Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định lượng clorpromazin trong huyết tương người

Với mục đích góp phần vào việc xác định nồng độ của thuốc clorpromazin trong máu phục vụ cho việc theo dõi nồng độ thuốc trong máu các bệnh nhân đang điều trị tại bệnh viện, chúng tôi ti

tRƯờNG đạI HọC dƯợC hà NộI

Nguyễn Trung Nghĩa

nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích

định lượng clorpromazin trong huyết tương người

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất

Mã số : 60.73.15

Nguyễn Trung Nghĩa

nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích

định lượng clorpromazin trong huyết tương người

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất

Mã số : 60.73.15 Luận văn Thạc sĩ Dược học

người hướng dẫn khoa học:

1 PGS TS Trần Tử An

2 TS Nguyễn Thị Kiều Anh

Hà nội - 2006

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Tử An và TS Nguyễn Thị Kiều Anh, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu thực hiện đề tài

Xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, cảm ơn các thầy

cô Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Phân tích cùng các Bộ môn khác của trường Đại học Dược Hà nội đã tạo điều kiện tốt cho chúng tôi trong thời gian học tập tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo cùng các cán bộ Bộ môn Hóa phân tích đã luôn quan tâm và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu trong thời gian vừa qua

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ, khích lệ và giúp đỡ để tôi có thể có kết quả như ngày hôm nay

Hà Nội, ngày 26 tháng 12 năm 2006

Học viên cao học khóa 9, chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất

Nguyễn Trung Nghĩa

LOQ : Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

MS : Khối phổ (Mass Spectrometry)

PĐ : Pha động

PA : Tinh khiết phõn tớch (Pure for Analysis)

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SD : Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

S/N : Tớn hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise)

TƯ : Trung Ương

tR1/2 : thời gian bỏn hủy

tRmax : thời gian đạt nồng độ thuốc cực đại

UV : Tử ngoại (Ultra Violet)

VN : Việt Nam

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng Nội dung Trang

1.1 Một số phương pháp HPLC định lượng clorpromazin 19

3.2 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký 32

3.3 Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ CPZ trong huyết tương 44 3.4 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới 48

3.5 Kết quả xác định độ đ úng của phương pháp phân tích 49

3.6 Kết quả xác định độ lặp trong ngày của phép phân tích 50

3.7 Kết quả khảo sát độ lặp lại khác ngày 51

3.8 Kết quả xác định hiệu suất chiết CPZ 52

3.9 Kết quả khảo sát độ ổn định của CPZ trong thời gian phân tích 53

3.10 Kết quả khảo sát độ ổn định của CPZ trong thời gian bảo quản 54

3.11 Kết quả đ ịnh lượng thăm dò CPZ trong huyết tương bệnh nhân 55

Hình Nội dung Trang

1.1 Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 15

3.2 Sơ đồ quy trình chiết CPZ trong huyết tương 30

3.3 Kết quả khảo sát tìm dung môi chiết CPZ trong huyết tương 31

3.4 Sắc ký đồ khảo sát thời gian lắc xoáy 32

3.5 Sắc ký đồ khảo sát nhiệt độ cô bay hơi dung môi 33

3.6 Kết quả khảo sát cột sắc ký và hệ pha động cho định lượng CPZ/HT 36

3.7 Phổ hấp thụ UV của CPZ trong hệ pha động 37

3.8 Sắc đồ khảo sát sự phù hợp của hệ thống sắc ký 39

3.9 Các sắc ký đồ thể hiện tính chọn lọc của phương pháp 42

3.10 So phổ UV của pic có RRtR = 4,820 phút với phổ của CPZ chuẩn 43

3.11 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích và nồng độ CPZ trong huyết tương

44 3.12 Các sắc đồ khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của CPZ trong huyết tương

47

đặt vấn đề

Clorpromazin là một dẫn chất của nhóm phenothiazin có tác dụng chính

là hướng thần kinh điển, hiện vẫn đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam Tuy nhiên, do sự liên quan giữa nồng độ thuốc trong huyết tương với liều dùng rất khác nhau giữa các cá thể, mặt khác mối liên hệ giữa nồng độ thuốc trong huyết tương với đáp ứng lâm sàng không rõ ràng nên quá liều clorpromazin vẫn xảy ra khá phổ biến Các triệu chứng ngộ độc nặng của clorpromazin đã từng xảy ra với liều nhỏ hơn 0,1g/lần trong khi bệnh nhân có thể phải dùng tới liều 1g/ngày thậm chí 2g/ngày hoặc cao hơn nữa [6], [19] Nồng độ clorpromazin trong huyết tương với liều điều trị dao động từ 0,03 - 0,3μg/mL, triệu chứng ngộ độc có thể xuất hiện ở nồng độ từ 0,5 - 2μg/mL và nồng độ ≥ 2μg/mL có thể gây tử vong Một nghiên cứu trên 8 ca tử vong cho thấy nồng độ clorpromazin trong máu toàn phần dao động từ 3 - 35μg/mL (trung bình 17μg/mL) [18], [28]

Với mục đích góp phần vào việc xác định nồng độ của thuốc clorpromazin trong máu phục vụ cho việc theo dõi nồng độ thuốc trong máu các bệnh nhân đang điều trị tại bệnh viện, chúng tôi tiến hành đề tài:

"Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định lượng clorpromazin trong huyết tương người"

Để thực hiện mục đích trên, đề tài nghiên cứu gồm các nội dung sau:

- Khảo sát quy trình chiết clorpromazin trong huyết tương người và xây

dựng chương trình HPLC để định lượng clorpromazin

- Thẩm định chương trình đã xây dựng và áp dụng định lượng

clorpromazin trong huyết tương bệnh nhân

-

(CR 17 RHR 19 RClNR 2 RS)R 2 RCR 23 RHR 16 ROR 6 R (M=1026.1) Trong thực tế thường gặp thuốc dưới dạng hydroclorid

- Clorpromazin embonat

+ Dạng bột màu vàng nhạt

+ Rất ít tan trong nước, tan trong aceton

- Clorpromazin hydroclorid (tên khác Aminazin)

+ Dạng bột kết tinh màu trắng đến trắng kem, không mùi, vị rất đắng Bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng và không khí (chuyển màu dần sang vàng đến hồng và cuối cùng là tím)

+ Hấp thụ UV: λR max R = 254nm và 306nm [4], [7], [11], [12], [17]

