độ xác trung gian) phần 2.3.2.5 kết phần 3.2.5 cho thấy độ lặp lại ngày, giá trị RSD biến thiên từ 1,2% - 7,3%; độ lặp lại khác ngày, giá trị RSD biến thiên từ 1,4% - 8,7% Các giá trị RSD đánh giá độ xác đề tài < 10%, phương pháp phân tích xây dựng đề tài đạt tiêu chuẩn độ xác cho phương pháp phân tích dịch sinh học theo [2], [32] có độ xác trung bình * Độ ổn định: phạm vi đề tài độ ổn định CPZ huyết tương, đánh giá thời gian phân tích (5 giờ) thời gian bảo quản (21 ngày), cách tiến hành phần 2.3.2.6 kết thể phần 3.2.6 cho thấy lượng CPZ thay đổi thời gian phân tích khoảng 0,2% lượng CPZ giảm thời gian bảo quản < 5% Do đó, theo tài liệu [2], [32] CPZ đạt tiêu chuẩn độ ổn định thời gian phân tích độ ổn định thời gian bảo quản 3.4.2 Về kết sơ định lượng CPZ/HT bệnh nhân Tiến hành định lượng CPZ/HT 18 bệnh nhân thời điểm: trước uống thuốc 30 phút sau uống thuốc (thời điểm gần với t max cña R R CPZ [6], [18], [19]) nh­ phần 2.3.3, kết bảng 3.10 cho thấy: 61 nồng độ CPZ/HT bệnh nhân thời điểm trước ng thc 30 biÕn thiªn tõ 0,021μg/mL - 0,062 g/mL (21ng/mL - 62ng/mL)và thời điểm sau ng thc giê thay ®ỉi tõ 0,251 μg/mL - 0,457 g/mL (251ng/mL 457ng/mL) Vậy, kết định lượng sơ cho thấy nồng độ CPZ/HT bệnh nhân nằm khoảng tuyến tính khảo sát Các giá trị thu gần với số liệu xác định khoảng nồng độ CPZ/HT bệnh nhân liều điều trị tài liệu [14] (50ng/mL - 500ng/mL), nồng độ tối đa (457ng/mL) vượt cao so với số liệu tài liệu [28] (10ng/mL - 260ng/mL) nghiên cứu tác giả Tadashi Ohkubo [29] (10ng/mL - 300ng/mL), H Kirchherr [23] (30ng/mL - 300ng/mL) nh­ng vÉn n»m kho¶ng nång độ an toàn (nồng độ gây triệu chứng ngộ độc > 500ng/mL) Sở dĩ kết định lượng đạt bệnh nhân chọn bác sỹ đánh giá giai đoạn ổn định điều trị với clorpromazin liều không thay đổi Để đánh giá xác việc sử dụng thuốc điều trị cần lấy thêm mẫu máu bệnh nhân điều trị giai đoạn khác 62 chương 4: Kết luận đề xuất 4.1 Kết luận Qua trình nghiên cứu thực đề tài: "Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định lượng clorpromazin huyết tương người", rút số kết luận sau: Về xây dựng phương pháp định lượng clorpromazin huyết tương người: - Đã xây dựng quy trình chiết CPZ huyết tương phương pháp chiết lỏng - lỏng, sử dụng hỗn hợp dung môi chiết isopropanol : n - pentan : dicloromethan (5 : 49 : 46) sau kiÒm hãa huyÕt tương hệ đệm carbonat 0,2M tới pH = 10,6 cô bay dung môi nhiệt độ 40 50oC P P - Đã xác định chương trình HPLC để định lượng CPZ/HT sau: + Cột Novapak - CN (150 x 4,6mm; 5μm) + Pha ®éng: acetonitril : amoni acetat 0,05M (9 : 1) + Tèc ®é dßng: 1,5mL/phót + Detector UV: λ = 254nm +ThĨ tÝch tiêm mẫu: 50l Về thẩm định phương pháp phân tích: tiến hành thẩm định phương pháp cách tương đối đầy đủ, bao gồm tiêu: tính chọn lọc; khoảng nồng độ tuyến tính từ 0,01g/mL - μg/mL víi hƯ sè t­¬ng quan > 0,99; giíi hạn định lượng đạt 0,01g/mL; độ đúng, độ xác - độ lặp lại ngày khác ngày xấp xỉ 100% với RSD < 15%; độ tìm lại (hiệu suất chiết) đạt từ 96,8% - 99,1% độ ổn định nồng độ CPZ huyết tương thay đổi 63 thời gian phân tích (5 giờ) < 2% thời gian bảo quản (21 ngày) < 5% Kết cho thấy tiêu đạt yêu cầu, đảm bảo phương pháp áp dụng vào định lượng CPZ/HT thực tế cách xác Về định lượng CPZ/HT bệnh nhân: tiến hành xác định nồng độ CPZ/HT 18 bệnh nhân bệnh viện tâm thần trung ương điều trị Aminazin giai đoạn ổn định hai thời điểm: trước uống thuốc 30 phút sau uống thuốc Kết thu phù hợp với số nghiên cứu trước nồng độ clorpromazin huyết tương phạm vi điều trị 4.2 Đề xuất - Khảo sát định lượng CPZ/HT bệnh nhân cho thấy kết dao động nhiều gần với nồng độ gây ngộ độc bệnh nhân điều trị giai đoạn ổn định Do đó, kiến nghị nên áp dụng phương pháp xây