Nội dung của bài viết trình bày về ứng dụng kỹ thuật giải trình tự DNA khảo sát đột biến gen cKIT trên bệnh nhân (BN) bạch cầu cấp dòng tủy có chuyển vị t(8;21)(q22;q22). Kết quả nghiên cứu cho thấy, xây dựng thành công quy trình khảo sát đột biến gen cKIT tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học, giúp việc phân nhóm tiên lượng tốt hơn trên nhóm bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy có t(8;21).
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN cKIT TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP DỊNG TỦY CĨ CHUYỂN VỊ t(8;21)(q22;q22) Phan Thị Xinh*,**, Hồng Anh Vũ* TĨM TẮT Đặt vấn đề: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự DNA khảo sát đột biến gen cKIT trên bệnh nhân (BN) bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) có chuyển vị t(8;21)(q22;q22). Đối tượng và phương pháp: Mẫu tủy xương của 15 BN BCCDT có t(8;21) và/hoặc có biểu hiện AML1‐ ETO được khảo sát đột biến gen cKIT từ exon 8 đến exon 17 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học từ 05/2012 đến 05/2013. Kết quả: Trong nghiên cứu này, chúng tơi khuếch đại được sản phẩm PCR dài 1751 bp từ exon 7 đến exon 21 cho phép phát hiện hầu hết các kiểu đột biến trong vùng từ exon 8 đến exon 17 của cKIT. Phân tích kết quả của 15 BN phát hiện 5 BN (33,3%) có đột biến, trong đó BN6 mang cùng lúc 2 kiểu đột biến cho thấy có tiên lượng xấu do khơng đáp ứng với điều trị hóa trị liệu và dị ghép tủy. Các kiểu đột biến trong nghiên cứu gồm D816V, D816Y, N822K và N822Y, là các đột biến thường gặp đã được báo cáo. Kết luận: Xây dựng thành cơng quy trình khảo sát đột biến gen cKIT tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học, giúp việc phân nhóm tiên lượng tốt hơn trên nhóm BN BCCDT có t(8;21). Từ khóa: Bạch cầu cấp dòng tủy, t(8;21)(q22;q22), đột biến cKIT. ABSTRACT DETECTION OF cKIT MUTATIONS IN ACUTE MYELOID LEUKEMIA PATIENT WITH t(8;21)(q22;q22) TRANSLOCATION Phan Thi Xinh, Hoang Anh Vu * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 277 ‐ 231 Background: Detection of cKIT mutations in acute myeloid leukemia (AML) patient with t(8;21)(q22;q22) translocation using direct DNA sequencing technique. Methods: Bone marrow samples of 15 AML patients with t(8;21) and/or AML1‐ETO expression were used for detection of cKIT mutations from exons 8 to exon 17 at Blood Transfusion and Hematology Hospital from May 2012 to May 2013. Result: In this study, we were able to amplify PCR product of 1751 bp, expanding from exon 7 to exon 21 of cKIT, which harbored almost all mutations within exon 8 to exon 17. Analyzing the DNA sequences of 15 patients, we detected 5 patients (33.3%) carrying cKIT mutations. Among 5 patients positive for cKIT mutation, Patient 6 had 2 kinds of mutation and poor prognosis without response to chemotherapy and allogeneic bone marrow transplantation. Mutations in this study are previously reported, including D816V, D816Y, N822K, and N822Y. Conclusion: We successfully developed a procedure for detecting cKIT mutation at Blood Transfusion and Hematology Hospital, which may help to divide AML patients with t(8;21) to different prognostic groups. Key words: acute myeloid leukemia, t(8;21), cKIT mutation. * Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: TS.BS. Phan Thị Xinh Huyết Học ** Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM. ĐT: 0932728115 