Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy và phân tích một số chỉ số chức năng ty thể của tế bào cơ tim chuột h9c2

Tế bào H9C2 là một dòng tế bào có nguồn gốc từ mô cơ tim phôi thai chuột BDX1 [41] và thường được sử dụng trong các mô hình nghiên cứu bệnh về tim như thiếu máu cục bộ cơ tim, phì đại cơ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

**********************

ĐOÀN THỊ DẬU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ

PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ SỐ CHỨC NĂNG TY THỂ CỦA TẾ BÀO

CƠ TIM CHUỘT H9C2

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

*****

ĐOÀN THỊ DẬU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀPHÂN TÍCH

MỘT SỐ CHỈ SỐ CHỨC NĂNG TY THỂ CỦA TẾ BÀO

CƠ TIM CHUỘT H9C2

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS VŨ THỊ THU

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Thu, người đã luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

luận văn cao học

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy, Cô giáo, các bạn học viên, sinh viên đang làm việc và học tập tại phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào, Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Trung tâm Khoa học sự sống, Khoa sinh học, các bạn học viên lớp K25 cao học Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và đặc biệt Ths Ngô Thị Hải Yến, người đã đồng hành giúp đỡ, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn

Tôi xin cảm ơn các anh, chị, bạn bè đồng nghiệp tại khoa Truyền máu Bệnh viện Nhi Trung ương đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt qúa trình học tập và thực hiện luận văn

Luận văn đã được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài Nafosted, mã số 106-YS.06-2016.23 và trang thết bị, cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm thuộc Trung tâm Khoa học Sự sống, Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Trân trọng!

Hà Nội, ngày 6 tháng 1 năm 2020

Học viên

Đoàn Thị Dậu

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Bệnh tim mạch 2

1.2 Các dòng tế bào cơ tim sử dụng trong nghiên cứu bệnh tim 2

1.3 Tế bào cơ tim chuột H9C2 5

1.3.1 Nguồn gốc, đặc điểm của tế bào H9C2 5

1.3.2 Tình hình sử dụng tế bào H9C2 trong nghiên cứu bệnh tim 5

1.4 Ty thể trong bệnh tim 8

1.4.1 Cấu trúc và chức năng ty thể 8

1.4.2 Rối loạn chức năng ty thể trong bệnh tim mạch 9

1.4.3 Nghiên cứu về ty thể trên dòng tế bào H9C2 11

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14

2.1 Vật liệu 14

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 14

2.1.2 Hóa chất 14

2.1.3 Phòng nuôi, thiết bị 14

2.2 Phương pháp 15

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 15

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Quy trình nuôi cấy tế bào H9C2 trong điều kiện thường 22

3.1.1 Hoạt hóa tế bào H9C2 22

3.1.2 Cấy chuyển tế bào H9C2 25

3.1.3 Bảo quản tế bào H9C2 28

3.2 Quy trình gây mô hình TMTTMCT (HR) trên tế bào H9C2 31

3.2.1 Mô hình TMTTMCT sử dụng CoCl2 31

3.2.2 Mô hình TMTTMCT sử dụng buồng thiếu oxy (buồng hypoxia) 35

3.3 Quy trình phân tích ty thể tế bào H9C2 42

3.3.1 Quy trình phân tích ty thể tế bào H9C2 42

3.3.2 Kết quả thử nghiệm quy trình phân tích ty thể 43

KẾT LUẬN 47

KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Tế bào cơ tim 3

Hình 1.2 Hình thái tế bào H9C2 6

Hình 1.3 Cấu trúc ty thể 8

Hình 1.4 Ty thể và cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh tim mạch 9

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 15

Hình 2.2 Quy trình chung nuôi cấy tế bào H9C2 theo hướng dẫn của ATCC 16

Hình 3.1 Các bước hoạt hóa tế bào H9C2 trong nghiên cứu 24

Hình 3.2 Ảnh tế bào H9C2 sau hoạt hóa 24h 25

Hình 3.3 Ảnh tế bào H9C2 phát triển tốt sau hoạt hóa một thời gian 26

Hình 3.4 Các bước cấy chuyển tế bào H9C2 trong nghiên cứu 27

Hình 3.5 Ảnh đại diện ghi nhận sự phát triển của tế bào sau khi cấy chuyển tại các một số mốc thời gian 29

Hình 3.6 Các bước bảo quản tế bào H9C2 trong nghiên cứu 30

Hình 3.7 Các bước gây mô hình TMTTMCT sử dụng CoCl 2 trên tế bào H9C2 trong nghiên cứu 32

Hình 3.8 Ảnh hưởng của CoCl 2 lên tế bào H9C2 34

Hình 3.9 Ảnh hưởng của CoCl 2 lên khả năng sống của tế bào H9C2 35

Hình 3.10 Nguyên vật liệu cần thiết để tạo buồng hypoxia 37

Hình 3.11 Buồng hypoxia sau khi hoàn thành 37

Hình 3.12 Các bước sử dụng buồng hypoxia 39

Hình 3.13 Các bước gây mô hình HR sử dụng buồng hypoxia trên tế bào H9C2 Hình 3.14 Tỷ lệ tế bào sống khi thử nghiệm buồng hypoxia 41

Hình 3.15 Tế bào H9C2 ở các điều kiện thiếu oxy/tái cung cấp oxy 42

Hình 3.16 Các bước phân tích ty thể tế bào H9C2 44

Hình 3.17 Mật độ huỳnh quang NAO của ty thể tế bào H9C2 khi nuôi ở các điều kiện khác nhau 45

Hình 3.18 Mật độ ty thể trong tế bào H9C2 ở các điều kiện khác nhau 46

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các môi trường, hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 144 Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 155 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của CoCl 2 ở các nồng độ tới khả năng sống tế bào H9C2…

345

Bảng 3.2 Tỷ lệ tế bào H9C2 sống khi thử nghiệm buồng hypoxia……… 40 Bảng 3.3 Tỷ lệ mật độ huỳnh quang NAO ty thể tế bào H9C2 khi nuôi ở các điều kiện khác nhau ……… 45

ESCs Tế bào gốc phôi chuột

HR Hypoxia/reoxygenation (Thiếu oxy/tái cung cấp oxy) iPSCs Tế bào gốc đa năng cảm ứng

LDH Lactate dehydrogenase

MTG MitoTracker Green

NAO 10-N-nonyl-acridine orange

ROS Reactive oxygen spicies (Gốc tự do oxy hóa)

TMTTMCT Thiếu máu tái tưới máu cơ tim

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh tim mạch là một trong những bệnh lý có khả năng gây tử vong cao trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng Dữ liệu khoa học cho thấy, những tổn thương trong bệnh lý tim mạch có liên quan nhiều đến sự thay đổi cấu trúc và chức năng ty thể của tế bào cơ tim [2, 75] Vì vậy, nghiên cứu phương pháp phòng và chống bệnh tim mạch hướng đích ty thể thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học Thực tế, nhiều nghiên cứu đã tập trung phân tích sự thay đổi cấu trúc và chức năng của bào quan này như khả năng tổng hợp năng lượng ATP, thành phần lipid màng, giá trị điện thế lớp màng ty thể hay hoạt động của chuỗi hô hấp ty thể [40, 53] Việc phân tích các chỉ số chức năng ty thể là cơ sở để đánh giá ảnh hưởng của thuốc hoặc các chất lên ty thể cũng như tế bào cơ tim