dựng vào thực tế để giúp theo dõi nồng độ CPZ/HT bệnh nhân, nhằm có sù ®iỊu chØnh viƯc sư dơng thc, gióp sư dụng thuốc trở nên an toàn, hợp lý - Thực tế cho thấy bệnh nhân tâm thần thường sử dụng nhiều thuốc phối hợp đồng thời với CPZ, vậy, đề xuất nên xây dựng quy trình định lượng đồng thời CPZ thuốc thường dùng phối hợp Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Trần Tử An (2002), Phương pháp chiết ứng dụng kiểm nghiệm thuốc độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Thị Kiều Anh (2004), Thẩm định phương pháp phân tích sinh học ứng dụng nghiên cứu sinh khả dụng dược động học, Chuyên đề chuyên sâu Nghiên cứu sinh Đại học Dược Hà Nội Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội (2004), Dược lý học lâm sàng Bộ môn Hóa dược - Trường Đại học Dược Hà Nội (2004), Hóa dược tập I Bộ môn Hóa phân tích - Trường Đại học Dược Hà Nội (1998), Hóa phân tích II D­ỵc th­ Qc gia ViƯt Nam (2002), trang 313 316 Dược điển Việt Nam III (2002), trang 63 65 Phan Thị Thanh Hà (2006), Xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng carbamazepin huyết tương người phục vụ cá thể hóa điều trị bệnh động kinh, Luận văn Thạc sĩ Dược học trường Đại học Dược Hà Nội Trần Thị Minh Nghĩa (2006), Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng aminazin huyết tương sắc ký lỏng hiệu cao, Khóa luận tốt nghiệp dược sỹ Đại học Dược Hà Nội 10 Phạm Luận (1999), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu cao, Trường Đại học KHTN - Đại học QG Hà Nội Tiếng Anh 11 AHFS (2002), Drug information, American society of health system pharmacists, pages 2287-2289 12 British Pharmacopoeia (2002), pages 326-327 13 Christopher L Boehme and Henry W Strobel * (1998), "HighP P performance liquid chromatographic methods for the analysis of haloperidol and chlorpromazine metabolism in vitro by purified cytochrome P450 isoforms", Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, Vol 718, Issue 2, November 1998, pages 259-266 14 Joseph Chamberlain (1995), The Analysis of Drugs in Biological Fluids, 2nd edition, CRC Press, USA P P 15 Kenneth A Connors (1982), A Textbook of Pharmaceutical Analysis, John Wiley & sons 16 J K Cooper, G McKay, K K Midha (1983 ), "Subnanogram quantitation of chlorpromazine in plasma by high performance liquid chromatography with electrochemical detection", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 72, Issue 11, Date: November 1983, pages: 1259-1262 17 European Pharmacopoeia (2002), pages 893-894 18 Lewis R Goldfrank (1998), Goldfrank's Toxicologic Emergencies, 6th edition, Appleton & Lange, USA 19 Joel G Hardman, Lee E Limbird (1996), Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th edition, McGraw - Hill, USA 20 J W Hubbard, K K Midha, J K Cooper, C Charette (1981), "Highperformance liquid chromatographic assay for nanogram determination of chlorpromazine and its comparison with a radioimmunoassay", Journal of Pharmaceutical Sciences, Volume 67, Issue 11, November 1978, pages: 15711578 21 E M Kemper, B Jansen, K R Brouwer, J H M Schellens, J H Beijnen T 26T 26T 26T 26T 26T T T and O van Tellingen, "Bioanalysis and preliminary pharmacokinetics of the 1T acridonecarboxamide derivative GF120918 in plasma of mice and humans by ion-pairing reversed-phase high-performance liquid chromatography with fluorescence detection", Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences 1T and Applications, Vol 759, Issue 1, August 2001, pages 135-143 22 E M Kemper, M Ouwehand, J H Beijnen and O van Tellingen (2003), T 26T 26T 26T 26T 26T 26T 26T "Bioanalysis of zosuquidar trihydrochloride (LY335979) in small volumes of T human and murine plasma by