được hấp thu chủ yếu ở hỗng tràng và phụ thuộc vào pH Trong một nghiên cứu, khi bệnh nhân được dùng các thuốc kháng HR 2 R (như cimetidin, famotidin, nizatidin) thì nồng độ clorpromazin trong huyết tương giảm Clorpromazin dùng đường uống bị chuyển hóa qua gan lần đầu đáng kể, có thể dùng đường

sau 30 - 60 phút bắt đầu có tác dụng dược lý và tác dụng kéo dài từ 4 - 6 giờ Dạng thuốc đặt xuất hiện tác dụng chậm hơn và thời gian tác dụng ngắn hơn,

từ 3 - 4 giờ Dạng tác dụng kéo dài có tác dụng trong khoảng 10 - 12 giờ Nồng độ clorpromazin huyết tương đạt đỉnh sau 2-4 giờ sau uống với liều

điều trị Nồng độ đỉnh này kéo dài khoảng 3-4 giờ nữa và sau đó giảm dần + Phân bố: clorpromazin được phân bố rộng trong hầu hết các mô và dịch của cơ thể, thuốc có thể qua hàng rào máu não và nồng độ trong não cao hơn nồng độ trong huyết tương Clorpromazin liên kết protein huyết tương khoảng 95 - 98%, chủ yếu là liên kết albumin, có tài liệu cho rằng nó kết hợp với albumin huyết tương tới 99% Bình thường với liều điều trị, nồng độ clorpromazin huyết tương từ khoảng 0,03 - 0,3àg/mL Clorpromazin và các sản phẩm chuyển hóa của nó có thể qua nhau thai và vào được sữa mẹ

+ Chuyển hóa và thải trừ: clorpromazin được chuyển hóa chủ yếu tại gan bởi các quá trình hydroxyl hóa và liên hợp glucuronic, N - oxy hóa, oxy hóa nguyên tử sulfur và khử alkyl hóa, khử methyl hóa Có hơn 15 chất chuyển hóa của clorpromazin đã được xác định, nửa số đó thải trừ qua nước tiểu và phân Vài sản phẩm có hoạt tính như 7- hydroxyclorpromazin, còn sản phẩm khác như clorpromazin sulfoxid thì bất hoạt Bệnh nhân đáp ứng thuốc

có nồng độ cao các chất chuyển hóa có hoạt tính nhưng sulfoxid thì thấp Có hai nhóm sản phẩm chuyển hóa chính của clorpromazin được phát hiện trong nước tiểu Nhóm thứ nhất là các sản phẩn không liên hợp, gồm demonomethylclorpromazin, dedimethylclorpromazin, các sản phẩm chuyển hóa dạng sulfoxid, clorpromazin N-oxid và clorpromazin nguyên dạng, chiếm khoảng 20% Nhóm thứ hai là các sản phẩm liên hợp, chiếm khoảng 80%, gồm chủ yếu các O-glucuronid và một số ít các ether sulfat của các dẫn chất mono và dihydroxy của clorpromazin và các chất chuyển hóa sulfoxid của nó Hai chất chuyển hóa chủ yếu được tìm thấy trong nước tiểu là monoglucuronid của N- dedimethylclorpromazin và 7- hydroxyclorpromazin

Các sản phẩm chuyển hóa của phenothiazin thường là thân dầu, có thể tích phân bố lớn, do vậy thời gian lưu tại các mô tăng và lâu thải trừ, mặc dù TR 1/2 Rcủa clorpromazin khoảng 30 giờ nhưng các chất chuyển hóa vẫn có thể được phát hiện trong nước tiểu ở tuần thứ sáu sau liều cuối cùng [3], [6], [18], [19]

- Cơ chế tác dụng

Sinh lý học của hoạt động thần kinh trung ương và sinh bệnh học của rối loạn tâm thần (bệnh tâm thần phân liệt) còn chưa được biết rõ Tuy nhiên, người ta nhận thấy rằng sự cân bằng giữa hệ tiết dopamin trung ương và hệ tiết serotonin trung ương có vai trò quyết định đến các triệu chứng của bệnh tâm thần phân liệt

+ Trên hệ tiết dopamin (DA) trung ương

• Các thuốc cường hệ DA (amphetamin, cocain, DOPA ) đều làm tăng triệu chứng bệnh

• Các thuốc hủy hệ DA, đặc biệt là các receptor thuộc nhóm DR 2 R (gồm DR 2 R, DR 3 R,

DR 4 R) như các thuốc an thần kinh đều làm giảm các triệu chứng của bệnh

+ Trên hệ tiết serotonin (5HT) trung ương

Có tới 15 loại receptor 5HT, nhưng với bệnh tâm thần thì receptor 5HTR 2 R (đặc biệt là 5HTR 2A R) có vai trò quan trọng hơn cả Trong não, nhân tổng hợp 5HT nhiều nhất (có thể là duy nhất) là các nhân Raphe (Raphe nuclei) Các nhân này kiểm soát sự tổng hợp DA ở cả thân tế bào và sự giải phóng DA

ở trước synap của các nơron hệ DA Nhìn chung, 5HT ức chế giải phóng DA Giả thuyết sinh hóa về bệnh tâm thần phân liệt cho rằng, các triệu chứng dương tính là do tăng hoạt hệ DA ở hệ viền và mất cơ chế điều hòa ngược trung ương, còn các triệu chứng âm tính là do rối loạn chức phận vùng trán trước, làm giảm hoạt hệ DA não giữa - vỏ não do tăng hoạt hệ 5HTR 2 R Clorpromazin ức chế DR 2 R mạnh hơn 5HT nhiều nên tác dụng trên triệu chứng

dương tính mạnh, ít tác dụng trên triệu chứng âm tính, mặt khác lại gây tác dụng phụ ngoài bó tháp [3], [6], [18], [19]

- Tác dụng dược lý

+ Trên hệ thần kinh trung ương

• Clorpromazin gây trạng thái đặc biệt thờ ơ về tâm thần vận động và cũng giống như nhiều thuốc an thần chủ yếu khác, clorpromazin cũng có tác dụng

an thần gây ngủ khá rõ Tuy nhiên, các thuốc này không được dùng với mục

đích này vì các tác dụng phụ trên hệ thần kinh và hệ vận động Nó làm giảm các hoạt động vận động và các sự bận tâm, ưu tư mà vẫn giữ được tương đối các hoạt động về trí tuệ và sự cảnh giác Người dùng thuốc tỏ ra không quan tâm đến môi trường xung quanh, không biểu lộ xúc cảm, trong khi phản xạ tủy và phản xạ không điều kiện với kích thích đau vẫn giữ được

• Thuốc làm giảm được ảo giác, thao cuồng, vật vã do đó thuốc có tác dụng với bệnh tâm thần phân liệt