Tế bào H9C2 là một dòng tế bào có nguồn gốc từ mô cơ tim phôi thai chuột BDX1 [41] và thường được sử dụng trong các mô hình nghiên cứu bệnh về tim như thiếu máu cục bộ cơ tim, phì đại cơ tim, nghiên cứu ảnh hưởng của các độc tố, nghiên cứu sàng lọc và tạo thuốc mới Tuy nhiên, hiện nay tại Việt Nam các nghiên cứu sử dụng tế bào này để thiết kế mô hình bệnh tim mạch còn khá mới Do vậy, việc xây dựng và hoàn thiện quy trình nuôi cấy tế bào ổn định, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam nhằm phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu là cần thiết

Với định hướng phát triển nghiên cứu thực nghiệm bệnh tim, đặc biệt là bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim trên cơ sở sử dụng dòng tế bào H9C2 tại Việt Nam, đề tài

“Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy và phân tích một số chỉ số chức năng

ty thể của tế bào cơ tim chuột H9C2” được thực hiện với hai mục tiêu chính sau:

- Xây dựng quy trình nuôi cấy dòng tế bào cơ tim chuột H9C2

- Phân tích một số chỉ số chức năng ty thể của tế bào cơ tim chuột H9C2

Đề tài này nằm trong khuôn khổ nội dung nghiên cứu của đề tài Nafosted

“Nghiên cứu, sàng lọc chất c tác dụng bảo vệ cơ tim hướng đích ty thể sử dụng mô hình thiếu máu cục bộ cơ tim trên tim chuột cô lập và tế bào tim chuột nuôi cấy”,

mã số 106-YS.06-2016.23 Nghiên cứu được thực hiện tại các phòng Thí nghiệm thuộc Trung tâm Khoa học Sự sống, Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Bệnh tim mạch

Bệnh tim mạch (cardiovascular diseases - CVD) gồm một nhóm các bệnh liên quan đến hệ thống tim mạch như: bệnh động mạch vành, đau thắt ngực, đột qụy, bệnh tim bẩm sinh, bệnh van tim, phình động mạch chủ….[10] Bệnh lý này có nguy cơ gây tử vong cao và có tính chất đột ngột Trên thế giới, năm 2016 đã c khoảng 17,6 triệu người chết vì các bệnh tim mạch [10] Tỷ lệ tử vong sớm do bệnh tim mạch dao động từ 4% (ở các nước thu nhập cao) đến 42% (ở các nước thu nhập thấp) [63] Mặc dù CVD thường ảnh hưởng đến người trưởng thành trong giai đoạn sau của cuộc đời, các triệu chứng như xơ vữa động mạch thường bắt đầu sớm hơn,

do vậy việc phòng ngừa sớm là rất quan trọng [48]

Những tiến bộ khoa học gần đây đã giúp làm sáng tỏ hơn về các nguyên nhân cơ bản của bệnh tim Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu thường sử dụng các mô hình khác nhau và hướng tập trung vào sinh lý bệnh hoặc các ứng dụng điều trị bệnh Bên cạnh vấn đề đạo đức nghiên cứu, việc thực nghiệm phân tích bệnh lý cơ tim ở cấp độ tế bào, mô cơ tim của người bệnh gần như là không thể thực hiện Để giải quyết vấn đề này, nhiều loài động vật như lợn, thỏ, chuột đã trở thành các đối tượng nghiên cứu do mức độ khá tương đồng của chúng so với người và thường được lựa chọn để thay thế Từ các nguồn động vật này, nhiều dòng tế bào cơ tim được cô lập, nuôi cấy và duy trì với các yêu cầu kỹ thuật không quá phức tạp, giúp chúng trở thành đối tượng lý tưởng cho nghiên cứu cơ chế sinh bệnh lý tim và phân tích dược lý liên quan [51]

1.2 Các dòng tế bào cơ tim sử dụng trong nghiên cứu bệnh tim

Nghiên cứu các bệnh về tim có thể dùng các loại tế bào được phân lập trực tiếp từ cơ tim và nuôi cấy (primary cultural cells), các dòng tế bào cơ tim bất tử (cardiomyocyte cell lines) và các dòng tế bào mang một số đặc điểm của tế bào cơ tim (cardiomyogenic cell lines) Tuy nhiên, việc phân lập tế bào từ mô cơ tim và nuôi cấy tương đối phức tạp, phải chịu áp lực về mặt thời gian vì các tế bào có thời gian sống ngắn, nên chúng thường được sử dụng sau giai đoạn thử nghiệm trên các dòng tế bào nuôi cấy ổn định Do vậy, trong giai đoạn thử nghiệm đầu tiên của các nghiên cứu bệnh tim mạch ở cấp độ tế bào, các dòng tế bào cơ tim nuôi ổn định hay

dòng tế bào bất tử (dòng tế bào thương mại) thường được sử dụng Sự phát triển của các dòng tế bào cơ tim bất tử, sinh sôi nảy nở dễ dàng trong nuôi cấy nhưng vẫn duy trì một kiểu hình nhất định đã cung cấp cho các nhà nghiên cứu một công cụ hiệu quả để thăm dò, phân tích các cơ chế sinh-bệnh lý của tế bào tim, và tim

Có nhiều dòng tế bào cơ tim bất tử (cardiomyocytecell lines) được thiết lập

và dùng trong các thí nghiệm nghiên cứu các bệnh lý tim như dòng tế bào AC16 [20], HL-1 [19], H9C2 [33]… Dòng tế bào AC16 được tạo ra từ mô thất trái của người trưởng thành có thể là lựa chọn trong các công việc nghiên cứu phân tích các quá trình sau phân bào [20]

Hình 1.1 Tế bào cơ tim

A) Tế bào HL-1; B) Tế bào AC 16

(https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/ )

Dòng tế bào cơ tim HL-1 là dòng tế bào cơ tim của chuột có nguồn gốc từ các tế bào của khối u tâm nhĩ Tế bào HL-1 có thể liên tục phân chia qua nhiều thế

hệ mà vẫn giữ được các đặc tính hình thái, sinh h a và điện sinh lý Các tế bào

HL-1 đã được sử dụng để nghiên cứu chức năng tế bào cơ tim bình thường liên quan đến tín hiệu, điện, chuyển h a và điều hòa phiên mã cũng như để giải quyết các tình trạng bệnh lý như thiếu oxy, tăng glucose máu - tăng insulin máu, sự chết theo chương trình và thiếu máu cục bộ,…[19]

Dòng tế bào cơ tim phôi chuột H9C2 thường được sử dụng trong nhiều nghiên

cứu in vitro, bao gồm phân tích vai trò, chức năng độc tính của chất/thuốc mới đối

với tim [17, 47] Nghiên cứu gần đây đã phân tích ảnh hưởng của số thế hệ tế bào cấy chuyển (tối đa là 25 thế hệ) đến kết quả phân tích độc tính của tế bào gây ra bởi

doxorubicin cho thấy, khi số thế hệ cấy chuyển càng tăng thì kết quả thu được ở các lần phân tích khác nhau sẽ c sự biến thiên cao [55] H9C2 cũng được sử dụng nhiều trong nghiên cứu về bệnh phì đại cơ tim [16, 77], nghiên cứu các enzym chuyển hóa thuốc trong cơ tim [82] Đặc biệt, dòng tế bào này được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu bệnh lý thiếu máu cục bộ-tái tưới máu cơ tim (TMTTMCT)/ hypoxia-reoxygenation (HR) Trong các điều kiện thiếu oxy-tái cung cấp oxy, tế bào H9C2 thể hiện những đặc điểm khác biệt về trao đổi chất năng lượng, chức năng ty thể và tính nhạy cảm với môi trường so với dòng tế bào HL-1 [43]

