Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình PCR đa mồi để phân tích kiểu gen của rs1501299 trên gen ADIPQ ở người Việt Nam. Đối tượng và phương pháp: Các mẫu ADN người Việt Nam được sử dụng làm mẫu thử nghiệm. Sử dụng các phần mềm tin sinh thiết kế 4 mồi theo nguyên lý của kỹ thuật CTPP (contronting two-pair primers) để đưa vào trong một phản ứng PCR.
Tạp chí y dợc học quân số 6-2021 XY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÂN TÍCH KIỂU GEN CỦA ĐA HÌNH rs1501299 GEN ADIPOQ Ở NGƯỜI VIỆT NAM Trần Quang Thun1,2, Đinh Hồng Dương2, Trần Quang Bình3 TĨM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình PCR đa mồi để phân tích kiểu gen rs1501299 gen ADIPQ người Việt Nam Đối tượng phương pháp: Các mẫu ADN người Việt Nam sử dụng làm mẫu thử nghiệm Sử dụng phần mềm tin sinh thiết kế mồi theo nguyên lý kỹ thuật CTPP (contronting two-pair primers) để đưa vào phản ứng PCR Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp để xác định chu trình nhiệt thích hợp Sử dụng phương pháp giải trình tự gen Sanger để kiểm chứng kết quy trình Kết quả: Xây dựng thành cơng quy trình PCR với mồi cho phản ứng để phát kiểu gen rs1501299 với kết nhanh xác Kết luận: Kết nghiên cứu sử dụng quy mô lớn để xác định tỷ lệ kiểu gen phân tích mối liên quan đa hình rs1501299 gen ADIPOQ với hội chứng chuyển hóa người Việt Nam * Từ khóa: rs1501299, gen ADIPOQ, CTPP-PCR A Multiplex PCR Assay for Genotyping ADIPOQ Rs1501299 Polymorphism in Vietnamese People Summary Objectives: To develop a multiplex PCR assay for the detection of rs1501299 polymorphism in Vietnamese people Subjects and methods: DNA samples from a group of Vietnamese people were used to evaluate this assay Some bioinformatics software was used to design four primers for a multiplex PCR The optimal melting temperature of primers was identified in proper thermal cycling The Sanger sequencing method was used to confirm the results of this assay Results: The multiplex PCR protocol with four primers successfully identified ADIPOQ rs1501299 polymorphism rapidly and accurately Conclusion: The multiplex PCR protocol should be applied to genotyping rs1501299 polymorphism in a large population to investigate the association between this polymorphism and metabolic syndrome in the Vietnamese people * Keywords: rs1501299; ADIPOQ gene; CTPP-PCR Viện Y học Dự phòng Quân đội Học viện Quân y Viện Dinh dưỡng Quốc gia Người phản hồi: Trần Quang Bình (tranquangbinh@dinhduong.org.vn) Ngày nhận bài: 05/5/2021 Ngày báo ng: 27/5/2021 29 Tạp chí y dợc học quân sè 6-2021 ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng chuyển hóa (HCCH) hình thành tương tác qua lại yếu tố di truyền yếu tố môi trường [10] Tại Việt Nam có số nghiên cứu yếu tố môi trường liên quan đến HCCH [1, 2, 3], nhiên, thiếu nghiên cứu gen liên quan đến hội chứng Gen ADIPOQ mã hóa tổng hợp adiponectin, hocmone liên quan tới q trình điều hịa chuyển hóa glucose, lipid kiểm sốt lượng, đồng thời coi hocmone “chìa khóa” liên quan đến HCCH [9] Đa hình đơn nucleotid (SNP - single nucleotid polymophism) rs1501299 nằm đoạn intron thuộc gen ADIPOQ, biến đổi alen G thành alen T SNP liên quan đến trình trạng giảm nồng độ hocmone adiponectin máu, từ tác động lên chế hình thành HCCH [8] Nhiều nghiên cứu quần thể khác tìm mối liên quan