XÂY DỰNG QUY TRÌNH REALTIME PCR XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG BẢN SAO GEN SMN2 Ở NGƯỜI VIỆT NAM

Việc phát hiện gen SMN2 bằng kỹ thuật sinh học phân tử mà cụ thể là bằng phương pháp real-time PCR nhanh, nhạy sẽ giúp cho việc khảo sát được ảnh hưởng của các bản sao của gen SMN2 đến m

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

[\

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG BẢN SAO GEN SMN2

Ở NGƯỜI VIỆT NAM

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : PHAN THỊ PHƯƠNG THANH

Niên khóa : 2006 – 2010

Tháng 7 năm 2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

[\

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG BẢN SAO GEN SMN2

Ở NGƯỜI VIỆT NAM

Tháng 7 năm 2010

Em xin chân thành cảm ơn và xin gửi lời tri ân sâu sắc Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh và tất cả quý thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học đã dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học vừa qua

Em xin chân thành cảm ơn cô Lê Huyền Ái Thúy, anh Nguyễn Văn Hưng đã truyền đạt kiến thức và hướng dẫn, chỉ bảo nhiệt tình cho em những kiến thức quý báu

Em xin chân thành cảm ơn Giáo sư Maria Jędrzejowsk, giáo sư Monica Stravarachi, giáo sư Wang Wenlan, giáo sư Zilfalil Bin Alwin đã cung cấp nguồn vật liệu thí nghiệm và hướng dẫn cho em để em có thể hoàn thành tốt đề tài này

Em xin cảm ơn Ban Giám Đốc cùng toàn thể các anh chị trong công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian thực hiện khóa luận

Xin gửi đến các bạn cùng làm khóa luận lời cảm ơn đã giúp đỡ chia sẻ những

khó khăn và đóng góp ý kiến với tôi trong suốt thời gian qua Chúc tất cả các bạn thực hiện đề tài thành công tốt đẹp

Xin cảm ơn tất cả các bạn đã chia sẻ những tâm sự, giúp đỡ, động viên và khích

lệ tôi rất nhiều trong suốt khoảng thời gian thực hiện đề tài và trong những năm tháng học tập dưới mái trường này

Xin chân thành cảm ơn Phan Thị Phương Thanh

TÓM TẮT

Teo cơ tủy sống (SMA) là bệnh di truyền gen lặn trên NST thường, gây rối loạn thần kinh, do các tế bào thần kinh kiểm soát cơ vận động trong tủy sống của người bệnh chết dần đi, dẫn đến các cơ vận động bị thoái hóa và teo dần Đây là bệnh do đột biến mất đồng hợp lặn gen SMN1 ở 94% bệnh nhân Gen SMN2 có độ tương đồng cao với gen SMN1, có mặt ở tất cả các bệnh nhân nhưng không thể bù đắp cho sự thiếu hụt gen SMN1 Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy có sự tương quan giữa số lượng bản sao gene SMN2 và mức độ trầm trọng của bệnh Số bản sao gene SMN2 càng nhiều thì các triệu chứng càng giảm Do đó, chúng tôi xây dựng một quy trình real-time PCR nhằm xác định số lượng bản sao gene SMN2, từ đó có thể dự đoán mức độ bệnh, các triệu chứng có thể và tuổi thọ của bệnh nhân

Đề tài sử dụng phương pháp real-time PCR với mẫu dò Taqman dựa trên nucleotide khác biệt giữa SMN1 với SMN2 Hệ mồi và mẫu dò sử dụng từ công trình nghiên cứu của Curet và ctv (2007) được khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trên lý thuyết

và thực nghiệm bao gồm khả năng hoạt động, nhiệt độ lai, độ nhạy và hiệu suất khuếch đại Hệ mồi- mẫu dò khi đã đạt các điều kiện cần thiết sẽ được thử nghiệm nghiên cứu trên 32 mẫu bệnh phẩm gồm 20 mẫu bệnh phẩm của người Ba Lan, 4 mẫu bệnh phẩm của người Malaysia và 8 mẫu bệnh phẩm đại trà của người Việt Nam

Kết quả thu được cho thấy hệ mồi –mẫu dò được sử dụng có độ đặc hiệu cao và chuyên biệt cho gen SMN2 Số bản sao gen SMN2 được xác định bằng phương pháp

2-ΔΔCt sử dụng beta-actin làm gen tham chiếu Kết quả thử nghiệm hoàn toàn phù hợp với số liệu đưa ra Như vậy hệ mồi – mẫu dò và phương pháp Realtime PCR mà đề tài chúng tôi nghiên cứu đã đem lại kết quả như mong đợi và đạt hiệu quả cao trong việc xác định số lượng bản sao gen SMN2

by homozygous absence of SMN1 (survival motor neuron gene) in 94% of patients SMN2- the highly homologous gene, is present in all patients, but it can not compensate for loss of SMN1.The copy number of SMN2 influence to serious disease level Therefore, we construct Real-time PCR process to determine the copy number of SMN2 gene to predict disease level, symptom and longevity of SMA patients

We developed a reliable quantitative real-time PCR method with Taqman probe based on differ nucleotide between SMN1 and SMN2 Primer and probe is used from research project of Curet (2007) is tested in theory and experiment including the active ability, hybrid temperature, the sensitivity and amplification efficiency of the process The primer- probe system obtain satisfactory results will be studied in 32 clinical samples including 20 Polish patient samples, 4 Malaysian patient samples and 8 Vietnamese samples

The result show primer-probe system has high specificity for SMN2 gene The copy number of SMN2 gene was determined by 2-ΔΔCt method and beta-actin was used

as a reference gene The copy number of SMN2 gene in accordance with data provided Hence, the primer- probe system in real-time PCR process to determine the copy number of SMN2 gene has come up to our expectations The development of genetic techniques in the treatment of SMA will be more meaningful when we determine the number of SMN2 gene copies by real -time PCR method

Key words: SMA, SMN2, Real-time PCR, Vietnamese, Taqman

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Danh mục các từ viết tắt vii

Danh mục các bảng viii

Danh mục các hình ix

Chương 1: Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu đề tài 2

1.3 Nội dung đề tài 2

Chương 2: Tổng quan tài liệu 3

2.1 Đại cương về teo cơ tủy sống 3

2.1.1 Sơ lược về bệnh teo cơ tủy sống 3

2.1.2 Các dạng của bệnh teo cơ tủy sống 4

2.1.3 Tình hình bệnh teo cơ tủy sống trên thế giới và Việt Nam 4

2.1.3.1 Trên thế giới 4

2.1.3.2 Việt Nam 5

2.1.4 Tính di truyền của bệnh teo cơ tủy sống 5

2.1.5 Nguyên nhân di truyền học của bệnh teo cơ tủy sống 5

2.1.6 Chẩn đoán SMA 8

2.1.7 Chữa trị bệnh teo cơ tủy sống 9

2.2 Phản ứng Real-time PCR 9

2.2.1 Đại cương về PCR 9

2.2.1.1 Nguyên tắc của PCR 9

2.2.1.2 Thành phần PCR 10

2.2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR 10

2.2.1.4 Số lượng chu kỳ của PCR 12

2.2.1.5 Thiết bị và dụng cụ cho PCR 12

2.2.1.6 Các ưu điểm và hạn chế của PCR 12

2.2.1.7 Quá trình PCR 14

2.2.2 Phương pháp Real-time PCR 15

2.2.2.1 Các kiểu phản ứng của Real-time PCR 15

2.2.2.2 Một số lưu ý khi thực hiện Real-time PCR 17

2.2.2.3 Allele Specific Real-time PCR 19

2.2.2.4 Định lượng phản ứng Real-time PCR bằng gen tham chiếu 19

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21

3.1 Vật liệu 21

3.1.1.Vật liệu sinh học 21

3.1.2 Dụng cụ và hóa chất 21

3.1.2.1 Dụng cụ 21

3.1.2.2 Hóa chất 21

3.2 Phương pháp 22

3.2.1 Phương pháp tách chiết DNA 22

3.2.1.1 Nguyên tắc tách chiết 22

3.2.1.2 Tiến hành tách chiết 22

3.2.2 Phương pháp thiết kế - đánh giá primer 23

3.2.2.1 Thiết kế primer bằng phần mềm Annhyb 23

3.2.2.2 Thiết kế primer bằng phần mềm Clustal 24

3.2.3 Phương pháp Taqman Real-time PCR 24

3 2.3.1 Nguyên tắc của kỹ thuật Real-time PCR sử dụng Taqman probe 24

3.2.3.2 Phản ứng Singleplex Taqman Real-time PCR 26

3.2.3.3 Phản ứng Multiplex Taqman Real-timePCR 26

3.2.4 Phương pháp định lượng tương đối dựa vào gen tham chiếu 26

3.2.4.1 Phương pháp Livak 26

3.2.4.2 Phương pháp Plaffl 27

Chương 4: Kết quả và thảo luận 28

4.1 Kết quả 28

4.1 Kết quả lý thuyết 28

4.1.1.1 Kết quả chạy trên phần mềm Clustal 28

4.1.1.2 Kết quả chạy trên phần mềm Annhyb 32

4.1.1.3 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của primer bằng công cụ BLAST 34