Email: 227 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 ĐẶT VẤN ĐỀ ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) là bệnh lý ác tính về máu đặc trưng bởi sự tăng sinh q mức tế bào non trong tủy xương và trong máu gây giảm 3 dòng tế bào máu bình thường. Dựa vào bất thường nhiễm sắc thể (NST) và gen, BCCDT được chia thành 3 nhóm tiên lượng tốt, trung bình và xấu. Nhóm tiên lượng tốt gồm những bệnh nhân (BN) có mang chuyển vị NST t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q12‐21) và inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22), trong đó nhóm t(15;17) có bệnh cảnh lâm sàng đặc biệt là BCCDT thể M3 có tiên lượng rất tốt với điều trị phối hợp hóa trị liệu chuẩn và ATRA, còn nhóm t(8;21) và inv(16)/t(16;16) thì đáp ứng với phác đồ điều trị hóa trị liệu cytarabine ‐ anthracycline khơng đồng nhất(5,10). Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy khoảng 46% BN với t(8;21) và inv(16)/t(16;16) có thêm đột biến ở exon 8 và exon 17 của gen cKIT sẽ tái phát sớm sau lui bệnh hồn tồn(1,6,7). Vì thế, hướng dẫn của Mạng Lưới Ung Thư Quốc Gia của Hoa Kỳ đề nghị khảo sát đột biến cKIT thường quy trong nhóm BN có chuyển vị NST t(8;21) và inv(16)/t(16;16) và những BN này nếu có kèm đột biến cKIT thì được xếp vào nhóm tiên lượng trung bình. Đối tượng Có nhiều kiểu đột biến cKIT được tìm thấy trong BCCDT với t(8;21) như đột biến thêm hoặc mất đoạn tại exon 8 dẫn tới mất amino acid aspartic tại codon 419, đột biến cKIT‐ITD tại exon 11, 12 hoặc đột biến điểm làm thay đổi cấu trúc trong vùng tyrosine kinase (exon 17). Đột biến trên exon 17 phổ biến nhất là D816V và ít phổ biến hơn là D816Y, D816H, D816F và D816I hoặc đột biến điểm tại một số codon khác như 821, 822 và 823(8). Tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học (BVTMHH) mỗi năm có khoảng 30 BN mới được chẩn đốn BCCDT có t(8;21). Việc chẩn đốn đột biến gen cKIT một nhu cầu rất cần thiết giúp bác sĩ lâm sàng phân nhóm nguy cơ và lựa chọn hướng điều trị phù hợp cho bệnh nhân. 228 15 mẫu tủy xương của BN bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) lúc chẩn đốn có biểu hiện chuyển vị t(8;21)(q22;q22) bằng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH) hoặc biểu hiện AML1‐ETO bằng kỹ thuật khuếch đại gen sao chép ngược (RT‐PCR) tại BVTMHH từ tháng 5/2012 đến tháng 5/2013. Phương pháp RT–PCR Mẫu tủy trong chống đông EDTA được xử lý loại hồng cầu và ly trích RNA từ máu ngoại biên bằng RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hoa Kỳ). cDNA được tổng hợp từ 1 μg RNA với Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Để khuếch đại đoạn gen cKIT từ exon 8 đến exon 17, chúng tôi thiết kế mồi xuôi F1 (5’‐ TGTCCAATTCTGACGTCAAT‐3’) nằm trên exon 7 và mồi ngược R1 (5’‐ TCAGACATCGTCGTGCACAAGC‐3’) nằm trên exon 21 bằng phần mềm Oligo 4.1. Polymerase dùng cho PCR là Takara Taq HS (Takara, Nhật Bản). Chương trình luân nhiệt trên máy GeneAmp PCR System 2720 (Applied Biosystems, Hoa Kỳ) trong 45 chu kỳ với nhiệt độ bắt cặp là 60oC. Sản phẩm PCR được kiểm chứng bằng điện di trên thạch 1,2% (Hình 1), tinh sạch bằng QIAquick Gel extraction kit (Qiagen, Hoa Kỳ). Giải trình tự chuỗi DNA Thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye Terminator v3.1 sử dụng sản phẩm PCR đã được tinh sạch theo hai chiều xi và ngược. Các mồi dùng cho cycle sequencing gồm có F1, F2, F3, F4 và R1 (Hình 1). Sau