Bên cạnh các dòng tế bào cơ tim ổn định như trên, một số dòng tế bào khác có nguồn gốc không phải từ tim (cardiomyogenic cell lines) cũng được sử dụng trong một số nghiên cứu về tim như P19 [74], ESCs [60], iPSCs [69] Dòng tế bào P19 được phân lập từ tế bào ung thư biểu mô phôi chuột thực nghiệm Các tế bào này là

đa bội và có thể phân hóa thành các loại tế bào của cả ba lớp phôi, bao gồm cả tế bào

cơ tim Do khả năng biệt hóa thành tế bào cơ tim, chúng được sử dụng để phân tích vai trò của các yếu tố phiên mã đặc hiệu của tim cũng như đường dẫn tín hiệu ngược trong sự biệt hóa tế bào tim và gần đây nhất là để thử nghiệm đánh giá khả năng tương thích sinh học [74] Ngoài ra, các tế bào gốc như ESCs - tế bào gốc phôi chuột

- được phân lập từ các nguồn phôi nang khác nhau và iPSCs - tế bào gốc đa năng cảm ứng - được trực tiếp tạo ra từ các tế bào sinh dưỡng đã cung cấp một mô hình hữu ích cho nghiên cứu sự phát triển cũng như sự biệt hóa tế bào cơ tim [60, 69]

Các dòng tế bào cơ tim bất tử cũng như các dòng tế bào khác mang đặc tính

của tế bào cơ tim đã được ứng dụng nhiều trong các mô hình nghiên cứu in vitro về

cơ chế bệnh sinh cũng như các phương pháp trị liệu bệnh tim Trong đ , tế bào cơ tim chuột H9C2 thể hiện một số đặc điểm ưu việt hơn như dễ nuôi cấy, có tính ổn định cao qua các lần cấy chuyển và có khả năng mô phỏng tốt nhiều điều kiện bệnh

lý tim Do vậy, trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy tế bào H9C2 cũng như thiết lập mô hình tổn thương TMTTMCT/HR sử dụng dòng tế bào này, để đánh giá hiệu quả của quá trình nuôi cấy và ứng dụng của H9C2 trong mô hình thiết lập được Đây là bước tiền đề, là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm phòng và chống lại bệnh lý tim nguy hiểm này

1.3 Tế bào cơ tim chuột H9C2

1.3.1 Nguồn gốc, đặc điểm của tế bào H9C2

Dòng tế bào cơ tim H9C2 là một nhánh của dòng tế bào có nguồn gốc từ mô

phôi chuột BD1X, Rattus norvegicus, được nghiên cứu lần đầu bởi Kimes và Brandt

năm 1976 Về hình thái, đây là tế bào mô cơ tim với đầy đủ các đặc tính của nguyên bào cơ và được phân vào nhóm tế bào bám dính (Hình 1.2) [33, 65] Trên bề mặt, tế bào H9C2 có các thụ thể Acetylcholine, do đ c thể đáp ứng lại các kích thích với

Acetylcholine Dòng tế bào này sinh trưởng tốt trong điều kiện in vitro, cho phép

công việc nuôi cấy trở nên tương đối dễ dàng Theo khuyến cáo của hãng ATCC, môi trường cơ bản để nuôi cấy dòng tế bào này là môi trường Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) có bổ sung 10% huyết thanh bò (Fetal bovine serum - FBS) [6] Ngoài nuôi cấy bằng môi trường cơ bản DMEM, nghiên cứu của Syam và

cs (2016) đã tiến hành nuôi tế bào H9C2 trong môi trường RPMI1640 có bổ sung 10% FBS ở 370C, 5% CO2 [68]

Các tế bào H9C2 giống các tế bào tim trưởng thành ở một số đặc điểm liên quan đến sự trao đổi năng lượng mức ATP trong tế bào, sự trao đổi chất, cấu trúc và hoạt động của các G protein, các kênh ion [33], chức năng và hình thái của ty thể của tế bào cơ tim [43] Tế bào H9C2 có beta-tubulin II là yếu tố đ ng vai trò quan trọng trong chức năng và điều hòa ty thể H9C2 cũng nhạy cảm với các tổn thương oxy hóa, chúng có thể làm giảm khả năng sống của tế bào và chức năng ty thể [43]

1.3.2 Tình hình sử dụng tế bào H9C2 trong nghiên cứu bệnh tim

Như đã đề cập ở trên, dòng tế bào H9C2 được sử dụng trong các nghiên cứu sinh lý bệnh cũng như các nghiên cứu đánh giá và thử nghiệm thuốc điều trị nhiều loại bệnh tim mạch như: bệnh phì đại cơ tim [77], bệnh TMTTMCT [46]… Bên cạnh đ , nhiều nghiên cứu về độc tính, sự chết theo chu trình và sự biệt hóa của tế bào cơ tim cũng được thực hiện trên dòng tế bào này [42, 52]

Năm 2011, Watkins và cs tiến hành nghiên cứu so sánh khả khăng mô phỏng bệnh lý phì đại cơ tim giữa dòng tế bào H9C2 và tế bào cơ tim chuột sơ sinh sơ cấp bằng cách sử dụng các chất kích thích sự phì đại Trong nghiên cứu này, tế bào cơ

tim chuột sơ sinh sơ cấp và tế bào H9C2 được nuôi cấy in vitro và điều trị bằng

angiotensin II và endothelin-1 để thúc đẩy phản ứng phì đại Sự gia tăng kích thước kết hợp với sự sắp xếp lại khung xương của tế bào và cảm ứng gen tim thai được so sánh trực tiếp ở cả hai loại tế bào sử dụng kính hiển vi và real-time PCR Kết quả cho thấy, tế bào H9C2 có phản ứng phì đại gần như giống hệt với các phản ứng được quan sát thấy trong tế bào cơ tim chuột sơ sinh sơ cấp Phát hiện này đã xác

nhận tầm quan trọng của tế bào H9C2 trong mô hình nghiên cứu in vitro về chứng

phì đại tim Tế bào H9C2 cùng với các dòng tế bào cơ tim của người là phương tiện quan trọng cho các nghiên cứu phân tử về bệnh tim [77]

Kế đ , năm 2017, Jinanhua và cs đã tiến hành kiểm chứng khả năng bảo vệ

tế bào cơ tim của Osmotin khỏi các thương tổn do thiếu máu TMTTMCT sử dụng

tế bào H9C2 Tương tự như nghiên cứu của Beshay và cs trước đ , tế bào H9C2 được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 10% FBS, 100 U/ml penicillin,