4.1.1.4 Kết quả khảo sát cấu trúc thứ cấp của hệ primer-probe 34

4.1.2 Kết quả thực nghiệm 36

4.1.2.1 Khảo sát khả năng khuếch đại của hệ primer-probe 36

4.1.2.2 Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại cho multiplex real-time PCR 38

4.1.2.3 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai và độ đặc hiệu của hệ primer- probe 42

4.1.2.4 Kết quả khảo sát độ nhạy cho hệ primer- probe 42

4.1.2.5 Kết quả khảo sát hiệu suất khuếch đại 48

4.1.2.6 Kết quả xác định số lượng bản sao trên mẫu bệnh phẩm 49

4.2 Thảo luận 51

Chương 5: Kết luận và đề nghi 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Đề nghị 51

Tài liệu tham khảo 52 Phụ lục

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BLAST Basic Local Alignment Search Tool (chương trình BLAST)

Bp Base pair (cặp base)

DNTP Deoxynucleoside triphosphat

DHPLC Denaturing high performance liquid chromatography

IDT Intergrated DNA Technology (công ty IDT)

NCBI National Centre for Biotechnology Information

PCR Polymerase chain reaction

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

SMA Spinal Muscular Atrophy (teo cơ tủy sống)

SMN Survival Muscular Neurone

SMNΔ7 Survival Muscular neurone (SMN thiếu exon 7)

SNP Single nucleotide polymorphism

snRNPs Small nuclear ribonucleo proteins

Tm Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các type của bệnh teo cơ tủy sống 4

Bảng 3.1 Sự tương quan giữa tỷ số 2-∆∆Ct và số lượng bản sao 25

Bảng 4.1 Trình tự primer và probe sử dụng cho gen SMN2 và beta-actin 26

Bảng 4.2 Cấu trúc thứ cấp của hệ primer và probe cho gen SMN2 33

Bảng 4.3 Cấu trúc thứ cấp của hệ primer và probe cho gen beta-actin 34

Bảng 4.4 kết quả khảo sát sự hoạt động của hệ primer- probe cho gen SMN2 34

Bảng 4.5 Kết quả khảo sát sự hoạt động của hệ primer- probe cho gen beta-actin 35

Bảng 4.6 Kết quả khảo sát phản ứng singplex của gen SMN2 36

Bảng 4.7 Kết quả khảo sát phản ứng singplex của gen beta-actin 37

Bảng 4.8 Kết quả khảo sát gen SMN2 và beta-actin trong phản ứng multiplex 38

Bảng 4.9 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai và độ đặc hiệu cho gen SMN2 39

Bảng 4.10 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai và độ đặc hiệu cho gen beta-actin 40

Bảng 4.11 Kết quả khảo sát độ nhạy cho gen SMN2 41

Bảng 4.12 Kết quả khảo sát độ nhạy cho gen beta-actin 42

Bảng 4.13 Kết quả định lượng số bản sao trên mẫu chứng 45

Bảng 4.14 Kết quả định lượng số bản sao trên mẫu bệnh phẩm 46

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hệ thống thần kinh tủy sống 3

Hình 2.2 Quá trình splicing của gen SMN 6

Hình 2.3 Tổ chức gen SMN 6

Hình 2.4 Các bước của một phản ứng PCR 12

Hình 3.1 Nguyên tắc của kỹ thuật Real-time PCR sử dụng Taqman probe 24

Hình 4.1 Kết quả xếp gióng trình tự gen SMN1 và gen SMN2 29

Hình 4.2 Kết quả xếp gióng trình tự primer xuôi và gen SMN2 29

Hình 4.3 Kết quả xếp gióng trình tự primer ngược và gen SMN2 30

Hình 4.4 Kết quả xếp gióng trình tự probe và gen SMN2 30

Hình 4.5 Kết quả xếp gióng trình tự primer xuôi và gen beta-actin 31

Hình 4.6 Kết quả xếp gióng trình tự primer ngược và gen beta-actin 31

Hình 4.7 Kết quả xếp gióng trình tự probe và gen beta-actin 32

Hình 4.8 Kết quả khảo sát trên phần mềm Annhyb cho gen SMN2 33

Hình 4.9 Kết quả khảo sát trên phần mềm Annhyb cho gen beta-actin 34

Hình 4.10 Khảo sát khả năng khuếch đại hệ primer- probe cho gen SMN2 37

Hình 4.11 Khảo sát khả năng khuếch đại hệ primer- probe cho gen beta-actin 38

Hình 4.12 Phản ứng singleplex cho gen SMN2 40

Hình 4.13 Phản ứng singleplex cho gen beta-actin 41

Hình 4.14 Phản ứng multiplex cho gen SMN2 và gen beta-actin 42

Hình 4.15 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai và độ đặc hiệu cho gen SMN2 43

Hình 4.16 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai và độ đặc hiệu cho gen beta-actin 44

Hình 4.17 Kết quả khảo sát độ nhạy cho gen SMN2 45

Hình 4.18 Kết quả khảo sát độ nhạy cho gen beta-actin 46

Hình 4.19 Kết quả khảo sát hiệu suất khuếch đại cho gen SMN2 47

Hình 4.20 Biểu đồ biểu diễn hiệu suất khuếch đại cho gen SMN2 47

Hình 4.21 Kết quả khảo sát hiệu suất khuếch đại cho gen beta-actin 48

Hình 4.22 Biểu đồ biểu diễn hiệu suất khuếch đại cho gen beta-actin 48

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Teo cơ tủy sống SMA (Spinal Musclular Atrophy) là bệnh di truyền gen lặn trên NST thường, đặc trưng là sự yếu liệt và teo các cơ tiến triển do sự thoái hóa các tế bào vận động ở sừng trước tủy sống Bệnh teo cơ tủy sống đứng hàng thứ hai trong các nguyên nhân gây tử vong ở trẻ em trên thế giới

Bình thường, mỗi người có 2 bản sao của gen SMN1 và nhiều hơn 2 bản sao của gen SMN2 trong mỗi tế bào Ở người mang SMA, cả 2 bản sao của gen SMN1 đều bị biến đổi hoặc không hoàn chỉnh và có thể có 3 hoặc nhiều hơn các bản sao của gen SMN2 Khi cả 2 bản sao của gen SMN1 bị mất đi hoặc bị biến đổi thì chỉ 1 số lượng rất nhỏ hoặc thậm chí là SMN protein không được sản xuất từ gen này và khi đó thì các protein SMN được sản xuất từ gen SMN2 sẽ thay thế những protein khiếm khuyết

từ gen SMN1 SMN protein giúp cho quá trình lắp ráp tổ chức tế bào của pre- mRNA

để trở thành phân tử mRNA trưởng thành và có thể thêm các chức năng cho các tế bào thần kinh Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng SMN protein có vai trò quan trọng trong việc phát triển của sợi nhánh và trục thần kinh đóng vai trò truyền xung động thần kinh từ sợi thần kinh đến sợi thần kinh và từ sợi thần kinh đến các cơ

Tuy nhiên, vấn đề đặt ra ở đây chính là số lượng của protein SMN do gen SMN2 sản xuất Một lượng SMN protein được sản xuất từ gen SMN2 nhưng chỉ một số protein có kích thước và chức năng thật sự Những phiên bản khác có kích thước nhỏ hơn và rất dễ bị gãy vỡ Protein này giống hệt với protein được sản xuất từ gen SMN1

Do vậy, triệu chứng và sự tiến triển cũng như biểu hiện lâm sàng của chứng teo cơ SMA phụ thuộc chặt chẽ vào số lượng bản sao của gen SMN2

Việc phát hiện gen SMN2 bằng kỹ thuật sinh học phân tử mà cụ thể là bằng phương pháp real-time PCR nhanh, nhạy sẽ giúp cho việc khảo sát được ảnh hưởng của các bản sao của gen SMN2 đến mức độ bệnh SMA Đây là nền tảng cho việc ứng dụng sinh học phân tử vào liệu trình điều trị căn bệnh trên

1.2 Yêu cầu của đề tài

Để có thể hoàn thành tốt đề tài phải nắm vững các quy tắc và thao tác kỹ thuật sinh học phân tử trong tách chiết DNA, cách pha PCR mix, sử dụng máy PCR và Real-

time PCR để khảo sát khả năng hoạt động, độ nhạy, nhiệt độ lai… và cách tính số lượng bản sao dựa trên gen tham chiếu theo phương pháp 2-ΔΔCt

1.3 Nội dung đề tài

¾ Thiết kế hệ mồi- mẫu dò cho phản ứng Real-time PCR nhằm phát hiện gen SMN2

¾ Khảo sát các yếu tố cần thiết cho phản ứng như độ nhạy, nhiệt độ lai, khả năng khuếch đại…