khi kết tủa bằng ethanol, biến tính trong Hi‐Di formamide ở 960C trong 2 phút, sản phẩm được đọc trình tự bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer và dữ liệu thơ được phân tích bằng phần mềm SeqScape. Chun Đề Nội Khoa Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học cKIT F1 F2 1500 bp F3 F4 R 1751 bp 750 bp Thang chuẩn kb Nước Mẫu bệnh nhân Mẫu bệnh nhân Hình 1: Vị trí mồi và sản phẩm PCR mặt tế bào và đã được xác định có chuyển vị KẾT QUẢ Trong BCCDT, vùng gen cKIT thường xảy ra đột biến là từ exon 8 đến exon 17. Sử dụng cặp mồi F1 và R1, chúng tơi đã khuếch đại được sản phẩm PCR dài 1751 bp phủ từ exon 7 đến exon 21 (Hình 1) cho phép nhận diện hầu hết các kiểu đột biến điểm, mất đoạn hay chèn đoạn có thể xảy ra trên cKIT. Các bệnh nhân trong nghiên cứu được chẩn t(8;21) và/hoặc biểu hiện tổ hợp gen AML1‐ETO, là bất thường NST và gen đặc hiệu của BCCDT. Phân tích trình tự cKIT của 15 BN gồm 8 BN nam và 7 BN nữ, chúng tơi phát hiện 5 BN có đột biến cKIT, chiếm 33,3%. Đột biến trong 5 BN là các đột biến điểm, trong đó BN6 có 2 kiểu đột biến và 2 thay đổi acid amin M541L, L862L có tính đa hình (Bảng 1). đốn BCCDT dựa vào lâm sàng, tủy đồ, dấu bề Bảng 1: Kết quả FISH, RT‐PCR và đột biến cKIT STT 10 11 12 13 14 15 Tuổi 56 49 10 26 37 37 45 19 47 52 24 25 16 48 26 Giới Nữ Nam Nam Nữ Nam Nữ Nữ Nam Nam Nam Nữ Nam Nữ Nam Nữ FISH (% tế bào dương tính) t(8;21) (13,5%) t(8;21) (94,5%) t(8;21) (96%) t(8;21) (92%) t(8;21) (85,5%) t(8;21) (97,5%) t(8;21) (96%) t(8;21) (95,5%) t(8;21) (98%) t(8;21) (95,5%) RT-PCR AML1/ETO AML1/ETO AML1/ETO AML1/ETO AML1/ETO AML1/ETO AML1/ETO AML1/ETO AML1/ETO AML1/ETO AML1/ETO AML1/ETO AML1/ETO AML1/ETO c-KIT WT D816V WT WT WT M541L, D816Y, N822K, L862L WT WT WT WT D816V WT WT N822Y D816Y Đột biến thường gặp nhất là vị trí D816 và (Hình 2A) gặp trong BN6 và BN15 và D816V là N822 trên exon 17. D816 có nhiều biến thể, thay đổi aspartic acid thành valine (Hình 2B) D816Y là thay đổi aspartic acid thành tyrosine gặp trong BN2 và BN11. Huyết Học 229 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học A B Hình 2: Các kiểu đột biến cKIT phát hiên trên bệnh nhân. 2 kiểu đột biến và 2 biến thể (đa hình) phát hiện trên BN6 (A), và hình ảnh đột biến D816V (B) BÀN LUẬN số nghiên cứu khác đã khảo sát ảnh hưởng của Bằng việc thay đổi điều kiện nhiệt độ bắt cặp mồi từ 58oC đến 64oC và sử dụng Takara Taq HS, chúng tôi đã khuếch đại thành công sản phẩm PCR đặc hiệu dài 1751 bp từ exon 7 đến exon 21 ở nhiệt bắt cặp 60oC. Giải trình tự DNA sản phẩm PCR trên đã giúp phát hiện các kiểu đột biến thường gặp trên BN BCCDT. các kiểu đột biến cKIT trên nhóm BN có t(8;21) Kết quả khảo sát đột biến cKIT trên 15 BN BCCDT có t(8;21) và/hoặc biểu hiện AML1/ETO cho thấy 33,3% BN có đột biến. Các đột biến được phát hiện gồm D816V, D816Y, N822K, N822Y (Bảng 1) là các đột biến đã được báo cáo nằm trên exon 17 có ảnh hưởng đến tiên lượng bệnh(4,9). Cairoli và cộng sự nghiên cứu trên 49 BN có t(8;21) cho thấy 22% BN biểu hiện đột biến cKIT, và theo dõi 5 năm sau khi điều trị bằng phác đồ hóa trị liệu chuẩn cho thấy tỉ lệ tái phát cao ở nhóm BN mang đột biến cKIT exon 17 (70%) so với nhóm khơng mang đột biến (36%)(1,7). Ngồi ra, một 230 và kết quả cho thấy đột biến cKIT exon 17 ảnh hưởng đến tiên lượng bệnh, làm tăng tỉ lệ tái phát so với đột biến cKIT ở các vị trí khác(1,9). Trong nghiên cứu