• Clorpromazin gây hội chứng ngoại tháp, giống bệnh Parkinson, biểu hiện bằng động tác cứng đơ, tăng trương lực cơ

• Gây hạ thân nhiệt do ức chế trung tâm điều nhiệt ở hạ khâu não

• Chống nôn do ức chế trung tâm nôn ở sàn não thất IV

• ức chế trung tâm trương lực giao cảm điều hòa vận mạch

• Trên vận động, liều cao gây trạng thái giữ nguyên thế (catalepsia)

+ Trên hệ thống thần kinh thực vật

Vừa có tác dụng hủy phó giao cảm, vừa có tác dụng phong toả receptor αR 1 Radrenergic ngoại biên Tác dụng hủy phó giao cảm thể hiện bằng nhìn mờ (do giãn đồng tử), táo bón, giảm tiết dịch vị, giảm tiết nước bọt, mồ hôi Tác dụng hủy αR 1 R adrenergic tương đối có ý nghĩa, có thể phong tỏa tác dụng tăng áp của noradrenalin

+ Trên hệ nội tiết

• Làm tăng tiết prolactin, gây chảy sữa và chứng vú to ở đàn ông

• Làm giảm tiết FSH và LH, có thể gây ức chế phóng noãn và mất kinh

+ Có tác dụng kháng histamin HR 1 R nhưng yếu [3], [6], [19]

- Tác dụng không mong muốn

+ Loại thường gặp, liên quan đến tác dụng dược lý

• Rối loạn tâm lý: chóng mệt mỏi, suy nghĩ chậm chạp, trạng thái trầm cảm,

lú lẫn (nhất là người có tuổi)

• Tụt huyết áp thế đứng và nhịp tim nhanh, nhất là khi tiêm

• Khô miệng, nuốt khó, bí đái, rối loạn điều tiết thị lực, cơn tăng nhãn áp cấp, táo bón là những dấu hiệu hủy phó giao cảm

• Rối loạn điều tiết và sinh dục: ức chế phóng noãn, vô kinh, chảy sữa, giảm tình dục, tăng cân

• Hội chứng ngoại tháp: thay đổi tùy thuộc vào thời gian điều trị, vào liều lượng, thuốc phối hợp và tuổi, giới

+ Loại không phụ thuộc vào tác dụng dược lý

• Giảm bạch cầu

• Vàng da tắc mật, xuất hiện giữa tuần thứ 2 đến thứ 4, giảm dần khi ngừng thuốc, nguyên nhân có thể là do phù nề các đường dẫn mật do phản ứng quá mẫn vì không phụ thuộc vào liều

• Phản ứng ngoài da: dị ứng, mẫn cảm với ánh nắng, đọng sắc tố trong tiền phòng của mắt

• Loạn nhịp tim: nhịp nhanh xoang (điều trị bằng propranolol), nhĩ thất phân

- Khoa gây mê: tiền mê, gây mê hạ thân nhiệt, hạ huyết áp

- Khoa nội: chống nôn, chống đau, an thần, chống rung tim

- Khoa da liễu: chống ngứa [3], [6], [11], [19]

1.1.5 Một số dạng chế phẩm bào chế và biệt dược chứa CPZ

Các dạng chế phẩm bào chế:

+ Viên nén hoặc bọc đường 10, 25, 50, 100 và 200 mg

+ Viên nang tác dụng kéo dài 30, 75, 150, 200 và 300mg

+ Amplictil (Rhodia, Brasil)

+ Chloractil (DDSA, Anh)

+ Largactil (Pháp; Italia)

+ Plegomazine (Egis, Hungary)

+ Procalm (Bramble, Australia)

+ Promexin (Meiji, Nhật)

+ Promosol (Horner, Canada)

+ Prozil (Dumex, Đan Mạch)

+ Thorazine (Smith Kline & French)

điểm của phương pháp này đã được biết rõ

Ưu điểm là giá thành thấp, dịch chiết phù hợp với hệ thống sắc ký và có thể dễ dàng thay đổi dung môi để có độ chọn lọc cao Tuy nhiên, kỹ thuật này cũng có một số nhược điểm liên quan đến việc sử dụng dung môi, như phải sử dụng một lượng lớn dung môi, trong đó thường gặp nhiều dung môi độc và dễ cháy, dẫn đến các vấn đề về xử lý chất thải và môi trường Hơn nữa, trong thực tế, chiết lỏng - lỏng có thể tạo thành dạng nhũ dịch, là một vấn đề khó xử

lý, đặc biệt khi nhũ bền và không thể phá nhũ bằng các kỹ thuật như làm lạnh, lọc, ly tâm hay thêm một thể tích nhỏ dung môi hữu cơ khác

- Cơ chế chiết xuất: là quá trình phân bố hay hòa tan đồng thời một

chất ở hai pha lỏng không trộn lẫn khi chúng tiếp xúc với nhau Năng lượng

tồn tại giữa các phân tử dung môi và chất tan, cân bằng pha được thiết lập trên cơ sở cân bằng của các tương tác đó Có 3 yếu tố chính tác động lên quá trình chiết xuất, đó là:

+ Lực Van der Waals

+ Quá trình solvat hóa

+ Tương tác hóa học

- Các thông số đặc trưng cho quá trình chiết:

+ Hằng số phân bố (D)

+ Hiệu suất chiết một lần (RR 1 R)

- Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết:

+ Nhiệt độ

+ Tác động của các chất hòa tan khác

+ Các yếu tố liên quan đến chất tan

- Kỹ thuật chiết xuất: có thể chia ra làm 3 loại

+ Chiết gián đoạn

+ Chiết liên tục

+ Chiết ngược dòng [1], [5], [15], [28], [37]

1.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography:

HPLC)

Lịch sử của sắc ký: năm 1903, Tswett - nhà hóa sinh người Nga đã phát

triển một kỹ thuật tách mới bằng cách cho hỗn hợp cần tách qua một cột được nhồi với chất hấp phụ dạng bột mịn Hỗn hợp được đưa lên đỉnh cột, sau đó rửa cột với dung môi hữu cơ Cùng với quá trình rửa, các thành phần của hỗn hợp trôi xuống với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau Hầu hết các mẫu của Tswett là chất màu thực vật, do đó các dải màu tạo thành khi các hợp chất

tách ra trên cột được nhìn thấy dễ dàng, trông giống như một sắc đồ và vì vậy phương pháp này được mang tên sắc ký (Chromatography, trong tiếng Hy Lạp, chroma là màu, graphein là viết) Tên gọi này ngày nay vẫn được sử dụng mặc dù phương pháp này còn được dùng tách các chất không màu Tswett giải thích sự tách là do các phân tử chất rửa giải được hấp phụ trên bề mặt của bột nhồi trong cột, các chất này có ái lực mạnh với chất rắn và không dễ bị giải hấp phụ bởi dung môi do đó các hợp chất di chuyển chậm trong cột Các chất hấp phụ yếu hơn di chuyển với tốc độ lớn hơn, do đó sự tách đạt được do