¾ Thử nghiệm quy trình lên một số mẫu bệnh phẩm

Mục đích của từng nội dung sẽ được nói rõ hơn trong phần kết quả và thảo luận

Chương 2 TỒNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đại cương về bệnh teo cơ tủy sống

2.1.1 Sơ lược về bệnh teo cơ tủy sống

Bệnh teo cơ tủy sống tên tiếng Anh là Spinal Muscular Atrophy (SMA) là bệnh

di truyền ảnh hưởng phần hệ thần kinh kiểm soát các hoạt động tự phát của cơ Đây là bệnh thuộc về cơ vì tác động chính của nó xảy ra ở các cơ không nhận được các tín hiệu từ những tế bào thần kinh này Bệnh teo cơ tủy sống SMA gây ra bởi việc mất đi các tế bào thần kinh được gọi là các nơ-ron vận động trong tủy sống và được liệt vào loại bệnh nơ-ron vận động

Hình 2.1 Hệ thống thần kinh tủy sống. Tế bào thần kinh kiểm soát cơ (nơ-ron vận động) hầu hết nằm ở tủy sống Những phần nhô ra dài và giống như các dây nối các nơ-ron vận động với các cơ của tứ chi và thân người Bình thường các tín hiệu từ nơ-ron truyền đến các

cơ sẽ làm cho cơ co lại Trong trường hợp bệnh teo cơ tủy, các nơ-ron vận động bị mất đi và

vì thế các cơ không thể hoạt động được Những cơ nằm gần phần trung tâm của cơ thể (cơ gần gốc) thường bị ảnh hưởng nhiều hơn những cơ nằm xa trung tâm (cơ xa gốc).Nguồn: Rabaxy lab, India

SMA là căn bệnh thứ hai phổ biến trên thế giới, đứng sau hội chứng Cystic Fibrotic với tần số 1/10.000 ca sinh (Jablonka và ctv, 2000) SMA đặc trưng bởi sự yếu và giảm trương lực cơ SMA gây ảnh hưởng cho chân nhiều hơn cánh tay và các

cơ ở hông hay vai và có khuynh hướng ảnh hưởng tương đương giữa phần bên trái và bên phải cơ thể Trong hiều trường hợp của SMA, các cơ ngực bị ảnh hưởng dẫn đến nhiều vấn đề về hô hấp

2.1.2 Các dạng của bệnh teo cơ tủy sống

Theo Sumner (2006), Hofffmann và Werdnig mô tả SMA lần đầu tiên trong nghiên cứu của mình vào năm 1893 và 1894 Kugelberg và Welander mô tả những

triệu chứng tương tự khởi phát muộn vào năm 1956 Dựa trên hệ thống phân loại của Duboiwitz vào năm 1964, SMA được chia làm 4 dạng dựa trên khả năng vận động và

độ tuổi khởi phát gồm type I, type II, type III, type IV (Tsirikos và ctv, 2006) Bảng 2.1 so sánh sự khác nhau về đặc điểm, diễn tiến và độ tuổi khởi phát của từng type bệnh

Bảng 2.1 Các type của bệnh teo cơ tủy sống

- Giảm khả năng hô hấp do cơ ngực yếu

- Không thể đứng hay ngồi nếu không

có sự trợ giúp

- Nhai và nuốt gặp khó khăn

- Thường bị vẹo cột sống khi lớn lên

-Dạng nhẹ -Khởi phát sau 18 tháng tuổi

-Yếu các cơ gần -Có thể đi đứng

mà không cần sự trợ giúp

-Đi không vững, khó có thể chạy

-Nhai và nuốt khó khăn khi còn nhỏ -Tiến triển chậm

-Hiện diện ở người trưởng thành (sau

30 tuổi)

- Khởi phát ở tuổi trưởng thành

Canada, Phần Lan, Hungary và Na-uy đã ghi nhận tỷ lệ SMA là 1 trên 25000 đến 1

trên 15000 với hầu hết các bệnh nhân type II và III ở các nước này Ở Mỹ, tỷ lệ SMA

là 1 trên 24100 ca sinh, tần số thể mang SMA là 1 trên 50 ở chủng người da trắng

SMA xảy ra ở nam giới nhiều hơn ở nữa giới Tỷ lệ nam nữ đối với SMA là

2:1( Tsirikos và ctv, 2006)

Theo dự đoán về sự phát tán của bệnh, tỷ lệ SMA trong nhóm những cá nhân có

quan hệ huyết thống với nhau có dấu hiệu tăng cao Ở Arập Xu- đăng, tỷ lệ tăng lên

đến 1 trên 518 ca sinh đã được báo cáo Bệnh này còn phổ biến hơn đối với cộng đồng

Do Thái ở Israel với tỷ lệ là 1 trên 400 (www ranbaxy.com)

Năm 1999, có khoảng 13,7 trường hợp được chẩn đoán mang SMA trong tổng

100.000 trẻ sơ sinh ở Ailen và khoảng 8 trường hợp trong tổng số 100.000 trẻ sơ sinh

được chẩn đoán mang SMA trên thế giới (Inanaccone và ctv, 2004) Còn trong các

nghiên cứu ở Brazil phát hiện 80% bệnh nhân SMA type I, 75% bệnh nhân type 2 và

61% bệnh nhân type III trong tổng số các bệnh nhân được chẩn đoán mang SMA

(www ranbaxy.com)

2.1.3.2 Ở Việt Nam

Đã có một số nghiên cứu được tiến hành nhưng vẫn chưa được nghiên cứu sâu và

kỹ lưỡng để tìm ra một tỷ lệ nhất định các bệnh nhân mắc chứng teo cơ tủy sống

2.1.4.Tính di truyền của bệnh teo cơ tủy sống

Sự di truyền của SMA tuân theo mô hình di truyền trên NST thường Một đứa

con sinh ra từ cha và mẹ mang SMA có 25% khả năng phát triển thành SMA Đối với

cha mẹ mang SMA có 25% khả năng sinh con bình thường, 50% khả năng sinh con ở

thể mang và 25% khả năng sinh con với SMA

2.1.5 Nguyên nhân phát sinh - Di truyền học của bệnh teo cơ tủy sống

Gen SMN được cấu thành từ 9 exons với một codon stop ở phần cuối của exon 7

gồm gen SMN1 và gen SMN2 Nguyên nhân gây ra bệnh teo cơ tủy sống ở hầu hết các

trường hợp là đột biến mất đồng hợp gen SMN1(hơn 90%) (Monani, 2006)

Gen SMN1 và gen SMN2 khác biệt bởi năm nucleotide, chỉ một nucleotide nằm

ở exon 7 (C→T) có nhiệm vụ cho sự cắt- nối chọn lọc (alternative splicing) của exon

7 Các bản phiên mã hoàn chỉnh hầu hết được sản xuất từ gen SMN1, trong khi đó

dạng phiên mã chủ yếu được mã hóa từ gen SMN2 bị thiếu exon 7 (SMN2Δ7) (Turner,

2004)

Hình 2.2 Cấu trúc gen giữa gen SMN1 và gen SMN2 SMN1 và SMN2 có thể phân biệt

protein không bền vững (Wirth và ctv, 2006)

Hình 2.3 Quá trình splicing của SMN Ở SMN1, yếu tố ESE (exonic splicing enhancer)

chứa cytosine (C) tại vị trí 6 của exon 7 được nhận biết bởi yếu tố SF2 (Splicing 2) hay yếu tố ASF (alternative splicing factor) tác động với U2 snRNP (small nuclear ribonuclear protein)

để cắt bỏ intron 6 Yếu tố splicing khác (Tra2) sẽ thực hiện cắt nối thông qua các tác động với yếu tố ESE ở vùng trung tâm của exon 7 Serine và Arginine (SR)- giàu protein có thể ảnh hưởng đến sự cắt nối Ở SMN2, uridine (U) được phiên mả từ Thymine (T) tại exon 7 ở vị trí thứ 6 bị loại bỏ do sự gắn kết với hnRNPA1(heterogeneous nuclear ribonuclear protein)- yếu

tố cắt nối thụ động nên SF2/ ASF không còn nhận ra được nữa Sự gắn kết với hnRNP A1 sẽ

ức chế U2 snRNP gắn kết, kết quả là có gần 90% bản phiên mã thiếu exon 7 và 10% bản phiên mã được xem là hoàn chỉnh.(Lunn và ctv, 2008)

Theo nhiều nghiên cứu gần đây, bản phiên mã thiếu hụt exon 7 không ổn định, điều này giải thích tại sao SMN2 không thể bù đắp cho sự thiếu hụt gen SMN1 Các bản sao của gen SMN2 ảnh hưởng lên tính nghiêm trọng của SMA SMN1 và SMN2

là các gen cần thiết để tạo ra một loại protein cần thiết cho sự sống còn của các tế bào vận động ở sừng trước tủy sống gọi là survival motor neuron (SMN) protein Các tế bào này chịu trách nhiệm điều khiển sự vận động của cơ Gen SMN2 sản xuất ra một

số protein nhưng chỉ một số protein có kích thước và chức năng thật sự Hầu hết các protein cần thiết đều do gen SMN1 sản xuất SMN1 đột biến dẫn đến sự thiếu hụt protein SMN cần thiết cho sự hoạt động của các noron dây thần kinh vận động Nếu không có SMN protein, các nơron thần kinh vận động sẽ chết và xung động thần kinh

sẽ không được truyền từ não đến cơ Hậu quả là một số cơ sẽ mất khả năng hoạt động bình thường, trở nên yếu đi và mất dần khả năng hoạt động (Tsirikos, 2006; Chan và ctv, 2004; Monani và ctv, 2005)