100 µg/ml streptomycin và 2 mM glutamine, 5% CO2, 370C Tế bào được gây mô hình tổn thương TMTTMCT bằng phương pháp của Wu và cs (2013) Tế bào được cấy trên đĩa 35 mm với mật độ 3x105 tế bào/giếng và nuôi ổn định trong 24 giờ Tiếp đ , các tế bào này sẽ được kích thích thương tổn TMTTMCT bằng cách nuôi trong môi trường không có oxy (95% Nitơ, 5% CO2) ở 370C trong 4 giờ Cuối cùng, lượng đường trong môi trường được điều chỉnh về nồng độ 4,5 mg/ml và tế bào tiếp tục được nuôi với điều kiện nuôi cấy giống ban đầu (95% không khí, 5% CO2,

370C) trong 24 giờ Để đánh giá tế bào sau khi gây TMTTMCT, nhóm nghiên cứu

đã sử dụng các tiêu chí về tỷ lệ tế bào sống, lượng lactate dehydrogenase (LDH) giải ph ng, lượng tế bào chết theo chu trình, lượng ROS sinh ra Để đánh giá khả năng bảo vệ của Osmotin, Jianhua và cs đã sử dụng các chỉ tiêu về siRNA với đích AdipoR1 và AdipoR2, biểu hiện TNF-α, IL-1β, IL-8 và IL-6 Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng mô hình thiếu máu cơ tim cục bộ và tái tưới máu bằng OGD/R và đánh giá được khả năng bảo vệ tế bào H9C2 khỏi các thương tổn

do OGD/R thông qua con đường tín hiệu AdipoR1/PI3K/AKT [37, 79]

Với đặc tính dễ nuôi cấy và ổn định, tế bào H9C2 được sử dụng nhiều trong nghiên cứu mô phỏng điều kiện bệnh lý tim Tuy nhiên, việc ứng dụng dòng tế bào trong nghiên cứu bệnh tim ở Việt Nam còn khá mới Do vậy, việc xây dựng một quy trình nuôi cấy tế bào H9C2 phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam là hết sức quan trọng Điều này sẽ cung cấp thêm một công cụ mới và hữu hiệu trong nghiên cứu bệnh tim mạch nói chung và bệnh thiếu máu cục bộ-tái tưới máu cơ tim n i riêng ở nước ta

1.4 Ty thể trong bệnh tim

1.4.1 Cấu trúc và chức năng ty thể

Ty thể là bào quan có mặt ở hầu hết các loại tế bào của sinh vật nhân thực, nhưng số lượng của chúng phụ thuộc vào nhu cầu năng lượng của từng loại tế bào Các tế bào có chuyển hóa cao như tế bào gan, tế bào cơ tim, tế bào thần kinh… có

số lượng ty thể lớn (khoảng 1000 đến 2000 ty thể trong mỗi tế bào gan) Ở cơ tim của người trưởng thành, số lượng ty thể chiếm khoảng 30% thể tích tế bào [56]

Hình 1.3 Cấu trúc ty thể [66]

Ty thể c đặc điểm cấu trúc khá độc đáo, được bao bọc bởi 2 lớp màng gồm màng ngoài và màng trong có cấu tạo từ phospholipid kép và protein Màng trong ty thể chứa một loại lipid hiếm gặp là cardiolipin - một chất đặc trưng của màng ty thể [24], và có cấu trúc gấp nếp lấn sâu vào bên trong tạo thành mào mở rộng diện tích

và nâng cao khả năng sản xuất ATP (Hình 1.3)

Ty thể đ ng vai trò quan trọng trong cả sự sống và chết của các tế bào cơ tim Trong các tế bào khỏe mạnh, chức năng chính của chúng là đáp ứng nhu cầu năng lượng cao của tim bằng cách cung cấp ATP thông qua quá trình phosphoryl

hóa oxy hóa Ty thể chiếm một phần lớn của mỗi tế bào cơ và nằm giữa các tơ cơ và ngay dưới màng tế bào cơ Vị trí chiến lược và sự phong phú của ty thể đảm bảo một hệ thống phân phối ATP cục bộ hiệu quả cao để hỗ trợ co b p, trao đổi chất và cân bằng nội môi trong tế bào [28] Bên cạnh đ , ty thể cũng là yếu tố quan trọng điều chỉnh sự chết của tế bào, đáp ứng với nhiều tín hiệu stress khác nhau, bao gồm

sự mất các yếu tố tăng trưởng, thiếu oxy, stress oxy hóa, tổn thương DNA và các yếu tố khác để kích hoạt sự chết theo chu trình [28-30]

1.4.2 Rối loạn chức năng ty thể trong bệnh tim mạch

Với vai trò là trung tâm sản sinh năng lượng cũng như trung tâm của sự chết

tế bào cơ tim Sự rối loạn chức năng ty thể liên quan đến cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh tim mạch như xơ vữa động mạch, tổn thương thiếu máu cục bộ - tái tưới máu

cơ tim (Ischemia/Reperfusion), cao huyết áp, tiểu đường, phì đại cơ tim và suy tim (Heart failure), do sự sản xuất không kiểm soát ROS (Hình 1.4) [12] Vì vậy, việc kiểm soát sớm rối loạn chức năng ty thể là một bước quan trọng trong điều trị bệnh tim mạch [64]

Hình 1.4 Ty thể và cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh tim mạch [12]

* Rối loạn chức năng ty thể trong bệnh xơ vữa động mạch

Xơ vữa động mạch là một quá trình viêm mãn tính và yếu tố nguy cơ phổ biến nhất của bệnh động mạch vành (Coronary artery disease - CAD) CAD có khả năng gây tử vong cao và được đặc trưng bởi thiếu máu cục bộ cấp tính hoặc mãn tính do lượng oxy cung cấp cho cơ tim bị giảm hoặc dừng đột ngột [39] Nhiều nghiên cứu cho thấy, ty thể đ ng vai trò quan trọng trong sinh lý bệnh xơ vữa động mạch Sự rối loạn chức năng ty thể dẫn đến sản sinh quá mức ROS, gây nên tình trạng oxy hóa protein, lipit và DNA ty thể cũng như tế bào [11] DNA ty thể đặc biệt dễ bị tổn thương oxy h a vì n thiếu protein histones và ít khả năng sửa chữa Hơn nữa, đột biến DNA ty thể, ngược lại cũng kích hoạt chu kỳ sản xuất ROS [9] Nghiên cứu cho thấy, trên chuột thiếu apo-E biểu hiện sự thiếu enzym chống oxy hóa SOD-2 có mức ROS cao làm tổn thương DNA ty thể, tăng sinh tế bào cơ trơn mạch máu và đẩy nhanh tiến trình của xơ vữa động mạch [8]

* Rối loạn chức năng ty thể trong bệnh phì đại cơ tim và suy tim

Trong bệnh phì đại cơ tim, sự tăng trưởng tế bào cơ tim đòi hỏi nhiều năng lượng hơn và do vậy có sự gia tăng số lượng của ty thể Nghiên cứu trên tim chuột phì đại sau co thắt động mạch chủ cho thấy sự khuếch đại mật độ ty thể Tuy nhiên,

sự gia tăng ban đầu về số lượng ty thể chỉ được phát hiện ở giai đoạn bệnh sớm của bệnh và suy giảm dần cùng với tiến triển của bệnh thường đi kèm với bất thường trong co cơ [27] Điều này dẫn đến giảm khả năng điều chỉnh sản xuất ATP của ty thể, từ đ làm rối loạn chức năng tâm trương và suy tim