rs1501299 với HCCH [4, 6] Tuy nhiên, tỷ lệ kiểu gen ảnh hưởng SNP đến HCCH không giống quần thể Xác định kiểu gen SNP bước quan trọng thực nghiên cứu tìm hiểu vai trò yếu tố gen hay tương tác gen mơi trường chế hình thành bệnh Tuy nhiên, với loại hình nghiên cứu thường địi hỏi cỡ mẫu lớn Do đó, phương pháp phân tích kiểu gen SNP lựa chọn thường yêu cầu: nhanh, xác, giá thành phù hợp Hai số phương pháp là: AS-PCR (Allen specific polymerase chain reaction) RFLP-PCR (Restriction fragment length polymorphism - polymerase chain reaction) Tuy vậy, tiến hành phương pháp cần nhiều thời gian tốn vật tư tiêu hao phải thực 30 phản ứng PCR (AS-PCR) cần điện di lần (RFLP-PCR) Do đó, chúng tơi tiến hành: Xây dựng quy trình PCR đa mồi để xác định kiểu gen rs1501299 gen ADIPQ thông qua thực phản ứng PCR lần điện di ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Mẫu ADN sử dụng nghiên cứu tách chiết từ máu toàn phần kít Wizard® Genomic ADN Purification (hãng Promega, Hoa Kỳ) từ 15 người, dân tộc Kinh, độ tuổi 40 - 64, sinh sống tỉnh Hà Nam Nghiên cứu phần đề tài “Nghiên cứu tập năm bệnh đái tháo đường hội chứng chuyển hóa người Việt Nam: Vai trị yếu tố lối sống di truyền” Đề tài Hội đồng Y đức Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương thông qua với Quyết định số IRB-VN01057-34/2016 Sau tách chiết, mẫu ADN bảo quản tủ âm 200C phịng thí nghiệm trước sử dụng vào nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu * Thiết kế mồi: Trình tự gen ADIPOQ đa hình rs1501299 lấy từ trang web Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Hoa Kỳ (NCBI) Các mồi thiết kế dựa trình tự sợi dương (chiều 5’3’) theo theo nguyên lý kỹ thuật CTPP với mồi (cặp vịng ngồi: F R, cặp vòng Ft Rg ) [5] Để tăng tính đặc hiệu cặp mồi vịng trong, chúng tơi thiết kế sai lệch nucleotit vị trí sát nucleotit đầu 3’ mồi vòng (Ft Rg) [7] Các mồi kiểm tra tính đặc hiệu, đặc tính mồi phần mềm thiết kế trực tuyến T¹p chÝ y dợc học quân số 6-2021 Primer-BLAST, OligoAnalyzer trc gửi tổng hợp công ty IDT (Hoa Kỳ) Trình tự mồi sau: F: 5’-CTGTTCTACTGCTATTAGCTC-3’; R: 5’-CTGTTCTACTGCTATTAGC TC-3’; Ft: 5’-TACACTGATATAAACTATATGAAAT-3’; Rg: 5’-AGGCCTTAGTTAATAAT GAATAC-3’ Với mồi trên, tùy vào kiểu gen rs1501299, phản ứng PCR tạo sản phẩm khuếch đại với kích thước: 463, 282 228 bp tương ứng với cặp mồi: F-R, F-Rg Ft-R * Tối ưu hóa phản ứng PCR đa mồi: Các mẫu ADN đo nồng độ xác định độ tinh máy ND2000 (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) Nồng độ mẫu ADN đưa vào phản ứng pha loãng nồng độ 16-20 ng/µl, tỷ lệ nồng độ bước sóng 260 280 mẫu ADN đạt từ 1,8 - 2,0 Tổng thể tích phản ứng PCR 6,5µl gồm 1,3µl nước tinh khiết (UltraPure Distilled Water, Invitrogen); 2,5µl GoTaq Green master Mix 2x (hãng Promga, Hoa Kỳ); 1,75µl cho mồi: R, F, Ft, Rg 2µl ADN mẫu Chọn mẫu ADN để thực tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp Phản ứng PCR thực máy Veriti™ 96-Well Thermal Cycler (hãng Applied Biosystems, Hoa Kỳ) Chu trình nhiệt: giai đoạn biến tính 940C phút, 35 chu kỳ với 940C 30 giây; nhiệt độ cặp cài đặt dải nhiệt độ: 52, 53, 54, 550C 40 giây; 720C 40 giây, giai đoạn kéo dài nhiệt độ 720C phút Thời gian giai đoạn bắt cặp cài đặt 30 40 giây với chu trình nhiệt để tối ưu thời gian bắt cặp phản ứng Đánh giá kết phản điện di sản phẩm khuếch đại thạch agarose 