Hình 2.4 Tổ chức gen SMN1 và SMN2 Kiểu gen SMN1 và SMN2 thường không ảnh hưởng đến kiểu hình của các bệnh nhân SMA type III và IV Sự tăng số lượng gen SMN2 do hoán chuyển gen (gen conversation) làm tăng số lượng SMN protein hoàn chỉnh, tình trạng bệnh nhẹ hơn (Wirth và ctv, 2006)

SMN protein có khối lượng 38kDa gồm 294 aminoacid (Ogino và ctv, 2004) trong khi đó bản phiên mã SMN2Δ7chỉ mã hóa SMN protein gồm 284 aminoacid Trong tế bào, SMN protein đóng vai trò quan trọng đối với mRNA trong việc tạo ra các protein mRNA mới hình thành phải trải qua một vài quá trình để trở thành phân tử protein hoàn chỉnh SMN protein giúp cho quá trình lắp ráp tổ chức tế bào của pre- mRNA để trở thành phân tử mRNA hoàn chỉnh vì SMN protein cấu tạo một phần nên snRNPs- yếu tố tham gia vào quá trình splicing SMN protein có thể thêm các chức năng cho các tế bào thần kinh Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng SMN protein có vai trò quan trọng trong việc phát triển của sợi nhánh và trục thần kinh Sợi nhánh và trục thần kinh đóng vai trò truyền xung động thần kinh từ sợi thần kinh đến sợi thần kinh

và từ sợi thần kinh đến các cơ (Gabanella và ctv, 2005)

Đột biến gen SMN1 và gen SMN2 trên cả hai nhiễm sắc thể chưa được báo cáo Theo Ogino và ctv (2004), mức độ SMN protein phụ thuộc vào số lượng bản sao gen SMN2 ở các bệnh nhân và SMN2 được nhận định là gen quyết định đến sự

tiến triển của SMA

Bên cạnh dạng bệnh do gen lặn nằm trên NST thường của SMA, các dạng bệnh khác đã được mô tả bao gồm dạng bệnh gen trội trên NST thường, dạng SMA liên kết với NST X, SMA ngoại biên và SMA liên quan đến chứng khó thở (Tsirikos, 2006)

2.1.6 Chẩn đoán SMA

Việc chẩn đoán SMA cơ bản dựa trên các đặc điểm bệnh học đặc trưng, lịch sử gia đình cũng hỗ trợ cho chẩn đoán Nghiên cứu chẩn đoán bao gồm sinh thiết cơ, điện

cơ đồ và các phương pháp chẩn đoán bằng sinh học phân tử

Sinh thiết cơ thường kỹ thuật tạo vết thương hở cần thiết để lấy được mẫu cơ Ở những trẻ vừa sinh, có triệu chứng xơ hóa cơ và không có sự thay đổi đặc trưng nào ở đường kính các sợi cơ Ở người trưởng thành, có hiện tượng thoái hóa và hoại tử trong các bó cơ nở to bất thường

Điện cơ đồ có thể được dùng để hỗ trợ cho việc chẩn đoán SMA Tốc độ dẫn điện trong hệ thống vận động giảm ở trẻ em bị ảnh hưởng nặng và tăng lên ít ở trẻ em với mức độ nhẹ hơn Sự run cơ có thể hiện diện trên biểu đồ điện tim

Ngày nay việc chẩn đoán di truyền bệnh SMA bằng kỹ thuật sinh học phân tử bao gồm PCR, PCR kết hợp với RFLP, DHPLC, Real-time PCR Đặc biệt, Real-time PCR là phương pháp nhanh, nhạy, tiết kiệm được nhiều thời gian, chi phí và được ứng

dụng nhiều nhất hiện nay Về nội dung cụ thể của phương pháp sẽ được đề cập trong phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1.7 Chữa trị bệnh teo cơ tủy sống

Để chữa trị căn bệnh teo cơ tủy sống, các phương pháp điều trị được phát triển dựa trên cách thức thay đổi các bản sao của gen SMN2 để trở thành các bản sao có kích thước và chức năng thực thụ bổ sung cho những bản sao thiếu hụt của gen SMN1

do đột biến Do đó các tế bào thần kinh vận động sừng trước tủy sống sẽ thoát khỏi tình trạng thoái hóa và các cơ sẽ hoạt động bình thường Sự xác định gen SMN1, SMN2 và protein của chúng gây bệnh SMA là kết quả của những nghiên cứu về gen trị liệu Khi bệnh nhân SMA thiếu SMN1 nhưng vẫn duy trì được gen SMN2, sẽ sản xuất được một số protein SMN thì phương pháp trị liệu có khả năng nhất là tăng điều hòa

sự biểu hiện của gen SMN2 Các hợp chất đã được kiểm chứng để tăng sự biểu hiện của gen SMN2 bao gồm acid valproic, sodium butyrat, phenyl butyrat, aclarubicin, amino glycoside, tobramycin và amikacin đã có những kết quả invitro đáng kể Acid valproic đã được kiểm tra ở bệnh nhân SMA và đã chỉ rõ được sự gia tăng sản xuất SMN trong nguyên bào sợi (Sumner, 2006)

2.2 Phản ứng Real-time PCR

2.2.1 Đại cương về PCR

PCR là viết tắt của phản ứng chuỗi dây chuyền (Polymerase chain Reaction) là

phương pháp khuếch đại DNA in vitro được giới thiệu bởi Kary Mullis vào năm 1985.

Nguyên tắc của PCR khá đơn giản nhưng kết quả của nó được đánh giá rất cao Quá

trình phản ứng đơn giản hơn nhiều khi enzyme Taqpolymerase được chọn vào năm

1988 và đưa đến khả năng thực hiện PCR tự động Từ đó, một số ứng dụng trên nền tảng PCR đã được phát triển khơi nguồn cho cuộc cách mạng hóa trong các chẩn đoán phân tử tiến bộ và mang tính linh hoạt cao (Kubista và ctv, 2006)

2.2.1.1 Nguyên tắc PCR

Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể như: đoạn DNA cần nhân mở xoắn thành hai mạch đơn, cần có các cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược), cần nguyên liệu, điều kiện môi trường thích hợp và enzym DNA polymerase Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt (mồi) Mồi là một đoạn oligonucleotide, có kích thước khoảng vài chục nucleotide, có khả năng bắt cặp

bổ sung với một đầu của mạch khuôn, các mồi này gồm một mồi xuôi (đoạn forward)

và một mồi ngược DNA polymerase sẽ nối dài đoạn mồi để hình thành mạch mới (Phạm Hùng Vân, 2009)

Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác là dùng nhiệt độ cao (94oC) tháo xoắn thay cho helicase kết hợp với enzym DNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều nhiệt cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động Nhờ

kỹ thuật PCR mà với một lượng nhỏ DNA ban đầu chúng ta có thể thu được đủ lượng DNA cần thiết để tiến hành các thí nghiệm về DNA

2.2.1.2 Thành phần PCR

Thông thường PCR được thực hiện ở thể tích từ 10- 100 μl Deoxynucleoside triphotphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) ở nồng độ 200 μM mỗi loại, 10 đến 100 pmol mỗi mồi, lượng muối phù hợp, đệm và DNA polymerase

2.2.1.3 Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR

™ DNA mẫu

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1 microgam xuống còn

100 ng) với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao Hơn nữa, việc giảm lượng mẫu ban đầu còn hạn chế được các khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn Một ưu điểm lớn khác của phương pháp PCR là cho phép khuếch đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân huỷ từng phần như trong

các vết máu để lâu ngày, hoá thạch, tóc, móng tay của người đã chết

™ Enzyme chịu nhiệt

Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I Vì đây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp (phải thêm enzyme mới vào phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị nhiệt phân huỷ, nhiệt độ lai thấp khiến sự khuếch đại kí sinh rất cao,…) Phương pháp PCR chuyển sang một bước ngoặc mới cùng với sự phát hiện một DNA polymerase chịu nhiệt được tách

chiết từ một vi khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus, enzyme này- Taq

polymerase- không bị phá huỷ ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến

cuối quá trình phản ứng

Ngày nay, nhiều polymerase đã được đưa ra thị trường với nhiều chức năng

chuyên biệt hay hoàn thiện hơn Tth polymerase, một enzyme tách chiết từ Thermus thermophilus có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt

RNA khuôn và ion Mn2+ nhưng với sự hiện diện của DNA khuôn và ion Mg2+, Tth

polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA Enzyme này cho phép khuếch đại bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA

™ Mồi

Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, có vai trò kéo dài mạch của DNA polymerase Do vậy việc thiết kế mồi phải được tiến hành thật chính xác, tránh ảnh hưởng đến hiệu quả và độ chuyên biệt của phản ứng PCR:

- Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi

và mồi ngược, và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi

- Nhiệt độ gắn mồi (Tm) của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần

- Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen

- Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và ngược không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb

- Nồng độ mồi trong mỗi phản ứng phải được tính toán tối ưu bằng thực nghiệm Nếu nồng độ mồi quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại ký sinh, ngược lại sẽ làm hiệu quả khuếch đại của phản ứng không cao.Giới hạn nồng độ mồi thường từ 10pmol cho đến 50pmol cho một thể tích phản ứng (Pattyn và ctv, 2002; Neuvians và ctv, 2005)

™ Các thành phần khác của phản ứng PCR

- Dung dịch đệm PCR: dung dịch này có tác dụng cung cấp những ion cần thiết cho phản ứng xảy ra Tùy theo nguồn DNA polymerase mà nồng độ và pH của dung dịch đệm cũng như nồng độ KCl tối ưu sẽ thay đổi sao cho phù hợp Thông thường, một phản ứng PCR sẽ có dung dịch đệm điển hình là: 50mM KCl, 10mM Tris – HCl, pH 8.3 ở nhiệt độ phòng

- MgCl2: có vai trò là một cofactor cho enzyme DNA polymerase hoạt động Ngoài ra, mồi, DNA bản mẫu, dNTPs, EDTA cũng có thể liên kết với MgCl2 và do đó sẽ cạnh

tranh với DNA polymerase Nếu nồng độ MgCl2 cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại

ký sinh

- Các deoxyribonucleotide triphosphat (dNTP): gồm bốn loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP là nguyên liệu tham gia tạo nên mạch DNA mới Nồng độ của mỗi loại nu trong mỗi phản ứng với nồng độ MgCl2 1.5 mM là 200- 250 mM Nếu nồng độ dNTPs cao

sẽ làm giảm hiệu quả khuếch đại của phản ứng PCR, và sự mất cân bằng nồng độ giữa các loại nu sẽ làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase

- Các chất tăng cường: Trong phản ứng PCR, ngoài những thành phần cơ bản đôi khi người ta còn bổ sung thêm chất tăng cường với mong muốn phản ứng PCR xảy ra hiệu quả hơn, nhưng nếu dùng với liều lượng không thích hợp,các chất này sẽ có tác dụng ngược lại, ảnh hưởng không tốt đến phản ứng đến PCR Các chất tăng cường thường là: betain, DMSO (dimethylsulfoxide), glycerol,…

2.2.1.4 Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR

Trong thực tế, một phản ứng PCR thường không kéo dài hơn 40 chu kỳ vì phải diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân

tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau:

- Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng

- Mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần được tiến hành trên cùng một loại thiết bị

- Ống phản ứng củacùng một nghiên cứu phải thuộc một kiểu vì đặc tính truyền nhiệt của các này cũng như độ tiếp xúc giữa ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị có ảnh hưởng lớn đến quá trình khuyếch đại

2.2.1.6 Các ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật PCR

™ Ưu điểm

- Thời gian thực hiện nhanh: chỉ cần 3 giờ để khuếch đại một trình tự DNA được quan tâm

- Đơn giản và ít tốn kém: được thực hiện trong ống nghiệm có thể tích vào khoảng từ 10ml đến 50ml các thành phần phản ứng dựa vào các chu kỳ nhiệt

- PCR có thể thực hiện với các mẫu nucleic acid thô

™ Hạn chế

- Kích thước của trình tự cần khuếch đại: phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3kb Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1.5kb cho kết quả tốt Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm

- Sự ngoại nhiễm: nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước Người ta đã chứng minh được rằng mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị, dụng cụ… rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó (Phạm Hùng Vân, 2009) Có thể khắc phục vấn đề này bằng một số biện pháp sau:

- Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tích các sản phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau

- Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụng vào các thao tác khác Đầu típ sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm đầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng

- Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước

- Tất cả mọi thành phần của phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính toán sao cho đủ 1, 2 lần thao tác

- Ngoài ra, các hãng sản xuất còn tung ra thị trường nhiều hệ thống cho phép loại bỏ hoàn toàn sự ngoại nhiễm Ví dụ hãng Perkin-Elmer-Cetus đề xuất việc sử dụng dUTP thay vì dTTP; việc thay thế này không ảnh hưởng đến phản ứng Trước mỗi lần phản ứng kế tiếp, người ta cho thêm vào dung dịch phản ứng uracyglycosylase; enzyme này

sẽ phân hủy tất cả các DNA có mang dUTP nhiễm từ lần trước Đồng thời, enzyme sẽ

bị phân hủy bởi nhiệt ngay từ lần biến tính đầu tiên Bất lợi của các hệ thống này là giá thành cao

- Các sai sót gây ra do Taq polymerase: sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai

khá cao (10-4, nghĩa là cứ 1000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide) Ta không

thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt như đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính thức…

2.2.1.7 Quá trình phản ứng PCR:

Mỗi chu kỳ phản ứng PCR nhân bản DNA có 3 bước chính như mô tả ở hình sau:

Hình 2.4 Các bước của một phản ứng PCR (http://www.le.ac.uk)

Bước 1: Giai đoạn biến tính (denaturation) Trong một dung dịch phản ứng bao

gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường ở 94-95oC trong vòng 30 giây- 1 phút, mạch DNA

đích được tách thành 2 mạch đơn

Bước 2: Giai đoạn lai (hybridization) Nhiệt độ được hạ thấp đến khoảng

55-65oC cho phép các mồi bắt cặp với khuôn: hai đoạn mồi sẽ liên kết với hai sợi đơn DNA Đoạn mồi xuôi gắn với đầu 5’ của mạch một Đoạn mồi ngược gắn vào đầu 5’ của mạch hai Quá trình tổng hợp cả hai đoạn đều theo hướng 5’-3’

Bước 3: Giai đoạn kéo dài (elongation) Nhiệt độ tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt tốt nhất Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút Sau chu kỳ cuối cùng đề hoàn tất phản ứng PCR thường có thêm một giai đoạn nữa là giai đoạn bù (soaking), nhiệt độ được giữ ở 72oC trong vòng vài phút Đây là giai đoạn

mà một số bản sao vì một lý do nào đó trong các giai đoạn sao chép của phản ứng chưa đạt đến chiều dài đồng bộ so với các bản sao khác, sẽ tiếp tục kéo dài để hoàn tất

Nhờ vậy mà các bản sao có chiều dài rất đều nhau

Một chu kỳ gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân, theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với lượng mẫu ban đầu

2.2.2 Phương pháp Real-time PCR

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, nghĩa là quá trình khuếch đại DNA diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp Real-time PCR gồm 2 quá trình diễn ra đồng thời: khuếch đại DNA bằng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng phân đoạn DNA tạo thành

2.2.2.1 Các kiểu phản ứng của Real-time PCR

Hiện nay có bốn kiểu phản ứng được sử dụng trong kỹ thuật Real-time PCR với

độ nhạy tương đương nhau khác nhau bởi các loại mẫu dò sau:

™ Molecular beacon:

Đây là loại mẫu dò có cấu trúc dạng vòng và cuống (steam and loop structure), cấu trúc dạng vòng bắt cặp bổ sung đăc hiệu với trình tự nucleic acid mục tiêu Một chất hóa học phát huỳnh quang được gắn vào một đầu của mẫu dò (reporter) và một chất hóa học (quencher) được gắn ở đầu bên kia Quencher là một chất màu không phát huỳnh quang có nhiệm vụ làm tiêu giảm năng lượng mà nó nhận được từ chất phát huỳnh quang dưới dạng nhiệt và vì thế không cho ánh sáng của huỳnh quang nào được phát ra Phần cấu trúc dạng cuống làm cho hai đầu của mẫu dò ở gần với nhau trong không gian, lúc đó quencher sẽ phát huy tác dụng và ngăn cản sự phát huỳnh quang của chất phát huỳnh quang Khi mẫu dò bắt cặp bổ sung với một mạch của trình

tự DNA mục tiêu thì mẫu dò mất cấu trúc dạng vòng và cuống trở thành dạng thẳng, làm gia tăng khoảng cách không gian giữa chất phát huỳnh quang và quencher Chất phát huỳnh quang lúc đó sẽ phát ra ánh sáng mà các thiết bị có thể tiếp nhận và phân tích Nếu beacon không bắt cặp bổ sung hoàn toàn với trình tự DNA thì không có sự phát sáng huỳnh quang

™ Chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi

Chất nhuộm này gắn vào mọi phân tử DNA mạch đôi Khi ở trạng thái tự do, chất nhuộm không phát huỳnh quang nhưng sau khi đã gắn vào DNA mạch đôi thì chất nhuộm phát huỳnh quang và cường độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với hàm

lượng DNA có trong phản ứng PCR Các chất nhuộm phát huỳnh quang thường được

sử dụng là SYBR green I, ethidium bromide Trong phản ứng PCR, các chất nhuộm sẽ gắn vào DNA mới được tổng hợp trong bước kéo dài mạch và rời ra khi các phân tử DNA bị biến tính trong bước biến tình Mọi DNA mạch đôi hiện diện trong phản ứng đều có khả năng bắt chất nhuộm và phát huỳnh quang nên nếu có sản phẩm ký sinh trong phản ứng thì sự định lượng trở nên không chính xác Để phát hiện các sản phẩm

ký sinh trong phản ứng, người ta xây dựng một đường cong nóng chảy bằng cách nâng dần nhiệt độ phản ứng và đo giá trị cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tại các thời điểm nhiệt độ khác nhau

™ Mẫu dò đôi

Phương pháp này có độ đặc hiệu rất cao do việc sử dụng cùng lúc hai mẫu dò bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu Một mẫu dò mang ở đầu 3’ chất cho “fluorescein” (fluorescein donor) phát ánh sáng màu xanh và một mẫu dò thứ hai mang ở đầu 5’ chất nhận “fluorescein” (fluorescein acceptor) Mẫu dò thứ hai này được chặn ở đầu 3’ sao

cho Taq polymerase không thể kéo dài mạch từ đầu này Ánh sáng huỳnh quang từ

chất cho chuyển đến chất nhận thông qua hiệu ứng FRET (Fluorescein Resonance Energy Transfer – sự chuyển năng lượng huỳnh quang cộng hưởng) và chất nhận sẽ phát ánh sáng huỳnh quang có màu đỏ (red fluorescent)

Trong dung dịch phản ứng có chất cho và chất nhận cách xa nhau thì tín hiệu nền

là tín hiệu huỳnh quang do chất dò phát ra Đến bước bắt cặp giữa mẫu dò với bản mẫu thì có sự sắp xếp giữa hai mẫu dò sao cho phần đầu của mẫu dò này tiếp xúc với phần đuôi của mẫu dò kia Khi đó, hiệu ứng FRET xảy ra, chất nhận huỳnh quang phát ra một ánh sáng huỳnh quang mới có bước sóng lớn hơn ánh sáng mà nó nhận được và sẽ được các thiết bị ghi nhận Cường độ huỳnh quang do chất nhận phát ra tỉ lệ thuận với hàm lượng sản phẩm PCR trong phản ứng

™ Mẫu dò thủy giải (Hydrolysis Probe)

Mẫu dò sử dụng trong phương pháp này gọi là Taqman (mẫu dò Taqman)

Phương pháp này dựa vào đặc tính exonuclease 5’ – 3’ của Taq polymerase

Mẫu dò Taqman được gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất “dập tắt tín hiệu” (quencher) ở đầu 3’, ánh sáng huỳnh quang của chất phát huỳnh quang bị hấp thu bởi quencher Trong bước bắt cặp và kéo dài mạch của một chu kỳ PCR, mẫu

dò này sẽ bắt cặp với mạch bổ sung trên trình tự DNA mục tiêu Khi Taq polymerase

kéo dài mạch bổ sung từ đầu 3’ của mồi đến khi tiếp xúc với mẫu dò, nó sẽ thể hiện hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease và loại bỏ một số nucleotide ở đầu của mẫu dò, thay bằng những nucleotide mới Khi đó chất phát huỳnh quang sẽ tách rời mẫu dò và quencher mất tác dụng Cường độ phát huỳnh quang phát ra tương ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong phản ứng

Mẫu dò Taqman chỉ bắt cặp với mạch khuôn nếu trình tự nucleotide của hai phân

tử DNA là bổ sung hoàn toàn với nhau Nếu không bổ sung hoàn toàn thì mẫu dò Taqman sẽ không bắt cặp và sẽ không có tín hiệu huỳnh quang nào được phát ra Như vậy các sản phẩm ký sinh nếu có trong phản ứng PCR cũng không thể hiện, điều này khiến cho mẫu dò Taqman có tính đặc hiệu cao

2.2.2.2 Một số lưu ý khi thực hiện phản ứng Real-time PCR

™ Kích thước sản phẩm PCR trong phản ứng Real-time PCR

Chiều dài tối ưu của sản phẩm PCR trong phản ứng Real-time PCR thường nhỏ hơn 100bp Đôi khi có thể tăng kích thước sản phẩm nhân bản đến 400bp trong một số trường hợp với mẫu dò Taqman Sản phẩm có kích thước ngắn nhân bản hiệu quả hơn

và chịu điều kiện bất lợi của sản phẩm tốt hơn so với các sản phẩm có kích thước lớn Sản phẩm có kích thước nhỏ có thể biến tính ở 920C và chỉ cần 15 giây để Taq

polymerase tổng hợp hoàn toàn một mạch mới bổ sung

™ Mẫu dò

Người ta thường thiết kế mẫu dò trước khi thiết kế mồi, cặp mồi được thiết kế gần với vị trí của mẫu dò nhưng không được trùng lắp Thành phần GC trong trình tự nucleotide của mẫu dò phải nằm trong khoảng 20 – 80% Cần tránh các nucleotide lặp lại trong trình tự của mẫu dò, đặc biệt là G Nhiệt độ nóng chảy của mẫu dò phải lớn hơn nhiệt độ của mồi từ 8 – 100C nhằm đảm bảo cho việc bắt cặp hoàn toàn với DNA mạch khuôn trong bước bắt cặp và kéo dài của chu kỳ PCR Không nên có G ở đầu 5’

vì G có thể sẽ hấp thụ ánh sáng huỳnh quang ngay cả khi mẫu dò đã bị thủy giải bởi

Taq polymerase Nếu chọn mẫu dò trong vùng nhiều GC thì phải chọn mạch bổ sung

của mẫu dò có nhiều C hơn G để làm tăng cường độ phát huỳnh quang trên cường độ huỳnh quang của nền phản ứng

™ Cặp mồi

Được thiết kế sao cho sản phẩm PCR khoảng 50 – 150 bp Thành phần GC của

cặp mồi giống như thành phần GC của mẫu dò, khoảng 20 – 80% Cần tránh các nucle

-otide lặp lại, đặc biệt là G nếu có 4G hoặc hơn nữa lặp lại thì phải loại bỏ Nhiệt độ nóng chảy của cặp mồi trong khoảng 58 – 600C, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy

của mẫu dò từ 8 – 100C Thành phần 5 nucleotide cuối cùng của đầu 3’ không nên có hơn hai G hoặc C nhằm tránh hiện tượng nhân bản ký sinh trong phản ứng PCR

™ Chu kỳ ngưỡng (Threshold cycle)

Khái niệm chu kỳ ngưỡng là khái niệm trung tâm của kỹ thuật Real-time PCR Nguyên tắc định lượng của kỹ thuật này là dựa vào đường cong chuẩn (Standard curve) được xây dựng từ các giá trị chu kỳ ngưỡng của các mẫu đã có nồng độ nucleotide biết trước

Chu kỳ ngưỡng là chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt trên tín hiệu huỳnh quang nền của phản ứng PCR và được thiết bị cảm biến ghi nhận Chu kỳ ngưỡng rơi vào pha lũy thừa của phản ứng PCR Vì vậy, việc định lượng là chính xác

vì không chịu bất kỳ ảnh hưởng nào từ pha bão hòa (plateau phase) của phản ứng PCR Các mẫu có nồng độ nucleotide ban đầu lớn thì có Ct nhỏ và ngược lại các mẫu có nồng độ nucleotide ban đầu nhỏ sẽ có Ct lớn Tín hiệu huỳnh quang nền được tạo ra trong phản ứng real-time PCR là do các chất phát huỳnh quang có nồng độ xác định có sẵn trong thành phần phản ứng PCR Chất phát huỳnh quang này khác với chất phát huỳnh quang được sử dụng để định lượng Trong phản ứng real-time PCR sử dụng mẫu dò Taqman thì chính quencher của mẫu dò Taqman sẽ đóng vai trò tạo tín hiệu nền cho phản ứng (Bustin, 2004)

™ Thiết kế đường cong chuẩn (Standard curve) cho phản ứng Real-time PCR

Việc định lượng trong phản ứng real-time PCR được thực hiện bằng cách so sánh hàm lượng sản phẩm PCR của mẫu xét nghiệm với hàm lượng sản phẩm PCR từ các mẫu chuẩn biết trước nồng độ được nhân bản đồng thời Các thiết bị thực hiện phản ứng real-time PCR sẽ tự động xây dựng một đường cong chuẩn dựa trên chu kỳ ngưỡng Ct của các mẫu có sẵn nồng độ nucleotide acid biết trước (các mẫu chuẩn – standard samples) Sau đó, nồng độ nucleic acid của các mẫu xét nghiệm sẽ tính toán dựa trên đường cong chuẩn này