Trong bệnh suy tim, ty thể thường bị tổn thương do vỡ màng Các ty thể này thể hiện khả năng tổng hợp ATP suy giảm [13], tăng stress oxy hóa [35]

* Rối loạn chức năng ty thể trong bệnh thiếu máu cục bộ - tái tưới máu cơ tim

Nhiều kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng ty thể đ ng vai trò quan trọng trong quá trình sinh lý bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim, do vậy, sự bảo toàn chức năng

ty thể là cần thiết để hạn chế những tổn thương tế bào cơ tim, hạn chế tiến triển bệnh [75]

Trong giai đoạn thiếu máu cục bộ, hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử bị

ức chế do sự biến đổi của cardiolipin-một lipid đặc trưng của màng trong ty thể và

tăng cường sự rò rỉ của ion H+, dẫn đến sự giảm điện thế màng ty thể (ΔΨm) và tổng hợp ATP [32] Trong giai đoạn tái cung cấp máu, sự tái cung cấp oxy và thay đổi

pH máu làm rối loạn chức năng ty thể trở nên nghiêm trọng hơn như giảm điện thế màng ty thể [72], tăng mạnh ROS [73], tăng Ca2+ ty thể [72], oxy hóa cardiolipin,

mở lỗ màng trong ty thể [61], và giải ph ng các protein kích hoạt sự chết theo chương trình của tế bào cơ tim Ty thể bị biến đổi trong quá trình tái cung cấp oxy được xác định như dấu hiệu của bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim [49] Vì vậy, mục tiêu bảo vệ ty thể trong quá trình tái tưới máu có thể cải thiện sự phục hồi chức năng của tế bào cơ tim [31, 72]

Các nghiên cứu về sự rối loạn hoạt động chức năng ty thể ở các tế bào cơ tim

do tổn thương TMTTMCT đã gợi ý một số hướng điều trị mới với đích là cải thiện hoạt động chức năng hoặc giảm thiểu các thương tổn tế bào bắt nguồn từ ty thể như: giảm ROS, kiểm soát hoạt động của các kênh ion trên màng ty thể, điều hòa chuỗi

hô hấp ty thể,… [3]

1.4.3 Nghiên cứu về ty thể trên dòng tế bào H9C2

Với các đặc điểm cấu trúc và chức năng độc đáo, ty thể là đích nhắm tới của nhiều nhà khoa học trong chọn lọc các loại thuốc [38, 72]

Năm 2018, Xiangting và cs đã tiến hành thử nghiệm khả năng gây chết theo chu trình của Aconitine trên đối tượng tế bào H9C2 thông qua con đường ty thể Aconitine là một loại diterpenoid alkaloid thường có trong các cây thuộc chi Mao

lương Aconitum và được sử dụng trong việc điều trị nhiều loại bệnh Theo nhóm

nghiên cứu, tế bào H9C2 sẽ chết theo chu trình của dưới sự kích thích của Aconitine thông qua sự ức chế kênh Na+, từ đ làm thay đổi điện thế màng và dẫn đến hiện tượng loạn nhịp tim Hơn thế, Aconitine cũng đồng thời làm thay đổi lượng Ca2+ trong tế bào, từ đ dẫn đến mất hoạt động chức năng cơ tim Nh m đã giả định, hoạt chất gây mất hoạt động chức năng cơ tim này c thể liên quan đến hoạt động chức năng của ty thể, đặc biệt là các hoạt động sinh năng lượng và sinh ROS Đúng như giả định, sau 24 giờ kể từ khi xử lý với Aconitine, nhiễm sắc thể của tế bào H9C2 tiến hành co xoắn bắt đầu đứt gãy liên tục, tế bào bắt đầu có những dấu hiệu chuyển sang giai đoạn chết theo chu trình Bên cạnh đ , ở thời điểm 4 giờ sau xử lý, lượng ROS của tế bào sinh ra tặng mạnh, gấp 2 lần so với nh m đối chứng, trong

khi lượng ATP tạo thành lại giảm một nửa so với nh m đối chứng tại thời điểm 24 giờ sau xử lý với Aconitine Để khẳng định về mặt phân tử rằng các tế bào đang đi theo con đường chết theo chương trình, các thí nghiệm bằng Westen blot đã được thực hiện và cho thấy, lượng Caspase-3 cũng như Cytochrome c tăng mạnh dưới sự kích thích của Aconitne trong khi đ , Bcl-2 lại bị ức chế biểu hiện [80]

Cũng trên dòng tế bào này, Ping Liu và Jing Dong (2017) đã tiến hành đánh giả khả năng bảo vệ cơ tim khỏi giảm oxy huyết của Carnosic acid Tương tự như nghiên cứu trên, nh m cũng sử dụng các chỉ tiêu về lượng Caspase-3, Bcl-2 và Bax như một dấu chuẩn phân tử của hiện tượng chết theo chu trình và đánh giá hoạt động chức năng ty thể bằng phương pháp huỳnh quang Bằng cách nhuộm với đầu

dò huỳnh quang Fluo-3 AM, lượng canxi trong tế bào được xác định, theo đ , đúng như lý thuyết, ở nh m tăng canxi huyết, lượng canxi trong tế bào tăng vọt, sau đ , lượng canxi này sẽ giảm dần cùng với chiều tăng dần lượng Carnosic acid được xử

lý và đưa gần về giá trị sinh lý bình thường Tương tự như vậy, lượng ROS sinh ra cũng c xu thế giảm dần cùng với sự tăng nồng độ Carnosic acid và có xu thế trở lại mức bình thường của tế bào.Trong khi đ , lượng Caspase-3 và Bax tăng lên ở nhóm

tế bào bị tăng oxy huyết, nhưng sau đ đã giảm mạnh ở các nh m được xử lý với hoạt chất Ngược lại, Bcl-2 lại có xu thế tăng mạnh trở lại tỷ lệ thuận với nồng độ Carnosic acid sử dụng Như vậy, theo nghiên cứu này, Carnosic acid có tác dụng nâng cao khả năng sống của tế bào cơ tim H9C2 khỏi sự chết theo chu trình, bảo vệ

cơ tim khỏi các thương tổn do thiếu oxy huyết gây ra, đồng thời ức chế enzym lactate dehydrogenase Ngoài ra, hoạt chất này cũng hỗ trợ hoạt động chức năng ty thể thông qua việc giảm lượng ROS sinh ra [54]

Jin Han và cs (2013) đã thử nghiệm ảnh hưởng của Fimasartan - một loại thuốc ức chế thụ thể angiotensin II đối với tổn thương TMTTMCT Kết quả nghiên cứu cho thấy, tiền xử lý với Fimasartan làm giảm đáng kể tỷ lệ nhồi máu cơ tim

Fimasartan cũng làm giảm tỷ lệ tế bào chết theo chương trình ở cả mô hình in vivo

và mô hình thiếu oxy - tái cung cấp oxy in vitro sử dụng tế bào H9C2 thông qua

việc làm giảm tổn thương ty thể Fimasartan có khả năng làm giảm sản sinh O2- , bảo tồn điện thế màng ty thể, qua đ bảo vệ ty thể Bên cạnh đ , Fimasartan cũng

làm giảm sự quá tải ion Ca2+ ty thể thông qua ức chế kênh vận chuyển Ca2+ loại L

và kênh vận chuyển Ca2+ đơn độc [31]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

