Xây dựng quy trình kỹ thuật phát hiện đột biến gen KCNJ5 trên bệnh nhân cường aldosteron nguyên phát do adenoma tuyến thượng thận

Cường aldosterone nguyên phát là bệnh lý hàng đầu gây ra tăng huyết áp thứ phát với nguyên nhân chủ yếu là do adenoma tuyến thượng thận sản xuất aldosterone (APA: aldosterone producing adenoma). Cơ chế phân tử của cường aldosterone nguyên phát được cho là có liên quan đến đột biến gen KCNJ5. Nghiên cứu này nhằm thiết lập và ứng dụng quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA nhằm xác định các đột biến của gen KCNJ5 trên quần thể bệnh nhân APA Việt Nam.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số * 2017 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN KCNJ5 TRÊN BỆNH NHÂN CƯỜNG ALDOSTERON NGUYÊN PHÁT DO ADENOMA TUYẾN THƯỢNG THẬN Đỗ Đức Minh*, Trần Viết Thắng**, Mai Phương Thảo*** TÓM TẮT Mục tiêu: Cường aldosterone nguyên phát bệnh lý hàng đầu gây tăng huyết áp thứ phát với nguyên nhân chủ yếu adenoma tuyến thượng thận sản xuất aldosterone (APA: aldosterone producing adenoma) Cơ chế phân tử cường aldosterone nguyên phát cho có liên quan đến đột biến gen KCNJ5 Nghiên cứu nhằm thiết lập ứng dụng quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA nhằm xác định đột biến gen KCNJ5 quần thể bệnh nhân APA Việt Nam Đối tượng phương pháp: Chúng thiết kế cặp mồi đặc hiệu khuếch đại exon 2, vùng tiếp giáp exon-intron gen KCNJ5 DNA tách chiết từ mô tươi bệnh phẩm u tuyến thượng thận bệnh nhân chẩn đốn APA Các mẫu DNA sau khuếch đại giải trình tự kỹ thuật Sanger Kết quả: Chúng khuếch đại thành công exon 2, vùng tiếp giáp exon-intron gen KCNJ5 Kết giải trình tự cho thấy đột biến L168R số bệnh nhân chẩn đốn APA Kết luận: Kỹ thuật giải trình tự DNA phát đột biến gen KCNJ5 từ giúp tăng cường hiểu biết sinh lý bệnh bệnh lý APA Từ khóa: cường aldosteron nguyên phát, adenoma tuyến thượng thận, gen KCNJ5, đột biến gen, PCR, giải trình tự DNA ABSTRACT TECHNICAL PROTOCOL TO IDENTIFY KCNJ5 SOMATIC MUTATION IN ADRENAL ALDOSTERONE-PRODUCING ADENOMA Do Duc Minh, Tran Viet Thang, Mai Phuong Thao * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 21 - No - 2017: 84 - 89 Objectives: Primary hyperaldosteronism is the most common cause of secondary hypertension and usually the consequence of adrenal aldosterone-producing adenoma (APA) Recently, molecular mechanism of APA has been shown to be associated with mutation in KCNJ5 gene We conduct this study to set up a DNA sequencing procedure to investigate the mutation of KCNJ5 gene in Vietnamese APA patients Material - Methods: Primers for amplification of exon 2,3 and the exon-intron boundaries of KCNJ5 gene were designed Genomic DNA was extracted from fresh adrenal tissue of APA patients These DNA were respectively amplified and sequenced by Sanger technique Results: The whole coding site and the exon-intron boundaries of KCNJ5 gene were successfully amplified After sequencing, out of patients with APA carry L168R somatic mutation Conclusion: DNA sequencing can detect somatic mutation in KCNJ5 gene This information can cast more light in the pathophysiology of APA *Trung tâm Y sinh học phân tử, **Bộ môn Nội tiết, ***Bộ môn Sinh lý học, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: TS.BS Đỗ Đức Minh ĐT: 0932999989 Email: mdt14284@yahoo.com 84 Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số * 2017 Nghiên cứu Y học Keywords: primary aldosteronism, adrenal adenoma, KCNJ5 gene, somatic mutation, PCR, DNA sequencing ĐẶT VẤN ĐỀ bệnh sinh bệnh lý mà cần Cường aldosterone nguyên phát bệnh lý hàng đầu gây tăng huyết áp thứ phát với tỷ lệ khoảng 6-10% tổng số bệnh nhân tăng huyết áp lên tới 20% nhóm bệnh tăng huyết áp kháng trị(4, 7) Nguyên nhân thường gặp cường aldosterone adenoma tuyến thượng thận sản xuất aldosterone (APA: adrenal aldosteroneproducing adenoma) tăng