™ Tính lặp lại của phản ứng Real-time PCR

Kết quả phản ứng PCR thường biến động, thay đổi từ lần này sang lần khác Nhưng phản ứng real-time PCR có tính lặp lại rất cao Nguyên nhân sự khác biệt này

là do thời điểm phân tích kết quả Real-time PCR phân tích kết quả theo thời gian thật;

chu kỳ ngưỡng của phản ứng luôn rơi vào pha lũy thừa là pha mà phản ứng xảy ra thuận lợi nhất Trong khi đó, kết quả của phản ứng PCR thông thường chỉ được phân tích khi phản ứng kết thúc, thường là vào pha bão hòa của phản ứng Như vậy, bất kỳ

sự biến đổi nào của pha lũy thừa cũng sẽ dẫn đến những khác biệt rất lớn trong pha bão hòa của phản ứng PCR thông thường (Phạm Hùng Vân, 2009)

2.2.2.3 Allele Specific Real-time PCR

Theo Rasmussmen và ctv (2000), allele specific real-time PCR thực chất là PCR

được tối ưu hóa về mồi cũng như các điều kiện phản ứng cho mục đích phát hiện các đột biến điểm (gọi là các SNP) Để phát hiện được đột biến điểm cần phải tìm ra điều kiện nhiệt độ lai khắc nghiệt sao cho sự khác biêt của một nucleotide tại đầu 3’ tận cùng của mồi so với khuôn DNA cũng đủ cho quá trình bắt cặp và khuếch đại của mồi không thể xảy ra Khi thiết kế mồi đề phát hiện đột biến điểm ta cần đặc biệt quan tâm đến 3 nucleotide cuối cùng ở đầu 3’ Sự sai khác của những nucleotide này so với DNA khuôn thường dẫn đến mồi không thể thực hiện quá trình khuếch đại Nguyên

nhân nằm ở hoạt động của enzyme Taq polymerase Enzyme này hoạt động bổ sung

nucleotide theo hướng từ đầu 5’ đến đầu 3’ nên nó sẽ lắp nucleotide vào đầu 3’ tận cùng đến khi hoàn thành quá trình khuếch đại Sự sai khác một trong ba nucleotide ở đầu 3’ của mồi sẽ ức chế quá trình này Tận dụng đặc điểm này mà ta sẽ thiết kế mồi cũng như tối ưu hóa phản ứng real-time PCR sao cho phân biệt được các đột biến điểm

2.2.2.4 Định lượng phản ứng PCR bằng gen tham chiếu

™ Gen tham chiếu

Theo Thellin và ctv (1999), gen tham chiếu là một gen cơ bản và tiêu biểu trong

tế bào, duy trì sự sống và các chức năng bình thường của tế bào, được tìm thấy trong tất cả các tế bào người như: beta-actin, beta-catenin, GADPH, 18S RNA, 28S RNA

…Gen tham chiếu thường được dùng trong phản ứng PCR định lượng để so sánh mức

độ biểu hiện mRNA ở các mô bào khác nhau Các gen tham chiếu này thường kiêm thêm vai trò của một chứng nội trong phản ứng PCR định lượng, chủ yếu là rt-PCR đặc biệt là gen 18S RNA và 25S RNA

™ Phương pháp định lượng tương đối bằng gen tham chiếu

Khi so sánh các mẫu với nhau bằng định lượng tương đối, một mẫu thường được gọi là chuẩn và sự biểu hiện gen đích trong tất cả các mẫu được biểu hiện bằng

sự tăng giảm tương quan với chuẩn Khi sử dụng gen tham chiếu là đơn vị chuẩn sẽ

thuận tiện hơn trong điều kiện mẫu ban đầu bị hạn chế Để xác định sự tương quan giữa gen đích trong mẫu thí nghiệm và gen tham chiếu là đơn vị chuẩn cần phải xác định giá trị chu kỳ ngưỡng của mỗi gen Sau khi giá trị chu kỳ ngưỡng được xác định, các phương pháp khác nhau có thể sử dụng để xác định mức độ biểu hiện của gen đích trong mẫu thí nghiệm tương quan với mẫu chuẩn Các phương pháp trong việc định lượng tương đối bằng gen tham chiếu bao gồm phương pháp Livak và phương pháp Plaffl (Gibson, 2005) Mỗi phương pháp có ưu, nhược điểm riêng, cũng như yêu cầu cần phải đáp ứng để có kết quả phân tích giá trị Phần vật liệu và phương pháp nghiên

cứu sẽ làm rõ các phương pháp này hơn

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu

3.1.1 Vật liệu sinh học

Các mẫu chứng được cung cấp từ Viện nghiên cứu thần kinh Balan; trường đại học Sains, Malaysia; trường đại học Udine, Italia và thử nghiệm quy trình trên mẫu bệnh phẩm đại trà

3.1.2 Dụng cụ và hóa chất

3.1.2.1 Dụng cụ

- Tủ lạnh – 20oC và 4oC

- Tủ cấy vô trùng

- Máy ly tâm (Kubota)

- Máy vortex Reax 2000(Heidolph)

- Máy ly tâm Mikro22 (Hettich Zentrifugen)

- Bể ổn nhiệt

- Micropipette, đầu tip và Effendorf các loại

- Máy Real-time PCR, máy tính và các phần mềm hỗ trợ

- Các vật dụng tiêu hao khác

3.1.2.2 Hóa chất

™ Hóa chất dùng trong tách chiết DNA

- Dung dịch 1 (Trizol) phenol 38%, guanidium thyocianate 0,8M, glycerol 5%, chỉnh về pH 8 (nếu dùng cho DNA), hoặc pH 4.0 (nếu dùng cho RNA)

- Dung dịch 2 : Cloroform

- Dung dịch 3 : Isopropanol tuyệt đối có chứa chất trợ tủa

- Dung dịch 4: Ethanol 70%

- Dung dịch 5: dung dịch TE 1X(Tris 0,1M – EDTA 0,001)

™ Vật liệu và hóa chất dùng trong phản ứng Real-time PCR

¾ Vật liệu

- DNA bản mẫu

- Mồi xuôi và mồi ngược

- Mẫu dò

3.2.1 Phương pháp tách chiết DNA

Chúng tôi tách chiết DNA theo phương pháp Phenol/chloroform (Chomczynfski

và Sacchi, 1987) có cải tiến cho phù hợp phòng thí nghiệm

3.2.1.1 Nguyên tắc tách chiết

Dưới tác động của phenol pH 8 và guanidinium thiocyanate là những chất biến tính protein mạnh có trong chế phẩm Trizol, tế bào sẽ bị phá vỡ giải phóng DNA bộ gen và các thành phần nội bào khác Sau li tâm, hỗn hợp phân tách thành hai pha rõ rệt, thu nhận pha nước có DNA ở phần trên, loại bỏ phần dưới DNA được thu nhận bằng cách tủa trong một thể tích isopropanol Isopropanol tuyệt đối có chứa chất trợ tủa sẽ giúp thu tủa DNA Chất trợ tủa là một loại polymer có cấu trúc mạng lưới nên

dễ bắt được các phân tử DNA và không ức chế phản ứng PCR

Cuối cùng tủa DNA được rửa trong ethanol 70% và hòa vào dung dịch TE 1X

3.2.1.2 Tiến hành tách chiết

- Cho 200 μl mẫu huyết thanh của bệnh nhân vào tube vô trùng 1,5 ml cùng với

900 μl dung dịch phenol pH8 Vortex trộn đều hỗn hợp, để yên 10 phút Sau đó cho 200μl dung dịch chloroform Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

- Hút 600 μl dung dịch nổi cho vào một tube vô trùng mới có 600 μl dung dịch isopropanol Để yên 10 phút ở - 20oC

- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút Hút bỏ toàn bộ dung dịch trong tube cho vào 900 μl dung dịch ethanol 70%

- Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 5 phút Hút bỏ toàn bộ dung dịch trong tube vô trùng Để khô ở 600C trong 10 phút

- Hòa tan DNA thu được với 50 μl dung dịch TE 1X Giữ ở - 200C đến khi tiến hành phản ứng Real-time PCR

3.2.2 Phương pháp thiết kế- đánh giá mồi

Mồi là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR, có ảnh hưởng rất lớn đến độ chính xác và độ đặc hiệu của phản ứng Thiết kế mồi là khâu đầu tiên và cũng là khâu quan trọng nhất khi xây dựng quy trình PCR, nên việc thiết kế cần phải được tiến hành thật kỹ lưỡng và cẩn thận Do đó thiết kế mồi là công việc đầu tiên

và quan trọng nhất khi xây dựng quy trình Real-time PCR

™ Các phần mềm máy tính sử dụng

- ClustalX 2.0.10

- Annhyb - 4.942, năm 2008

- Phần mềm trực tuyến của hãng IDT (Hoa Kỳ) http://www idtdna.com

- Phần mềm trực tuyến BLAST (NCBI, Hoa Kỳ) http://ncbi.nlm.nih.gov

™ Phương pháp tiến hành

- Thu thập các trình tự gen SMN1, SMN2 từ ngân hàng gen

(http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)