Dòng tế bào cơ tim phôi chuột H9C2 (hãng ATCC® - USA) được tặng bởi Trung tâm nghiên cứu bệnh chuyển hóa tim mạch, Trường Đại học Inje, Hàn Quốc

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các môi trường, hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu

1 Môi trường Dulbecco's Modified Eagle Medium

2 Photphate buffer saline (PBS) Gibco (USA)

3 Fetal bovine serum (FBS) Gibco (USA)

4 Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma (USA)

5 Mitotracker Green (MTG) Invitrogen (USA)

6 10-N-nonyl acridine orange (NAO) Invitrogen (USA)

7 Cell-counting kit-8 Sdojindo (Nhật Bản)

8 Penicillin-Streptomycin ThermoFisher (USA)

9 Trypsin 0,25%, EDTA Gibco (USA)

2.1.3 Phòng nuôi, thiết bị

Phòng nuôi cấy tế bào là phòng sạch với đầy đủ các thiết bị nuôi cấy như: Tủ

ấm CO2 (Shellab, USA); Tủ an toàn sinh học cấp 2 (ESCO); Kính hiển vi soi ngược Axiovert S100 (Zeiss, Germany); Máy ly tâm EBA 270 (Hettich, Germany) Các thiết bị cơ bản khác được sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

1 Máy đọc huỳnh quang đĩa 96 giếng Hidex (USA)

2 Máy đo OD đĩa 96 giếng SpectraMax Plus 384 (USA)

3 Đĩa nuôi 90x20, 60x15, 35x15 SPL (Korea)

4 Đĩa 96 giếng thành trong SPL (Korea)

5 Đĩa 96 giếng đen, đáy kính Corning (USA)

6 Bình khí, buồng hypoxia Việt Nam

2.2 Phương pháp

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Tế bào H9C2

Nuôi cấy trong điều

kiện thường Thử nghiệm mô hình bệnh TM-TTMCT

Mô hình

sử dụng buồng thiếu oxy

Đánh giá tỷ

lệ sống (CCK-8)

Phân tích ty thể

Cardiolipin (NAO)

Mật độ ty thể (Mito tracker green)

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Thử nghiệm quy trình nuôi cấy cơ bản

Tế bào H9C2 được bảo quản lưu giữ lâu dài trong Nitơ lỏng Toàn bộ quy trình hoạt hóa, nuôi cấy và bảo quản tế bào được tiến hành tuân thủ theo hướng dẫn của hãng ATCC, gồm các công đoạn sau:

Hình 2.2 Quy trình chung nuôi cấy tế bào H9C2 theo hướng dẫn của ATCC

* Hoạt hóa tế bào

Trước khi tiến hành hoạt h a, môi trường nuôi cấy với DMEM 4,5 g/l glucose có bổ sung 12% FBS và 1% Penicilin-Streptomycin, đệm PBS 1X, bình nuôi T25 hoặc đĩa nuôi 60x15 mm cần được chuẩn bị trước Ống tế bào H9C2 được lấy từ bình Nitơ lỏng, rã đông trong bể ổn nhiệt ở 370C Sau rã đông, ống tế bào được ly tâm ở nhiệt độ phòng với tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút

Sau khi ly tâm, phần dịch nổi phía trên được loại bỏ, một thể tích môi trường DMEM mới (1ml) được bổ sung thêm vào ống đựng tế bào lắng ở đáy Sau đ , mẫu

tế bào được trộn nhẹ nhàng bằng pipet và chuyển sang đĩa nuôi (đã chuẩn bị sẵn

Tế bào bảo quản lạnh (N2 lỏng)

Hoạt h a

Nuôi, cấy chuyển

Bảo quản

Phân tích thí nghiệm

trước đ ) Sau cùng, đĩa tế bào được giữ duy trì trong tủ nuôi ở điều kiện 370C, 5%

CO2 Môi trường nuôi được thay sau khoảng 48h [6]

* Cấy chuyển tế bào

Trước khi cấy chuyển tế bào, mật độ của tế bào được kiểm tra thông qua việc quan sát trên kính hiển vi soi ngược, nếu mật độ tế bào đạt khoảng 70-80% thì mới tiến hành cấy chuyển Các bước được thực hiện tuần tự như sau:

- Hút bỏ môi trường cũ và rửa tế bào 2 lần bằng đệm PBS;

- Bổ sung Trypsin 0,25%, ủ trong 5-10 phút và quan sát dưới kính hiển vi xem tế bào tách hết chưa Khi bị tách khỏi bề mặt đĩa, các tế bào H9C2 sẽ có dạng cầu và trôi nổi trong dung môi; bổ sung môi trường mới DMEM vào đĩa nuôi với thể tích gấp bốn lần thể tích Trypsin đã sử dụng để bất hoạt;

- Hút toàn bộ dung dịch vào ống ly tâm (15 ml) rồi ly tâm với tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng;

- Hút bỏ dịch nổi và bổ sung môi trường mới ống ly tâm và chuyển môi trường có chứa tế bào sang các đĩa đã chuẩn bị sẵn (ghi trên nắp đĩa thời gian chuyển, tên tế bào và số lần chuyển)

* Bảo quản tế bào

Tế bào H9C2 cần được lưu trữ để thực hiện các thí nghiệm khác nhau, do vậy, các tế bào này sẽ được cất trong Nitơ lỏng với thời gian lưu trữ có thể đến nhiều năm Yêu cầu chất lượng tế bào và các bước trong quy trình được mô tả như sau:

- Kiểm tra chất lượng tế bào: tế bào được lấy ra khỏi tủ ấm và soi dưới kính hiển vi để đánh giá mật độ tế bào (chỉ khi tế bào lan 70-80% mới tiến hành bảo quản);

- Hút bỏ môi trường cũ và rửa tế bào từ 1- 2 lần bằng dung dịch đệm PBS;

- Tách tế bào bằng Trypsin 0,25%;

- Bổ sung môi trường DMEM vào đĩa nuôi để ức chế Trypsin, trộn nhẹ nhàng tạo dịch huyền phù tế bào; Hút dịch sang ống ly tâm và ly tâm ở tốc độ 1500 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng;

- Hút bỏ dịch nổi và bổ sung môi trường, trộn nhẹ nhàng bằng pipet và chuyển vào các ống trữ tế bào (cryovial, đã đánh dấu tên tế bào, ngày cất, môi trường nuôi, số thế hệ cấy chuyển);

- Đưa ống trữ vào tủ lạnh sâu để hạ nhiệt từ từ tránh gây sốc cho tế bào;

- Chuyển tế bào vào bình Nitơ lỏng

2.2.2.2 Tối ưu hóa quy trình nuôi cấy

Dòng tế bào H9C2 của hãng ATCC là dòng tế bào được thương mại hóa, có thể được xem là dòng tế bào bất tử và sử dụng lâu dài Tuy nhiên, trong quá trình thực hiện nghiên cứu, do những giới hạn về trang thiết bị của phòng thí nghiệm khiến nhóm nghiên cứu nghi ngờ về tính ổn định của dòng tế bào này sau một thời gian sử dụng Do đ , ở đây, nghiên cứu đã tiến hành tối ưu h a quy trình nuôi cấy thông qua việc theo dõi sự thay đổi trạng thái sinh lý của tế bào H9C2 trong tiến trình sử dụng