ái lực khác nhau giữa chất rửa giải với dung môi và chất rắn hấp phụ

Công trình của Tswett là dạng sắc ký hấp phụ trên cột Ngày nay, nhiều phương pháp sắc ký đã được phát triển và hoàn thiện như sắc ký lớp mỏng, sắc

ký giấy, sắc ký khí, sắc ký lỏng; nhưng chúng đều dựa trên nguyên tắc đơn giản là: sự tách đạt được là do tốc độ di chuyển khác nhau gây nên bởi ái lực tương đối khác nhau giữa hai pha Năm 1952, máy sắc ký khí đầu tiên được

ra đời dưới sự chủ trì của giáo sư Keulemann và các cộng tác viên, bài báo đầu tiên về sắc ký khí được công bố bởi James và Martin cũng cùng năm đó Phương pháp này được phát triển mạnh vào những năm 60 và ngày nay đã trở nên hoàn thiện và được sử dụng rộng rãi Sắc ký lỏng hiệu năng cao ra đời muộn hơn vào cuối những năm 60, khi công nghệ sản xuất được chất nhồi cột

có cỡ hạt 10μm, có hiệu suất tách rất cao, nhưng cỡ hạt bé đòi hỏi phải dùng bơm để nén dung môi qua cột và với loại chất nhồi mới này ta có phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hay sắc ký lỏng cao áp) Sắc ký lỏng hiệu năng cao tuy ra đời muộn hơn nhưng ngày nay cũng đã được hoàn thiện và dần thay thế sắc ký khí trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong phân tích dược phẩm

1.3.1 Nguyên lý

HPLC dựa trên nguyên lý sắc ký nói chung, là kỹ thuật tách các chất trong hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau của các chất với hai pha: pha tĩnh rắn

và pha động lỏng Quá trình tách theo các cơ chế phân bố, hấp phụ hay trao

đổi ion tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích và pha tĩnh sử dụng

Đặc trưng của kỹ thuật là cột được nhồi với các tiểu phân có kích thước nhỏ (thường từ 3 - 10μm), quá trình rửa giải dung môi diễn ra dưới áp suất cao và

đạt được hiệu quả tách tốt hơn so với sắc ký lỏng thông thường, vì vậy kỹ thuật được gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao cũng tương tự như các dạng sắc ký khác, có một pha tĩnh (có thể là chất rắn hoặc lỏng) và một pha động (là chất lỏng) và sự tách cũng dựa trên nguyên tắc cơ bản là do có sự phân bố của chất phân tích trong hai pha tĩnh và động Các chất có ái lực lớn với pha tĩnh thì lưu giữ lâu hơn và ngược lại, do đó sự tách đạt được là do các thành phần trong hỗn hợp

di chuyển với tốc độ khác nhau do có hệ số phân bố giữa hai pha khác nhau Trong sắc ký lỏng có thể xảy ra cả 4 cơ chế tách là phân bố, hấp phụ, trao đổi ion hoặc loại theo cỡ

- Sắc ký phân bố lỏng - lỏng (liquid - liquid partitioning): pha tĩnh cũng

là chất lỏng và được bao trên bề mặt của các hạt chất mang (support) tức là

được hấp phụ trên chất mang Trong sắc ký này, pha tĩnh thường bị dung môi hòa tan và mất dần (hiện tượng "chảy máu cột") và làm cột mất dần hiệu lực Phương pháp này hiện nay ít được sử dụng

- Sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography: BPC): pha tĩnh

được sử dụng là các hạt silicagel có đường kính 3 -10àm, các hạt phải đồng

đều, có dạng hình cầu và phải xốp, bề mặt của hạt có các nhóm silanol và các tạp kim loại Silicagel có thể được sử dụng trực tiếp để tách sắc ký, trong trường hợp này cơ chế tách chủ yếu là hấp phụ kết hợp với liên kết phân cực,

ta có sắc ký pha thuận Sử dụng phổ biến hơn là gắn hóa học silicagel với một alkylsilan tạo nên hợp chất cơ siloxan Nếu gốc gắn vào có tính phân cực tạo nên pha tĩnh có tính phân cực thì sử dụng pha động là các dung môi ít phân cực ta có sắc ký pha thuận (normal phase); ngược lại, nếu gốc gắn vào là ít phân cực ta thu được pha tĩnh kỵ nước và khi sử dụng pha động là dung môi phân cực ta có sắc ký pha đảo (reversed phase) Trong thực tế, thường gặp sắc

ký pha đảo vì một số ưu điểm như: tính linh động cao, độ chọn lọc cao; cân bằng phân bố xảy ra nhanh, có thể sử dụng các cân bằng phụ để tăng cường độ chọn lọc của phương pháp; hiệu quả tách cao, pic cân đối; pha động thường là hỗn hợp của nước và các dung môi phân cực nên rẻ tiền Tuy nhiên phương pháp cũng còn một số nhược điểm như: độ lặp lại kém, hoạt động của pha tĩnh

có hiệu quả trong khoảng pH hẹp (pH: 2 - 8) và cơ chế tách phức tạp

biến Trong phương pháp này, chất tan bị giữ trên bề mặt pha tĩnh (chất hấp phụ) và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ) Pha tĩnh thường dùng là bột mịn của silicagel hoặc nhôm oxyd nhưng silicagel được ưa dùng hơn Các chất càng phân cực càng bị lưu giữ mạnh và ra chậm hơn trong quá trình rửa giải, các dung môi càng phân cực càng có sức rửa giải mạnh

* Sắc ký trao đổi ion: các nhựa trao đổi ion được dùng làm pha tĩnh

+ Ionid loại 1: thể hiện tính chất như 1 acid mạnh hoặc 1 base mạnh Có thể làm việc ở mọi giá trị pH và hấp dung ít thay đổi theo pH, thường là ionid

đơn chức

+ Ionid loại 2: thể hiện tính chất như 1 acid yếu hoặc 1 base yếu Đặc

điểm là làm việc ở một giá trị pH nhất định, hấp dung ít thay đổi theo pH và cũng thường đơn chức