- Tiến hành so sánh (alignment) các trình tự bằng chương trình Clustal X) để tìm

ra những vùng rất đặc trưng (là vùng bảo tồn cao) của gen SMN1 và gen SMN2

- Kiểm tra vị trí hoạt động của các mồi có nằm trong vùng bảo tồn hay không

- Phân tích các đoạn mồi này về thông số Tm, chiều dài, tỷ lệ % GC, kích thước các sản phẩm tạo thành, khả năng tạo dimer và hairpin loop bằng BLAST, Annhyb

- Đánh giá mức độ tối ưu trên lý thuyết của các mồi

- Tiến hành khảo sát trên thực nghiệm, xây dựng quy trình Real-time PCR để xem các mồi hoạt động như thế nào khi thực hiện phản ứng multiplex Dựa trên các kết quả thực nghiệm, ta sẽ đánh giá được các mồi có tối ưu hay không

3.2.2.1 Thiết kế mồi bằng phần mềm AnnHyb

AnnHyb (Annealing and Hybridization) là phần mềm miễn phí dùng để phân tích trình tự nucleotide với các đặc trưng như chuyển đổi qua lại giữa các định dạng trình

tự, dịch mã, phân tích bản đồ cắt giới hạn, khung đọc mở

™ Nhập xuất dữ liệu

Dữ liệu được xử lý trong phần mềm Annhyb là các trình tự DNA Trình tự DNA

có thể nhập vào chương trình xử lý bằng cách:

Nhập trình tự thủ công hay trình tự từ file: Kích hoạt menu sequence, chọn New sequence Sau khi cửa sổ Edit sequence hiện ra, nhập trình tự trực tiếp hay chọn menu Edit, chọn insert sequence rồi chọn from file để nhập trình tự từ file Sau khi nhập trình tự xong, kích hoạt menu sequence, chọn add new sequence to project để kết thúc việc nhập trình tự Cửa sổ sequence Attributes hiện ra cho phép nhập thông tin mô tả trình tự

™ Nhập trình tự con Oligo

Để nhập trình tự mồi ta làm các bước sau:

- Vào Menu Oligo, chọn New Oligo

- Phần Name: Nhập tên đoạn oligo vào

- Note: Chọn màu đoạn mồi

- Seq 5’: Nhập trình tự con vào

™ Alignment giữa mồi và trình tự

Vào menu Oligo, chọn Align Oligo with Sequence Ta có kết quả align của mồi và trình tự

3.2.2.2 Thiết kế mồi bằng phần mềm ClustalX

ClustalX là một phần mềm dùng để so sánh tương đồng nhiều trình tự DNA hay trình tự protein Nó mô tả kết quả bằng hệ thống các màu sắc và làm nổi bật những nét đặc trưng trong những đoạn tương đồng

Chương trình Clustal thực hiện xếp gióng cột trình tự qua 3 bước cơ bản sau:

- Xác định điểm tương đồng của các cặp trình tụ bằng phương pháp gióng cột từng cặp trình tự

- Xây dựng cây hướng dẫn dựa vào điểm tương đồng của các cặp trình tự

- Thực hiện sắp gióng cột các trình tự dựa vào cây hướng dẫn

™ Cách sử dụng chương trình

Để nhập dữ liệu cho chương trình ClustalX, thực hiện các bước sau:

- Mở chương trình Clustal từ Desktop

- Lựa chọn chức năng Multiple Alignment Mode

- Từ Menu File, chọn Load Sequences

- Trong hộp Open, chọn tập tin có chứa các trình tự cần so sánh Nhấn nút Open

- Chọn Do Complete Alignment để thực hiện sắp gióng cột

3.2.3 Phương pháp Taqman Real time PCR

3.2.3.1 Nguyên tắc của kỹ thuật Real-time PCR sử dụng Taqman mẫu dò

Trong kỹ thuật này, real-time PCR mix ngoài các thành phần cơ bản của PCR mix còn chứa hai thành phần quan trọng để mẫu dò có thể phát huỳnh quang được khi

có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích, đó là Taqman mẫu dò

và enzyme Taq  polymerase Taqman mẫu dò là những oligonucleotides có trình tự bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích, và trình tự này dài khoảng 24 đến 30 bases với đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang (gọi là reporter) còn đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tương ứng (gọi là quencher) để hấp phụ ánh sáng huỳnh quang được phát ra từ

reporter Enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease để có khả năng thủy

giải cắt bỏ mẫu dò khi mẫu dò này bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu 3’ của mồi khi enzyme kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung

Hình 3.1 Nguyên tắc của kỹ thuật Real-time PCR sử dụng Taqman mẫu dò. (http://www.asuragen.com)

Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích, Taqman mẫu dò vẫn còn nguyên vẹn do vậy mà huỳnh quang phát ra được từ reporter

ở đầu 5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ của mẫu dò hấp phụ, ống thử nghiệm sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích

Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman mẫu dò sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị

enzyme Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy mà

reporter của Taqman mẫu dò sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Càng nhiều sản phẩm khuếch đại thì số lượng reporter tự do sẽ càng nhiều, đến một lúc nào đó cường độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích

3.2.3.2 Phản ứng singleplex Taqman Real-time PCR

Phản ứng singleplex Taqman Real-time PCR được xây dựng riêng rẽ cho gen SMN2 và gen beta-actin có thành phần là:

- 12,5 µl Mastermix

- 0,25 µl mỗi mồi bao gồm mồi cho gen SMN2 và mồi cho gen beta-actin

- 0,25 µl mỗi mẫu dò bao gồm mẫu dò cho gen SMN2 và gen beta-actin

- 5 µl DNA

- 6,5 µl nước cất vừa đủ 25 µl thể tích phản ứng

Với chu trình nhiệt là

- 1 chu kỳ: 950C trong 15 phút

- 40 chu kỳ: 950C trong 15 phút, 550C trong 1 phút và 720C trong 20 giây

3.2.3.3 Phản ứng multiplex Taqman Real-time PCR

Trong khuôn khổ bài khóa luận, chúng tôi sẽ xây dựng quy trình multiplex đối với phản ứng Taqman Real-time PCR Điều này có ý nghĩa lớn trong việc xác định số lượng bản sao gen SMN2 bằng gen tham chiếu Trong phản ứng multiplex, nhiều mồi được sử dụng cùng lúc để khuếch đại các đoạn có kích thước khác nhau Điều quan trọng trong phản ứng multiplex là phải tìm cho được điều kiện tối ưu về nhiệt độ lai để tránh các hiện tượng ức chế lẫn nhau Vì tất cả đều được thực hiện trong một phản ứng nên sẽ tiết kiệm được thời gian cũng như số lần thực hiện phản ứng

Quy trình phản ứng multiplex Real-time PCR gồm các thành phần sau:

- 12,5 µl mastermix

- 0,25 µl mỗi mồi bao gồm mồi cho gen SMN2 và mồi cho gen beta-actin

- 0,25 µl mỗi mẫu dò bao gồm mẫu dò cho gen SMN2 và gen beta-actin

- 5 µl DNA

- 6 µl nước cất vừa đủ 25 µl thể tích phản ứng

Với chu trình nhiệt như đối với phản ứng Singleplex Real- time PCR

Bên cạnh đó, chúng tôi bố trí thêm một chứng âm với nguồn DNA được thay bằng nước cất vô trùng để kiểm tra sự nhiễm trong quá trình phản ứng

3.2.4 Phương pháp định lượng tương đối dựa trên gen tham chiếu

3.2.4.1 Phương pháp Livak (2 -∆∆Ct )

Theo Livak và ctv, 2001, phương pháp này chỉ áp dụng được trong trường hợp cả

gene tham chiếu và gene đích được khuếch đại với hiệu quả gần 100% và trong phạm

vi 5% của mỗi gene Trước khi sử dụng phương pháp này cần kiểm tra lại hiệu quả khuếch đại của gene đích và gen tham chiếu Phương pháp này có ưu điểm là dễ dàng

thực hiện nên được ứng dụng rộng rãi Công thức tính của phương pháp này như sau:

Đầu tiên cần chuẩn hóa giá trị Ct của gene đích và gene tham chiếu ở mẫu thí nghiệm và mẫu chuẩn:

∆Ct(mẫu) = Ct(mục tiêu mẫu) – Ct(tham chiếu mẫu)

∆Ct(chuẩn) = Ct(mục tiêu chuẩn) – Ct(tham chiếu chuẩn)

Tiếp theo, chuẩn hóa giá trị ∆Ct của mẫu thí nghiệm theo ∆Ct của mẫu chuẩn: ∆∆Ct = ∆Ct(mẫu) - ∆Ct(chuẩn)

Cuối cùng tính tỷ số biểu hiện:

2-∆∆Ct = tỷ số biều hiện được chuẩn hóa

Tùy theo tỷ số biểu hiện được chuẩn hóa ta có thể suy ra được số lượng bản sao tương đối của gene mục tiêu như bảng sau:

Bảng 3.1 Tương quan giữa 2-∆∆Ct và số bản sao

2-ΔΔCt Số bản sao tương đối ước tính