Trong thí nghiệm này, trạng thái sinh lý của tế bào được theo dõi và ghi lại qua các lần hoạt hóa sử dụng từ lần 1 cho tới lần 9 Quy trình nuôi cấy vẫn tuân theo các hướng dẫn chung của hãng ATCC, tuy nhiên sẽ được điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện nuôi cấy thực tế Sau mỗi lần hoạt hóa, tế bào sẽ được đo lường các chỉ số:

- Tỷ lệ sống của tế bào sau 24h nuôi cấy;

- Trạng thái ty thể với các tiêu chí về thành phần lipid trên màng ty thể, mật

độ ty thể trong tế bào

2.2.2.3 Phân tích khả năng sống của tế bào sử dụng CCK-8

Khả năng sống của tế bào được xác định bằng kít CCK-8 (Cell-counting 8) Dưới tác dụng của enzym dehydrogenase-một thông số hoạt động ty thể của tế bào sống, WST-8 trong CCK-8 chuyển thành WST-8 formazan màu cam Lượng WST-8 formazan được xác định bằng cách đo OD ở bước sóng 450nm bằng máy

kit-đọc đĩa 96 giếng

2.2.2.4 Phân tích một số thông số ty thể

* Đo thành phần lipid màng ty thể

Cardiolipin là một phospholipid được tìm thấy duy nhất tại màng trong ty thể

và là cầu nối giữa màng trong và màng ngoài ty thể, chiếm 13-15% tổng số phospholipid của ty thể Theo nhiều nghiên cứu, cardiolipin đ ng vai trò quan trọng trong nhiều bệnh trong đ c cả tổn thương TMTTMCT Sự khác biệt về mức độ biểu hiện cardiolipin đã được ghi nhận và được xem là dấu chuẩn về sự thay đổi thành phần lipid trên màng ty thể cho các bệnh liên quan đến cơ tim Cardiolipin được định lượng gián tiếp thông qua chất nhuộm huỳnh quang 10-N-nonyl-acridine orange (NAO) NAO sẽ phát ra tín hiệu huỳnh quang c bước sóng 519 nm khi được kích thích bằng chùm sáng c bước s ng 495nm và c độ đặc hiệu cao đối với cardiolipin, bên cạnh đ , ái lực liên kết của NAO với cardiolipin mạnh hơn 30 lần

so với các phân tử phospholipid tích điện âm khác trong ty thể cũng như trong tế bào chất Bằng kỹ thuật này, ngoài việc có thể xác định được thành phần lipid màng

ty thể mà còn có thể quan sát và ghi lại sự phân bổ của cardiolipin trong tế bào cũng như đo lượng ty thể có mặt bên trong tế bào [58]

Trong nghiên cứu này, tế bào được nuôi ổn định trên đĩa 96 giếng đen, đáy kính với mật độ 5000 tế bào/giếng Tại cuối thời điểm thí nghiệm, tế bào H9C2 được nhuộm với NAO (0,1µM, ex/em: 495/519 nm), trong 30 phút, ở nhiệt độ phòng Sau đ , các mẫu thí nghiệm được rửa 3 lần với PBS [1, 14] Sự thay đổi về mật độ huỳnh quang của NAO được kiểm tra bằng máy đọc đĩa 96 giếng, từ đ xác định thành phần cardiolipin màng ty thể Mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần

* Đo mật độ ty thể

Trong nghiên cứu này, mật độ ty thể được xác định thông qua chất nhuộm huỳnh quang Mitotracker Green (MTG) MTG khuếch tán thụ động qua màng tế bào và được tích tụ lại trong các ty thể hoạt động Tại đây, MTG phản ứng với nhóm thiol tự do của cystein trong protein màng ty thể Dưới sự kích thích của ánh sánh c bước sóng 490 nm, MTG sẽ phát huỳnh quang c bước sóng 516 nm và có thể quan sát được dưới kính hiển vị huỳnh quang

Trong nghiên cứu này, tế bào được nuôi ổn định trong đĩa 96 giếng đen, đáy kính trong với mật độ 5000 tế bào/giếng Tại cuối thời điểm thí nghiệm, tế bào được nhuộm với MTG 0,1µM trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Tiếp theo, mẫu tế bào

được rửa 2- 3 lần bằng PBS 1X Sự thay đổi mật độ huỳnh quang của MTG được xác định bằng máy đọc đĩa 96 giếng Mỗi thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần

2.2.2.5 Gây mô hình bệnh thiếu máu - tái tưới máu cơ tim (TMTTMCT, HR)

Mô hình thiếu oxy/tái cung cấp oxy (HR) được sử dụng phổ biến để nghiên cứu bệnh lý thiếu máu cục bộ - tái tưới máu cơ tim (nhồi máu-tái thông dòng; thiếu

máu tái tưới máu cơ tim: TMTTMCT) in vitro Nếu như các mô TMTTMCT in vivo

và ex vivo [31, 72] mô phỏng được nhiều khía cạnh của bệnh thiếu máu cục bộ, thì các mô hình in vitro cũng quan trọng không kém, nó cho phép nghiên cứu chi tiết

về cơ chế tổn thương tế bào và người nghiên cứu có thể cho phép thử một lượng lớn các hợp chất, điều này là cần thiết cho việc sàng lọc thuốc ở giai đoạn đầu của quá trình nghiên cứu [25]

Có nhiều phương pháp để tạo mô hình TMTTMCT in vitro: dùng một số hợp

chất hóa học như Cobalt chlorit (CoCl2), Niken Chlorit (NiCl2), Desferrioxamine; hoặc sử dụng buồng nuôi thiếu oxy (buồng hypoxia) [71] Trong nghiên cứu này,

mô hình thiếu oxy/tái cung cấp oxy trên tế bào H9C2 được thiết lập bằng cách sử dụng CoCl2 và buồng thiếu oxy (buồng hypoxia)

* Gây mô hình bệnh TMTTMCT sử dụng CoCl 2

Môi trường thiếu O2 đ ng vai trò rất quan trọng trong cơ chế của nhiều loại bệnh, trong đ c thiếu máu cục bộ cơ tim [26] Các tế bào phản ứng với điều kiện thiếu O2 bằng cách kích hoạt yếu tố HIF1-α, yếu tố phiên mã điều chỉnh sự biểu hiện một số gen liên quan đến sự sống, sự chuyển hóa và sự di chuyển của tế bào [62] Trong điều kiện thường, HIF1-α bị hydroxyl hóa, ubiquitin hóa và thoái hóa ở proteasome [26] Trong điều kiện thiếu oxy, hoạt động của các enzym hydroxylase

bị ức chế và HIF1-α trở nên bền vững [5] Nhiều nghiên cứu cho thấy, Cobalt chlorit-muối kim loại chuyển tiếp, có khả năng mô phỏng điều kiện thiếu O2 bằng cách ức chế hoạt động của hydorylase và giữ bền vững HIF1-α [22]