2,0% 100 volt 30 phút, đệm TBE 0,5X * Giải trình tự gen theo phương pháp Sanger: Lựa chọn mẫu ADN có kiểu gen khác nhau: GG, GT TT xác định quy trình PCR đa mồi gửi Cơng ty Genlab, Việt Nam để giải trình tự gen theo phương pháp Sanger Kết giải trình tự so sánh với kết quy trình theo phương pháp PCR-CTPP KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 15 mẫu ADN người sử dụng nghiên cứu đánh số từ - 15 mẫu số 10, 11, 13 chọn để thực tối ưu tìm nhiệt độ thời gian bắt cặp thích hợp cho phản ứng PCR đa mồi Kết cho thấy phản ứng có thời gian bắt cặp thích hợp 40 giây Hình 1: Kết tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp phản ứng PCR đa mồi Ghi chú: Hàng số thứ tự giếng Hàng kí hiệu tên mẫu: 10,11,13, chứng âm H2O, M thang Maker 100 bp Giếng 1,2,3 có nhiệt độ bắt cặp 520C; giếng 5,6,7 có nhiệt độ bắt cặp 530C; giếng 10,11,12 có nhiệt độ bắt cặp 540C; giếng 14,15,16, có nhiệt độ bắt cặp 550C 31 Tạp chí y dợc học quân số 6-2021 Hình cho thấy với chu trình nhiệt mô tả nhiệt độ bắt cặp 520C phản ứng PCR đa mồi cho kết băng 463bp, 282bp 228bp rõ Sử dụng chu trình nhiệt nhiệt độ bắt cặp tiến hành xác định kiểu gen rs1501299 cho 15 mẫu ADN Hình 2: Kết kiểu gen rs 1501299 phương pháp PCR đa mồi Ghi chú: Hàng số thứ tự giếng Hàng kí hiệu tên mẫu từ - 15; M thang Maker 100 bp; chứng âm H2O Kiểu gen GG có băng 463bp 282bp; kiểu gen GT có băng: 463bp ,282bp 228bp; Kiểu gen TT có băng 463bp 228bp Hình cho thấy kết kiểu gen đa hình rs1501299 15 mẫu ADN, có mẫu có kiểu gen GG (1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 12, 15), mẫu có kiểu gen GT (6, 7, 8, 11) mẫu có kiểu gen TT (13, 14) Chứng âm nước khơng có sản phẩm khuếch đại Để kiểm chứng kết quy trình này, chúng tơi chọn mẫu 10, 11 13 để thực giải trình tự gen theo phương pháp Sanger Hình 3: Kết giải trình tự gen mẫu 10, 11 13 Mẫu 10: kiểu gen GG, mẫu 11: kiểu gen GT, mẫu 13: kiểu gen TT Kết giải trình tự gen cho thấy kiểu gen đa hình rs1501299 mẫu 10, 11 13 trùng với kết phân tích kiểu gen quy trình PCR đa mồi ca chỳng tụi 32 Tạp chí y dợc học quân sù sè 6-2021 Trong thời gian gần đây, có nhiều phương pháp kỹ thuật để xác định kiểu gen SNP như: AS-PCR, RLFP-PCR, phương pháp Taqman, gen chip giải trình tự gen Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm Trong ASPCR RFLP-PCR phương pháp xác định kiểu gen thường áp dụng nhiều phịng thí nghiệm chúng cho kết xác khơng địi hỏi nhiều thiết bị đắt tiền Tuy nhiên, phương pháp tốn nhiều thời gian sử dụng nhiều vật tự tiêu hao với AS-PCR cần phải thực song song phản ứng PCR, RFLP-PCR cần phải thực lần điện di Phương pháp Taqman đòi hỏi cần probes để xác định số lượng sản phẩm PCR đặc hiệu q trình thực phản ứng, có độ xác cao cần có vật liệu thiết bị đắt tiền Phương pháp gen chip có giá thành cao, thường áp dụng tiến hành thực xác định kiểu gen với số lượng lớn SNP Phương pháp giải trình tự gen coi tiêu chuẩn vàng cho việc xác định kiểu gen chúng có độ tin cậy xác cao, nhiên, kỹ thuật tốn nhiều thời gian Ngồi ra, để thực kỹ thuật địi hỏi có nhân viên có kinh nghiệm huấn luyện, trang thiết bị vật tư tiêu hao thường có giá thành cao Do vậy, khó khăn áp dụng kỹ thuật rộng rãi phịng thí nghiệm Phương pháp kỹ thuật PCR đa mồi theo ngun lý CTPP khơng địi hỏi trang thiết bị phức tạp nên triển khai nhiều phịng thí nghiệm