sản tuyến thượng thận hai bên (bilateral adrenal hyperplasia) Cơ chế phân tử cường aldosterone nguyên phát chưa hiểu biết rõ ràng gần đây, số nghiên cứu đột biến gen KCNJ5 có liên quan mật thiết với nhóm bệnh APA(3) thiết cho việc đánh giá tiên lượng bệnh Gene KCNJ5nằm nhiễm sắc thể số số 11, mã hóa cho kênh ion Kali Kir 3.4, đột biến gen làm cho kênh kali bị tính chọn lọc, tế bào vùng cầu vỏ thượng thận bị khử cực liên tục dẫn đến việc sản xuất mức aldosterone(3) Tỷ lệ đột biến gene KCNJ5 nhóm bệnh nhân APA thay đổi lớn tùy theo chủng tộc, tần suất dao động từ khoảng 40% bệnh nhân Châu Âu lên tới 70% nhóm bệnh nhân Nhật Bản Trung Quốc(1,2,6,8) nhóm bệnh nhân có đột biến gen KCNJ5 có khuynh hướng trẻ hơn, có nồng độ aldosterone cao có cải thiện tim mạch tốt sau điều trị phẫu thuật(6) ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Chúng tiến hành khảo sát đột biến gen KCNJ5 cho bệnh nhân chẩn đoán adenoma tuyến thượng thận sản xuất aldosterone Các bệnh nhân có biểu lâm sàng tình trạng tăng huyết áp, hạ kali máu, có nồng độ aldosterone máu tăng cao không bị ức chế làm test tải muối, nồng độ renin máu thấp có khối u thượng thận bên phim CT scan Phương pháp nghiên cứu Tách chiết Genomic DNA Bệnh phẩm mô tươi khối u tuyến thượng thận thu nhận từ q trình phẫu thuật bệnh nhân Sau mẫu mô tươi cắt nhỏ tách chiết DNA kit QIAamp DNA Kit (Qiagen, Mỹ), theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Việc xây dựng quy trình kỹ thuật xác định đột biến gene KCNJ5 nhóm bệnh nhân APA khơng giúp làm rõ chế Thiết kế mồi Bảng Các cặp mồi dùng để khuếch đại giải trình tự exon gen KCNJ5 Tên mồi KCNJ5-2F KCNJ5-2R KCNJ5-3F1 KCNJ5-3R KCNJ5-3F2 KCNJ5-3R Nội Tiết Trình tự chuỗi (5’-3’) CCTTCCATCTTGTGTTCTAG TGCCTAAGTCTGAAGTGTAG GATGGATAGATGGATGGATG TTAGCCAGCACCTACAAGAG TGCTGTTTTCAGGAACGGAG TTAGCCAGCACCTACAAGAG Đoạn gen khuếch đại Exon vùng lân cận (1073 bp) Exon vùng lân cận (617 bp) Exon vùng lân cận (1167 bp) 85 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số * 2017 Nghiên cứu Y học Gen KCNJ5 bao gồm exon, exon khơng tham gia mã hóa protein, chúng tơi tiến hành giải trình tự exon 2, vùng lân cận Các đoạn mồi thiết kế dựa trình tử DNA gen KCNJ5 mang mã số NG_023406.2 kho liệu NCBI tổng hợp công ty Integrated DNA Technologies, Hoa Kỳ Thông tin đoạn mồi trình bày bảng theo hai chiều xi ngược với mồi Thực PCR Mỗi tube PCR tích 25 l chứa thành phần: PCR buffer, dNTP (250 M cho loại), mồi xuôi ngược (0,5 M cho loại), 1,25U TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản) 50-100 ng genomic DNA Chu trình luân nhiệt cho PCR thực máy Mastercycler@Pro S (Eppendorf, Đức) bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu 980C phút, theo sau 40 chu kỳ gồm biến tính 980C 10 giây, gắn mồi 540C 15 giây, tổng hợp chuỗi DNA 720C 1,5 phút kết thúc giai đoạn kéo dài sản phẩm 720C phút Sản phẩm PCR phát điện di thạch agarose 0,7% có nhuộm ethidium bromide quan sát hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ) Sản phẩm PCR sau tinh illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, Anh) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất kiểm tra lại điện di thạch agarose 0,7% Các phản ứng kèm theo chứng âm khơng chứa DNA để kiểm sốt ngoại nhiễm Workbench Bảng Sản phẩm sau kết tủa ethanol, hòa tan Hi-Di formanide, biến tính 95C trước làm lạnh đột ngột Trình tự DNA đọc máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ) Kết giải trình tự DNA phân tích phần mềm CLC Main KẾT QUẢNGHIÊN CỨU Thiết lập kỹ thuật giải trình tự DNA gen KCNJ5 Theo thiết kế ban đầu, cặp mồi KCNJ52F, KCNJ5-2R KCNJ5-3F1, KCNJ5-3R khuếch đại thành công exon gene KCNJ5 vùng intron lân cận Kết exon khuếch đại thành cơng với kích thước sản phẩm PCR mong đợi, cặp mồi KCNJ5-3F1, KCNJ5-3R bắt cặp không đặc hiệu hình thành sản phẩm PCR với kích thước khơng phù hợp với dự đốn ban đầu (