+ Ionid loại 3: thể hiện tính chất như 1 hỗn hợp acid mạnh và yếu hoặc

1 hỗn hợp base mạnh và yếu Thường đa chức, có 2 giá trị hấp dung

+ Ionid loại 4: thể hiện tính chất như một hỗn hợp nhiều acid yếu có KR a Rkhác nhau hoặc một hỗn hợp base yếu có KR b R khác nhau, vì vậy hấp dung của ionid thay đổi dần

Các ionid không tan trong nước, khi tiếp xúc với dung dịch hỗn hợp ion thì xảy ra sự trao đổi, sau đó dùng dung dịch acid hoặc base làm dung dịch rửa giải thì sẽ phản hấp phụ các ion và xảy ra quá trình hồi nguyên (tái sinh) ionid

Có 3 loại chất nhồi cột trao đổi ion trong sắc ký lỏng hiệu năng cao: + loại hạt xốp nhựa ionid có khung polystyren

+ loại hạt xốp silicagel có gắn các nhóm trao đổi ion

+ loại hạt thủy tinh gắn chất trao đổi ion

* Sắc ký loại theo cỡ: là phương pháp mới được phát triển và chủ yếu áp

dụng cho phân tích các chất có phân tử lượng lớn Chất nhồi chủ yếu là các gel, trong gel có các lỗ xốp, các phân tử lớn nằm ngoài lỗ xốp di chuyển dễ dàng theo dung môi, các phân tử nhỏ hơn có thể nằm một phần trong lỗ xốp, các phân tử nhỏ nữa có thể chui hoàn toàn vào trong lỗ xốp và khó di chuyển theo dung môi do đó khi rửa giải các phân tử sẽ ra lần lượt theo cỡ từ lớn đến nhỏ Các gel ưa nước được dùng với pha động là dung dịch nước và phương pháp được gọi là sắc ký lọc trên gel Nếu các gel kỵ nước thì dùng pha động là

các dung môi hữu cơ không phân cực và phương pháp gọi là sắc ký thẩm thấu trên gel

1.3.2 Thiết bị

U

Hình 1.1:USơ đồ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

* Bình chứa dung môi: thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không

gỉ Dung môi cần được lọc loại các hạt vẩn và phải đuổi khí hòa tan ngay trước khi sử dụng Khí hòa tan có thể làm biến dạng các pic, sinh bọt khí trong bơm và detectơ, làm nhiễu đường nền và có thể làm xuất hiện các pic lạ Có thể đuổi khí bằng nhiều cách như: siêu âm, đun nóng và khuấy, sục khí trơ (He), lọc dưới áp suất giảm nhưng chú ý tránh làm thay đổi nồng độ các dung môi dễ bay hơi của pha động Nên đặt bình chứa dung môi ở vị trí cao hơn so với bơm để tạo áp suất dương

* Hệ thống bơm: lưu lượng dòng qua cột thường từ 0,1 - 3mL/phút do

đó bơm phải tạo được áp suất cao (3000 - 6000 psi hay khoảng 200 - 250 atm) Vật liệu làm bơm có thể bằng thép không gỉ hay các polymer như PTFE hoặc PEEK, thép không gỉ chịu được áp suất tới 6000 psi nhưng nhược điểm

là có thể sinh các tạp ion kim loại và các protein có thể bị hấp phụ vào bề mặt kim loại, các polymer không có các nhược điểm này, có thể chịu được các pha

động có tính ăn mòn (như HCl) nhưng chỉ chịu được áp suất từ 2000 - 4000 psi và lại rất đắt tiền Bơm có thể là "áp suất hằng định" hay "tốc độ dòng hằng định", loại "tốc độ dòng hằng định" thuận tiện hơn do dễ thay đổi cột có kháng áp khác nhau và các loại dung môi có độ nhớt khác nhau Loại bơm

được sử dụng rộng rãi nhất có pit-tông điện, có dòng hằng định được kiểm

soát bởi mô tơ tốc độ, các bơm chỉ có 1 pit-tông thì dòng bị dao động, để có dòng ổn định bơm cần có 2 hoặc 3 pit-tông

* Hệ tiêm mẫu:

- Xy lanh tiêm (syringe injection): có thể tiêm trực tiếp qua một tấm

đệm đàn hồi (septum injection) giống như trong sắc ký khí, bị giới hạn áp suất

do đó thường tiêm dưới áp suất thấp hoặc dùng phương pháp "dừng dòng" (stop flow), tuy nhiên phương pháp vẫn có độ lặp lại kém và không ổn định

- Van tiêm (valve injectors): gồm van chuyển nối với vòng chứa mẫu (sample loop), khi van ở vị trí "nạp" (load) mẫu được đưa vào vòng chứa (loop) và dòng dung môi từ bơm tới cột đi qua một đoạn khác của van; khi van chuyển sang vị trí "tiêm" (inject), vòng chứa mẫu được nối vào dòng giữa bơm

và cột Vòng chứa mẫu có dung tích xác định và chính xác, độ lặp lại tốt khi thể tích hoàn toàn chứa mẫu

- Tiêm tự động (autoinjector hay autosampler): có khả năng tiêm nhiều mẫu theo chương trình định sẵn một cách chính xác, tuy nhiên nhược điểm là

đắt tiền

* Cột: thường bằng thép không gỉ có mặt trong nhẵn, ưu nhược điểm

của thép không gỉ giống như đã nói ở phần bơm nên khi tách các protein thường dùng cột thủy tinh hoặc trong sắc ký trao đổi ion thường dùng cột bằng polymer (PEEK hay teflon) Cả cột polymer và cột thủy tinh đều chịu áp suất kém do đó không nên sử dụng ở áp suất cao hơn áp suất nhà sản xuất khuyên dùng Cột thường dài 5 - 30cm, đường kính trong 2 - 5mm, cột càng dài thì hiệu lực phân giải càng lớn tuy nhiên thời gian sắc ký kéo dài hơn, các cột có đường kính trong 1 - 2mm (narrow bore or microbore columns) hoặc nhỏ hơn được sử dụng khi yêu cầu độ nhạy cao, lượng mẫu có ít Chất nhồi cột khác nhau phụ thuộc loại sắc ký như đã nói ở phần nguyên lý sắc ký lỏng, tuy nhiên được sử dụng phổ biến là các dạng silicagel, cỡ hạt thường từ 3 - 10μm

* Detector: có 4 loại detector được sử dụng rộng trong HPLC là

detector quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV - VIS), detector huỳnh quang (fluorescene), detector đo chỉ số khúc xạ (refractive index: RI) và detector

điện hóa (electrochemical)