sinh học phân tử Ngồi ra, kỹ thuật cần sử dụng phản ứng PCR lần điện di tương tự kỹ thuật PCR thường quy giúp giảm thời gian giá thành thực Mặt khác, trình thực điện di ln xuất băng vịng ngồi (463 bp), băng có vai trị như chứng nội chẩn phản ứng Khi nhận định kết quả, phản ứng khơng có băng vịng ngồi cần xem xét lại Kết giải trình tự gen mẫu ADN trùng với kết xác định kiểu gen rs1501299 theo phương pháp chúng tơi, điều chứng tỏ quy trình PCR đa mồi cho kết đáng tin cậy KẾT LUẬN Nghiên cứu thiết kế thành cơng quy trình PCR đa mồi để xác định kiểu gen đa hình rs1501299 gen ADIPOQ Quy trình thực đơn giản, khơng u cầu thiết bị đắt tiền, cho kết nhanh xác Kết nghiên cứu áp dụng quy mơ cỡ mẫu lớn để phân tích kiểu gen đánh giá mối quan hệ rs1501299 với HCCH TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thế Hoàng, Nguyễn Ngọc Quang Thực trạng hội chứng chuyển hóa yếu tố liên quan bệnh nhân tăng huyết áp quản lý huyện Gio Linh, tỉnh Quảng Trị năm 2016 Tạp chí Y học Dự phịng 2017; 27:47-52 Trần Quang Thuyên, Đinh Hồng Dương, Trần Quang Bình Hội chứng chuyển hóa yếu tố liên quan phụ nữ thừa cân vùng nông thôn năm 2011 Tạp chí Y học Dự phịng 2020; 30:35-41 Binh TQ, Phuong PT, Nhung BT Metabolic syndrome among a middle-aged population in the Red River Delta region of Vietnam BMC Endocrine Disorders 2014; 14:77 33 Tạp chí y dợc học qu©n sù sè 6-2021 Gao M, Ding D, Huang J, Qu Y, Wang Y, Huang Q Association of genetic variants in the adiponectin gene with metabolic syndrome: A case-control study and a systematic metaanalysis in the chinese population PLOS ONE 2013; 8:e58412 Hamajima N, Saito T, Matsuo K, Kozaki K, Takahashi T, Tajima K Polymerase chain reaction with confronting two‐pair primers for polymorphism Genotyping Jpn J Cancer Res 2000; 91:865-868 Kaur H, Badaruddoza B, Bains V, Kaur A Genetic association of ADIPOQ gene variants (-3971A>G and +276G>T) with obesity and metabolic syndrome in North Indian Punjabi population PLOS ONE 2018; 13:e0204502 Little S Amplification-Refractory Mutation System (ARMS) analysis of point mutations 34 Current Protocols in Human Genetic 1995; 7:9.8.1-9.8.12 Matsushita K, Yatsuya H, Tamakoshi K, Wada K, Otsuka R, Takefuji S, et al Comparison of circulating adiponectin and proinflammatory markers regarding their association with metabolic syndrome in Japanese men Arterioscler Thromb Vasc Biol 2006; 26:871-876 Okamoto Y, Kihara S, Funahashi T, Matsuzawa Y, Libby P Adiponectin: A key adipocytokine in metabolic syndrome Clinical Science 2006; 110:267-278 10 Taylor JY, Kraja AT, Fuentes L de las, Stanfill AG, Clark A, Cashion A An overview of the genomics of metabolic syndrome Journal of Nursing Scholarship 2013; 45:52-59 ... mẫu 11: kiểu gen GT, mẫu 13: kiểu gen TT Kết giải trình tự gen cho thấy kiểu gen đa hình rs1501299 mẫu 10, 11 13 trùng với kết phân tích kiểu gen quy trình PCR đa mồi chúng tơi 32 Tạp chí y dợc... mẫu ADN có kiểu gen khác nhau: GG, GT TT xác định quy trình PCR đa mồi gửi Công ty Genlab, Việt Nam để giải trình tự gen theo phương pháp Sanger Kết giải trình tự so sánh với kết quy trình theo... thực 30 phản ứng PCR (AS -PCR) cần điện di lần (RFLP -PCR) Do đó, chúng tơi tiến hành: Xây dựng quy trình PCR đa mồi để xác định kiểu gen rs1501299 gen ADIPQ thông qua thực phản ứng PCR lần điện di