Trong nghiên cứu này, tế bào được nuôi ổn định trong đĩa 96 giếng với mật

độ 5000 và 10000 tế bào/giếng trong 24h Sau đ môi trường cũ được hút bỏ và mẫu tế bào được ủ với CoCl2 ở các dải nồng độ 100µM, 200µM, 300µM và 400µM

ở 370

C, 5% CO2 Sau 24h, môi trường chứa CoCl2 được loại bỏ và tế bào được rửa

bằng PBS trước khi thêm môi trường nuôi cấy bình thường Tại cuối thời điểm thí nghiệm, kít CCK-8 được tra vào từng giếng Số lượng tế bào sống được xác định gián tiếp thông qua giá trị OD tại bước sóng 450nm Thí nghiệm được lặp lại ít nhất

3 lần

* Gây mô hình bệnh TMTTMCT sử dụng buồng thiếu oxy

Một trong những cách tiếp cận nghiên cứu cơ chế sinh bệnh lý TMTTMCT

là nuôi cấy tế bào và mô cơ tim trong các điều kiện thay đổi nồng độ oxy (điều kiện thiếu thường, điều kiện thiếu oxy) kết hợp với môi trường nuôi cấy DMEM có nồng

độ đường thấp Nhiều phương pháp, thiết bị buồng nuôi khác nhau đã được phát triển để tạo và duy trì điều kiện nồng độ oxy thấp trong quá trình nuôi cấy [45, 76]

Sử dụng khí hỗn hợp với nồng độ oxy thấp là phương pháp được sử dụng rộng rãi để tạo ra điều kiện thiếu oxy cho tế bào nuôi cấy Bên cạnh khí hỗn hợp, buồng thiếu oxy, tủ nuôi cấy thiếu oxy và hệ thống buồng phụ thiếu oxy cũng dược

sử dụng phổ biến [7, 76]

Trong nghiên cứu này, buồng thiếu oxy là một hộp kín, c van cho khí đi vào

và đi ra Nồng độ O2 được điều chỉnh bằng cách xả đầy hỗn hợp khí (gồm 5% CO2, 95% N2) trong 5 phút Trước khi tiến hành thí nghiệm thiếu O2, môi trường nuôi cấy bình thường được thay bằng môi trường glucose nồng độ thấp, không FBS Thời gian thiếu O2 là từ 6-10h Sau đ , tại thời điểm tái cung cấp O2, môi trường với nồng độ đường thấp, không FBS được thay thế bằng môi trường nuôi cấy bình thường Thời gian tái cung cấp O2 là 36h Tại cuối thời điểm thí nghiệm, sử dụng kít CCK-8 để xác định tỷ lệ tế bào sống Mỗi thí nghiệm được tiến hành ít nhất 3 lần

2.2.2.6 Phân tích kết quả thí nghiệm

Kết quả trong nghiên cứu sẽ được phân tích dựa vào phần mềm Origin 8.5 và Excel 2016 Sử dụng hàm T-test để so sánh sự sai khác giữa các kết quả P<0,05 được xem là khác biệt c ý nghĩa thống kê

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Quy trình nuôi cấy tế bào H9C2 trong điều kiện thường

Quy trình nuôi cấy và bảo quản tế bào H9C2 vẫn tuân theo quy trình chung theo hưỡng dẫn của ATCC, gồm các bước bảo quản tế bào, hoạt h a tế bào, cấy chuyển, phân tích hoạt tính sinh học như được mô tả trong sơ đồ khái quát h a ở Hình 2.1 Tuy nhiên, một số yếu tố trong quy trình nuôi cấy đã được điều chỉnh để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm hiện tại Tới thời điểm hiện tại, nhóm nghiên cứu đã thiết lập và tối ưu được quy trình nuôi cấy thành công tế bào H9C2

trong điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm

3.1.1 Hoạt hóa tế bào H9C2

Quá trình hoạt h a tế bào H9C2 phải được thực hiện ngay sau khi ống nghiệm dự trữ tế bào (cryovial) được đưa ra khỏi bình Nitơ (N2) lỏng Các thao tác

kỹ thuật cần nhanh chóng và các nguyên vật liệu dụng cụ dùng trong thí nghiệm phải được tiệt trùng để đảm bảo tế bào không bị nhiễm Để đảm bảo cho công việc hoạt h a tế bào thành công, việc chuẩn bị nguyên vật liệu phục vụ thí nghiệm là đặc biệt quan trọng

* Chuẩn bị

Điều kiện phòng nuôi sạch và tiệt trùng: tủ ấm (370

C, 5% CO2), máy ly tâm, kính hiển vi, bể ổn nhiệt (370C), tủ an toàn sinh học cấp 2, đĩa nuôi cấy (60x15mm, 90x20mm), vật tư tiêu hao và các dụng cụ thí nghiệm khác: pipet, trợ pipet, ống ly tâm (1,5, 15, 50ml) đầu típ (1000, 200, 10µl), pipet 10ml (Code 07-5010, Biologix - Mỹ) Các dụng cụ như ống ly tâm, đầu tip 1000µl được tái sử dụng sau khi rửa sạch

và tiệt trùng

Môi trường nuôi cấy tế bào: Theo ATCC, môi trường nuôi cấy tế bào H9C2

là DMEM high glucose + 10% FBS + 1% Penicillin/streptomycin (PS) Tuy nhiên, khi hoạt h a trong môi trường như trên, tế bào c bám nhưng không phát triển (Hình 3.2.A) Do vậy, chúng tôi đã thử nghiệm môi trường hoạt hóa: DMEM high glucose + 12% FBS + 1% PS Môi trường này được làm ấm trong bể ổn nhiệt ở

370C từ 10-15 phút

Đĩa nuôi: Trong nghiên cứu này, chúng tôi chủ yếu sử dụng đĩa tròn c xử lý

bề mặt đĩa kích thước 60x15mm và đĩa 90x20mm (SPL, Korea) Các loại đĩa này c giá thành rẻ hơn (so với đĩa của Corning hoặc chai nuôi T-25, T-75) và khá phù hợp với điều kiện thực tế Tiến trình hoạt hóa tế bào H9C2 được thực hiện lần lượt theo các bước được mô tả khái quát ở Hình 3.1

Hình 3.1 Các bước hoạt hóa tế bào H9C2 trong nghiên cứu

* Các bước hoạt hóa tế bào H9C2

Theo sơ đồ Hình 3.1, trong nghiên cứu này, các bước hoạt h a tế bào H9C2 được tiến hành theo quy trình chung Tuy nhiên, một số kỹ thuật đã được thay đổi

so với khuyến cáo của ATCC Cụ thể:

Rã đông tế bào: Nhanh chóng thực hiện thao tác chuyển ống tế bào H9C2 (khoảng 1ml, ống cryovial) từ bình Nitơ lỏng (-178 0C) sang bể ổn nhiệt (370C) và giữ ống tế bào ở điều kiện này khoảng 1-2 phút (cho tới khi quan sát thấy lớp tế bào sát với thành ống rã đông); nhấc ống tế bào ra ngoài; lưu ý, để tránh nhiễm, trong khi rã đông, nắp ống tế bào luôn được hướng lên phía trên mặt nước; Tiếp theo đ , khử trùng ống nghiệm tế bào bằng cồn 700 và chuyển ống nghiệm này vào trong tủ

an toàn sinh học;