- Detector quang phổ UV - VIS: sử dụng trong phân tích các chất có khả năng hấp thụ bức xạ tử ngoại hoặc khả kiến, độ hấp thụ thay đổi tỷ lệ với nồng độ chất theo định luật Lambert - Beer Detector dạng này có thể được phân loại theo tần số bức xạ đo: detector tử ngoại (λ: 190 - 400nm), detector khả kiến (λ: 400 - 800nm) Cách phân loại nữa dựa vào khả năng cho các bước sóng đo:

+ Detector có bước sóng cố định (fixed wavelength): là loại đơn giản nhất, đèn thủy ngân thường được sử dụng trong detector này, λ = 254 là bước sóng sử dụng phổ biến nhất, thống kê cho thấy gần 2/3 các hợp chất hữu cơ trong phân tích HPLC có khả năng hấp thụ bức xạ này, đặc biệt là các hợp chất thơm

+ Detector có bước sóng thay đổi (variable wavelength): có khả năng cho các bước sóng khác nhau để điều chỉnh theo đặc điểm hấp thụ khác nhau của các chất (điều chỉnh về cực đại hấp thụ của chất để tăng độ nhạy) Để có khả năng này, người ta sử dụng một nguồn sáng liên tục (thường là đèn D2) và

bộ đơn sắc phù hợp (thường dùng cách tử)

+ Detector quét (scanning): là một dãy các bước sóng thay đổi cho một phổ hấp thụ của một chất rửa giải để kiểm tra khi 2 chất rửa giải ra đồng thời như 1 pic Phổ hấp thụ đo được bằng cách dừng dòng pha động khi chất rửa giải nằm trong detector và quét dải sóng đo độ hấp thụ

+ Detector mảng diod (photodiode array detector: PDA): cho khả năng quét cực nhanh dải sóng để thu được phổ hấp thụ ngay cả khi dòng pha động vẫn liên tục chạy

Các detector UV - VIS cho đến nay vẫn được sử dụng phổ biến nhất trong HPLC và vẫn là sự lựa chọn hàng đầu khi mua một hệ thống HPLC

- Detector huỳng quang: khi phân tử hấp thụ năng lượng từ bức xạ ánh sáng thì chuyển lên trạng thái kích thích Trong hầu hết các trường hợp, phân

tử kích thích này bị dao động, sinh nhiệt, mất năng lượng kích thích và trở về trạng thái cơ bản Nhưng đôi khi phân tử kích thích mất năng lượng bằng cách phát ra một bức xạ ánh sáng khác, và quá trình này được gọi là phát huỳnh quang Các phân tử có cấu trúc bền và liên hợp mạnh dễ có khả năng cho huỳnh quang, thường là các hợp chất thơm và đa vòng thơm Các hợp chất tự nhiên có khả năng cho huỳnh quang rất ít cho nên dùng detector huỳnh quang thường rất đặc hiệu và có khả năng phát hiện vi lượng chất phân tích trong nền mẫu phức tạp Có thể nâng cao khả năng ứng dụng của detector huỳnh quang bằng cách sử dụng các phản ứng tạo dẫn xuất

- Detector điện hóa: trong detector này, chất rửa giải trải qua quá trình oxy hóa - khử hoặc điện phân tại bề mặt điện cực và sau đó đo dòng sinh ra

Có 3 loại detector điện hóa là detector đo thế (voltametric), đo dòng (amperometric) và đo điện lượng (coulometric) Nhược điểm chính của detector loại này là bị nhiễm bẩn bề mặt điện cực trong quá trình hoạt động Detector điện hóa được sử dụng chủ yếu ở chế độ oxy hóa, chế độ khử khó áp dụng hơn vì phải loại được oxy hòa tan trong dịch rửa giải

- Detector đo chỉ số khúc xạ: detector loại này đáp ứng với những thay

đổi về chỉ số khúc xạ (dương hoặc âm) phát sinh do sự có mặt hợp chất trong dịch rửa giải Đây là detector vạn năng nhưng độ nhạy thấp và bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ, thành phần dịch rửa giải, áp suất do đó ít được

sử dụng trong phân tích dược phẩm Tuy nhiên nó có thể được lựa chọn khi hợp chất quan tâm không hấp thụ bức xạ ánh sáng và có nồng độ cao (như các

đường trong chế phẩm thuốc)

- Ngoài ra HPLC còn có thể được ghép nối với các detector khác như tán xạ ánh sáng bay hơi (evaporative light scattering detector: ELSD), đo độ dẫn điện (conductivity detector) hay khối phổ (MS) để nâng cao năng lực của HPLC [5], [10], [14], [15], [26], [28], [33], [37]

- Pha động: 87,5% acetonitril, 5% methanol, 3% 0,12 M natri acetat, 3%

- Chuẩn nội: methyl paraben hoặc propyl paraben

- Tốc độ dòng: 1mL/phút

- Detector UV: λ = 254nm

[21] người và chuột Huyết tương Symmetry C18 (250 x 4,6mm;

- Dung môi chiết: tert - butyl methyl ether

- Pha động: acetonitril : amoni acetat 0,05M (35 : 65) (pH = 4,2)

- Tốc độ dòng: 1,2mL/phút

- Detector huỳnh quang

[22] Huyết tương người Symmetry C18 (250 x 2,1mm;

- Dung môi chiết: tert - butyl methyl ether

- Pha động: acetonitril : amoni acetat 0,05M chứa 0,005M acid sulfonic (38 : 62)

- Chuẩn nội: zusuquidar.HCl

- Tốc độ dòng: 0,2mL/phút

- Detector huỳnh quang: bước sóng kích thích là 260nm và bước sóng phát xạ là 460nm

[23] Huyết tương người

Chromolith Speed ROD C18 (50 x 4,6

- Chiết lỏng - lỏng

- Pha động: methanol : nước (80 : 20 v/v)

- Detector UV: λ = 240nm

[30] Huyết tương người Hisep

- Mẫu huyết tương chỉ được lọc sau đó tiêm thẳng vào hệ sắc ký

- Pha động: 15:85 v/v acetonitril : 0,18M ammoni acetate (pH 5,0)

- Detector UV: λ = 254nm

[27] Huyết tương người

Ultrasphere -

CN (250 x 2,1mm;

- Chuẩn nội: mesoridazin

- Phương pháp HPLC trong các tài liệu [13], [24] tương đối đơn giản, không

có khâu xử lý mẫu, thời gian chạy sắc ký kéo dài (> 30 phút) do đó chỉ thích hợp để áp dụng cho phân tích CPZ trong dung dịch chế phẩm

- Các công trình [21], [22] áp dụng tốt cho huyết tương người tuy nhiên sử dụng phương pháp tạo cặp ion trong quá trình sắc ký là phương pháp khá tốn kém và dùng detector huỳnh quang cũng là loại detector ít được trang bị trong