ion-pairing reversed-phase high-performance liquid chromatography", Journal of Chromatography B, Vol 798, issue 1, 1T December 2003, pages 63-68 23 H Kirchherr *, W N Kühn-Velten (2006), "Quantitative determination of forty-eight antidepressants and antipsychotics in human serum by HPLC tandem mass spectrometry: A multi-level, single-sample approach", Journal of Chromatography B, Vol 843, pages 100-113 24 Diane Kollmorgen and Bela Kraut (1998), "Determination of methylparaben, propylparaben and chlorpromazin in chlopromazine hydrochloride oral solution by high performance liquid chromatography", Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, Vol 707, Issue - 2, 10 April 1998, pages 181-187 25 VÐronique Lasimont, Jšrgen Meins, Hiltrud Fieger - Bšschges and Henning Blume (1998), "Validated high- performance liquid chromatographic assay for the determination of promazin in human plasma: Application to pharmacokinetic studies", Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, Vol 719, Issue - 2, 20 November 1998, pages 222-226 26 Sandie Lindsay (1992), High Performance Liquid Chromatography Second edition 27 Midha K K, Hubbard J W, Cooper J K, Gurnsey T, Hawes M, Mckay G, Chakraborty B S and Yeung P K (1987), "Therapeutic monitoring of chlorpromazine IV: Comparison of a new high performance liquid chromatographic method with radioimmunoassays for parent drug and some of its major metabolites", Therapeutic Drug Monitoring, Vol 9, No 3, pages 358-365 28 A C Moffat (1986), Clarke's Isolation and Identification of Drugs in pharmaceuticals, body fluids and post - mortem material, The Pharmaceutical Press, London 29 Tadashi Ohkubo, Ritsuko Shimoyama and Kazunobu Sugawara (1993), "Determination of chlorpromazine in human breast milk and serum by highperformance liquid chromatography", Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, Vol 614, Issue 2, May 1993, pages 328-332 30 C Pistos, James T Stewart * (2003), "Direct injection HPLC method for the determination of selected phenothiazines in plasma using a Hisep column", Biomedical Chromatography, Vol 17, Issue 7, 16 September 2003, pages 465-470 31 M C Quintana, M H Blanco, J Lacal, L Hern¸ndez (2001), "Analysis of pharmaceutical residues in bovine liver by HPLC", Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, Vol 24, Number / 2001, pages 735-745 32 C M Riley, T W Rosanske (1996), Development and Validation of Analytical Method, Vol 33 Kevin Robards, Paul R Haddad, Peter E Jackson (2001), Principles and Practice of Modern Chromatographic Methods, Academic Press, UK 34 Smith C S, Morgan S L, Greene S V, Abramson G K (1987), "Solidphase extraction and high-performance liquid chromatographic method for chlorpromazine and thirteen metabolites", Journal of Chromatography, Vol 423, 25 December 1987, pages 207-216 35 The Merck Index, 12th edition (1996) 36 The United States Pharmacopoeia 24 (2000), pages 359-398 37 David G Watson (1999), Pharmaceutical Analysis, Churchill Livingstone, UK ... "Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định lượng clorpromazin huyết tương người" Để thực mục đích trên, đề tài nghiên cứu gồm nội dung sau: - Khảo sát quy trình chiết clorpromazin huyết tương. .. huyết tương người xây dựng chương trình HPLC để định lượng clorpromazin - Thẩm định chương trình xây dựng áp dụng định lượng clorpromazin huyết tương bệnh nhân - Chương 1: Tổng quan 1.1 Clorpromazin. .. bị - dụng cụ 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Xây dựng quy trình định lượng 23 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 25 2.3.3 Định lượng thăm dò CPZ huyết tương bệnh nhân 27 2.3.4 Ph©n tÝch