- Công trình [23] cũng áp dụng tốt không những cho CPZ mà còn có thể sử dụng để định lượng cho 48 chất trong huyết tương, giới hạn định lượng tốt (0,27ng/ml), hiệu suất chiết cao (96%) tuy nhiên detector khối phổ là trang bị hiện đại, đắt tiền và ít được trang bị cho các phòng thí nghiệm tại Việt Nam

- Theo tài liệu [30], mẫu huyết tương không cần xử lý nhiều, chỉ cần lọc sau

đó tiêm thẳng vào hệ sắc ký, thời gian chạy sắc ký ngắn (< 11 phút), tuy nhiên tác giả phải sử dụng loại cột đặc biệt (cột Hisep) và sắc ký đồ nhiều tạp, giới hạn định lượng đạt chưa cao (0,25μg/mL tính theo S/N)

- Công trình [31] có chương trình sắc ký đơn giản, detector UV rất phổ biến tuy nhiên đối tượng phân tích là gan bò và thời gian sắc ký lâu, chưa đề cập

đến hiệu suất chiết và thẩm định phương pháp nên không phù hợp đối với phân tích định lượng CPZ trong huyết tương người

- Theo tài liệu [27], sử dụng phương pháp chiết lỏng - lỏng đơn giản, pha động

dễ chuẩn bị, detector UV thông dụng, cột CN đường kính hẹp nên tốc độ dòng nhỏ, tiết kiệm dung môi, tuy nhiên phương pháp cũng chưa được thẩm định

đầy đủ

- Theo tài liệu [25], loại cột phân tích và pha động sử dụng là thông dụng, thời gian phân tích tốt, độ nhạy cao nhưng sử dụng detector điện hóa, ít được trang

bị ở các phòng thí nghiệm của Việt Nam

Tóm lại, trên cơ sở tham khảo các phương pháp HPLC định lượng CPZ

đã được công bố chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng CPZ trong huyết tương người với quy trình xử lý mẫu sử dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng và tiến hành sắc ký trên hệ thống HPLC - detector diod array để phù hợp với điều kiện trang thiết bị và khả năng kinh phí Sau đó tiến hành thẩm định phương pháp để đảm bảo phương pháp được áp dụng vào định lưọng CPZ/HT bệnh nhân một cách chính xác

chương 2

Đối tượng - phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích CPZ trong huyết tương người, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các đối tượng sau:

- Mẫu trắng: là huyết tương người của viện Huyết học và truyền máu TƯ-VN

- Mẫu chuẩn: là mẫu trắng được thêm CPZ tạo thành dung dịch chuẩn

có nồng độ xác định

- Mẫu thử: là huyết tương bệnh nhân có sử dụng clorpromazin

2.2 Hoá chất - trang thiết bị

Dung

môi

cho

HPLC

Các

loại

muối

2.2.2 Thiết bị - dụng cụ

- Hệ thống HPLC Merck - Hitachi - Detectơ UV

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 1100 Agilent - Detector Diod Array

- Cột sắc ký

- Bộ lọc dung môi (màng lọc 0,45μm), bộ lọc mẫu (màng lọc 0,2μm)

- Máy quang phổ (Beckman DU - 640, Mỹ)

- Máy lắc siêu âm (Brasonic - Mỹ)

- Cân phân tích (Sartorius - Đức)

- Máy đo pH (Metrohm - Thụy Sĩ)

- Máy khuấy từ gia nhiệt (Ikamag)

- Máy lọc nước siêu sạch (Elga -Anh)

- Máy lắc (Labinco - Hà Lan)

- ống nghiệm lấy máu chứa EDTA và ống nghiệm có nút xoáy

- Bình định mức, pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh khác

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng quy trình định lượng

2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn

- Pha dung dịch chuẩn gốc CPZ: cân chính xác chất chuẩn clorpromazin hydroclorid (tính theo dạng base), hòa tan trong nước để được dung dịch gốc

Từ đó pha thành các dung dich chuẩn thứ cấp có nồng độ 0,5 - 25 μg/mL trong pha động Cho 10 μl dung dịch ở mỗi nồng độ vào 500 μl huyết tương trắng để khảo sát, xây dựng và thẩm định phương pháp

2.3.1.2 Khảo sát phương pháp chiết clorpromazin từ huyết tương

Từ các tính chất lý hóa của CPZ và theo các tài liệu đã công bố, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện để chiết tách CPZ từ huyết tương như sau:

- pH chiết: + kiềm hóa bằng NaOH 2M

+ kiềm hóa bằng hệ đệm carbonat 0,2M (pH = 10,6)

- Dung môi chiết: cloroform, dicloromethan và hỗn hợp hệ dung môi isopropanol : n - pentan : dicloromethan với tỷ lệ tương ứng là 5 : 49 : 46

- Thể tích dung môi chiết: 5 mL, 6 mL, 7 mL

- Thời gian lắc xoáy: 2, 5 và 10 phút

- Nhiệt độ cô bay hơi dung môi: 40 - 50P

2.3.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng CPZ trong huyết tương

* Cột sắc ký: khảo sát khả năng tách của CPZ trong huyết tương trên các cột: C18, phenyl và CN

* Pha động: dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các hệ pha động có khả năng tách, thời gian lưu phù hợp và cho các pic cân đối thuận lợi cho phân tích định lượng:

+ Hệ 1: acetonitril : amoni acetat 0,05M (9 : 1)

+ Hệ 2: natri acetat 0,06M : amoni acetat : acetonitril chứa 0,05% diethylamin (4 : 4 : 92)

+ Hệ 3: acetonitril : amoni acetat pH = 3,8 hoặc 4,2 tỉ lệ 40:60; 50:50 hay 60:40

+ Hệ 4: acetonitril : acid acetic băng : triethylamin : nước (40 : 0,5: 0,3 : 59,2) thay đổi tỷ lệ acetonitril từ 30 - 50 và thêm nước vừa đủ để thành

100

* Bước sóng (λ): là cực đại hấp thụ của CPZ trong mẫu thử, xác định cực đại hấp thụ của CPZ dựa vào phổ hấp thụ UV trong khoảng 210 - 400nm

* Tốc độ dòng: thay đổi lưu lượng pha động từ 0,5 - 2mL/phút để xác

định được tốc độ phù hợp cho một thời gian lưu tối ưu

* Thể tích tiêm mẫu: thay đổi thể tích tiêm từ 10 - 100 μl

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích

2.3.2.1 Tính phù hợp của hệ thống sắc ký

Chuẩn bị một mẫu huyết tương trắng, thêm CPZ rồi xử lý mẫu theo sơ

đồ hình 3.2, phân tích theo điều kiện sắc ký xác định trong mục 3.1.2 Tiến hành sắc ký 5 lần liên tiếp, xác định độ lệch chuẩn tương đối của các thông số: thời gian lưu, diện tích pic

2.3.2.5 Độ đúng - độ chính xác - độ tìm lại

- Độ đúng: chuẩn bị các mẫu CPZ trong huyết tương trắng ở 3 nồng độ

khảo sát, mỗi nồng độ làm 5 mẫu, xử lý mẫu theo sơ đồ hình 3.2 và tiến hành phân tích theo điều kiện sắc ký ở mục 3.1.2 rồi so sánh giá trị trung bình giữa các lần định lượng của mỗi nồng độ với giá trị thực có trong mẫu

- Độ chính xác: trong đề tài này chúng tôi tiến hành đánh giá độ chính

xác của phương pháp thông qua độ lặp lại và độ chính xác trung gian

+ UĐộ lặp lạiU: chuẩn bị các mẫu CPZ trong huyết tương trắng ở 3 nồng

độ, mỗi nồng độ làm 5 mẫu và xử lý như trong phần xác định độ đúng, sau khi tiến hành sắc ký, đánh giá độ lệch chuẩn tương đối của các mẫu theo từng nồng độ

+ UĐộ chính xác trung gianU: tiến hành tương tự như phần xác định độ lặp lại nhưng ở các ngày khác nhau

- Xác định độ tìm lại (hiệu suất chiết): tiến hành chuẩn bị mẫu và chạy

sắc ký như trong phần xác định độ đúng, song song tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn pha trong pha động ở 3 nồng độ tương ứng

2.3.2.6 Độ ổn định

Xác định độ ổn định của chất phân tích trong dịch sinh học trong thời gian phân tích và thời gian bảo quản

- Độ ổn định trong thời gian phân tích: chuẩn bị 3 mẫu CPZ trong

huyết tương trắng ở nồng độ 1μg/mL, xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký ngay và tiếp tục cứ mỗi giờ 1 lần trong vòng 5 giờ

- Độ ổn định trong thời gian bảo quản: chuẩn bị 3 mẫu như phần trên

nhưng với thể tích lớn hơn gấp 4 lần, lấy 1 phần ra xử lý và tiến hành sắc ký ngay sau khi pha, phần còn lại bảo quản ở -30P

o

P

C trong 21 ngày Lấy các mẫu

đang bảo quản ra để xử lý và tiến hành sắc ký vào các ngày thứ 7, 14 và 21 [2], [8], [9], [33]

2.3.3 Định lượng thăm dò CPZ trong huyết tương bệnh nhân

Tiến hành lấy máu 18 bệnh nhân sử dụng chế phẩm có chứa CPZ (viên nén Aminazin hàm lượng 25 mg) Các bệnh nhân được điều trị nội trú tại bệnh viện Tâm thần Trung ương và máu được lấy trong giai đoạn bệnh nhân có đáp ứng tốt với thuốc và dùng thuốc với liều ổn định Mỗi bệnh nhân được lấy máu

ở 2 thời điểm, trước uống thuốc 30 phút và sau uống thuốc 4 giờ Lấy máu tĩnh mạch cánh tay vào ống nghiệm có chứa EDTA, ly tâm lấy huyết tương và

xử lý mẫu theo sơ đồ hình 3.2 và tiến hành sắc ký theo điều kiện ở mục 3.1.2

2.3.4 Phân tích số liệu thực nghiệm

Tính toán các số liệu: giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối, phương trình hồi quy và hệ số tương quan hồi quy bằng chương trình phần mềm Excel

chương 3: kết quả và bàn luận

3.1 Phương pháp định lượng clorpromazin trong huyết tương

3.1.1 Phương pháp chiết CPZ từ huyết tương

Đối với các phương pháp sắc ký, nền mẫu và quy trình xử lý mẫu có

ảnh hưởng lớn tới kết quả của phương pháp, đặc biệt là với các đối tượng mẫu phức tạp như dịch sinh học Do đó, để tiến hành định lượng CPZ trong huyết tương bằng HPLC có kết quả tốt cần xây dựng một quy trình chiết phù hợp

Sau khi tham khảo một số tài liệu và dựa vào các điều kiện hiện có, chúng tôi tiến hành khảo sát một số điều kiện chiết như trong phần 2.3.1.2 Kết quả chọn lựa các điều kiện chiết cụ thể như sau:

- Kiềm hóa: bằng hệ đệm carbonat 0,2M (pH = 10,6) vì nghiên cứu cho thấy pH = 10,6 là tối ưu để chuyển CPZ trong dung dịch về dạng phân tử Hơn nữa, sử dụng hệ đệm carbonat dễ điều chỉnh pH về đúng mức mong muốn hơn

so với dùng dung dịch NaOH 2M

- Dung môi chiết: từ kết quả trong hình 3.3 có thể thấy là sử dụng hệ dung môi isopropanol : n - pentan : dicloromethan với tỷ lệ tương ứng 5 : 49 : 46 cho hiệu suất chiết cao nhất Ngoài ra, kết quả khảo sát còn cho thấy khi chiết bằng hệ dung môi này thì độ lặp lại tốt, ít tạp, trong quá trình chiết ít bị nhũ hóa hơn so với sử dụng cloroform và dicloromethan

- Thể tích dung môi chiết: 6 mL

- Thời gian lắc xoáy: kết quả trong hình 3.4 cho thấy khi thời gian lắc xoáy là 2 phút thì lượng CPZ chiết ít hơn hẳn, pic CPZ trên sắc đồ hình 3.4a nhỏ, do thời gian lắc chưa đủ để chuyển hết CPZ/HT sang pha dung môi Khi thời gian lắc xoáy tăng lên 10 phút thì lượng CPZ chiết được cũng không nhiều hơn so với lắc xoáy trong thời gian 5 phút (pic CPZ trong hình 3.4c không lớn hơn so pic CPZ trong hình 3.4b)

Do vậy, thời gian lắc xoáy phù hợp trong quy trình là 5 phút

- Nhiệt độ cô bay hơi dung môi: kết quả sắc ký đồ trong hình 3.5 cho thấy khi cô bay hơi dung môi ở nhiệt độ từ 40 - 50P

o

P

C thì trên sắc đồ hình 3.5a chỉ có pic của CPZ, không có pic chất phân hủy của CPZ Khi tăng nhiệt độ cô bay hơi lên 80P

DÞch chiÕt dung m«i