này, mặc dù chúng tơi chưa theo dõi điều trị vì số lượng BN ít và thời gian điều trị ngắn dưới 24 tháng, nhưng BN6 mang cùng lúc 2 kiểu đột biến D816Y và N822K đã tái phát sớm ngay sau khi ngưng hóa trị liệu giai đoạn củng cố 2 và cũng tái phát vào ngày thứ 35 sau khi được dị ghép tế bào gốc tạo máu, cho thấy BN có tiên lượng rất xấu kháng với các phương pháp điều trị hiện tại. Đột biến cKIT trong BCCDT là đột biến tăng chức năng và bị ức chế bởi các thuốc ức chế tyrosine kinase, vì vậy các nghiên cứu gần đây đề nghị phối hợp hóa trị liệu với các thuốc ức chế tyrosine kinase trong điều trị nhóm BN mang t(8;21) có đột biến cKIT nhằm cải thiện tiên lượng và kéo dài thời gian sống cho BN(2,3). Chun Đề Nội Khoa Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 KẾT LUẬN Chúng tơi đã xây dựng thành cơng quy trình khảo sát đột biến gen cKIT trong BCCDT. Kết quả của nghiên cứu giúp các bác sĩ lâm sàng phân nhóm tiên lượng chính xác hơn trên nhóm BN có t(8;21) nhằm lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp cho BN, để có hiệu quả điều trị cao hơn đặc biệt trên nhóm BN có đột biến cKIT. TÀI LIỆU THAM KHẢO Cairoli R, Beghini A, Grillo G, et al. Prognostic impact of cKIT mutations in core binding factor leukemias: an Italian retrospective study. Blood 2006;107(9):3463‐3468. Jae HP, Cyrus VH, Martin ST. Blood consult: acute myeloid leukemia and the t(8;21)(q22;22). Blood 2011;117(10):2775‐2777. Jitakshi De, Reza Z, Michele H, et al. Immunophenotypic Profile Predictive of cKIT Activating Mutations in AML1‐ETO Leukemia. Am J Clin Pathol 2007;128:550‐557. Kim HJ, Ahn HK, Jung CW, et al. KIT D816 mutation associates with adverse outcomes in core binding factor acute myeloid leukemia, especially in the subgroup with RUNX1/RUNX1T1 rearrangement. Ann Hematol. 2013;92(2):163‐71. Nghiên cứu Y học Longley BJ, Reguera MJ, Ma Y. Classes of c‐KIT activating mutations: proposed mechanisms of action and implications for disease classification and therapy. Leuk Res 2001;25(7):571‐6. Park SH, Chi HS, Min SK, et al. Prognostic impact of c‐KIT mutations in core binding factor acute myeloid leukemia. Leuk Res 2011;35(10):1376‐83. Pollard JA, Alonzo TA, Gerbing RB, et al. Prevalence and prognostic significance of KIT mutations in pediatric patients with core binding factor AML enrolled on serial pediatric cooperative trials for de novo AML. Blood 2010;115(12):2372‐9. Renneville A, Roumier C, Biggio V, et al. Cooperating gene mutations in acute myeloid leukemia: a review of the literature. Leukemia 2008, 22: 915–931. Schnittger S, Kohl TM, Haferlach T, et al. cKIT‐D816 mutations in AML1‐ETO‐positive AML are associated with impaired event‐free and overall survival. Blood 2006;107(5):1791‐1799. 10 Shimada A, Taki T, Tabuchi K, et al. KIT mutations, and not FLT3 internal tandem duplication, are strongly associated with a poor prognosis in pediatric acute myeloid leukemia with t(8;21): a study of the Japanese Childhood AML Cooperative Study Group. Blood 2006;107(5):1806‐9. Ngày nhận bài báo: 24/10/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/11/2013 Ngày bài báo được đăng: 05/01/2014 Huyết Học 231 ... phẩm PCR trên đã giúp phát hiện các kiểu đột biến thường gặp trên BN BCCDT. các kiểu đột biến cKIT trên nhóm BN có t(8;21) Kết quả khảo sát đột biến cKIT trên 15 BN BCCDT có t(8;21) ... Nghiên cứu Y học A B Hình 2: Các kiểu đột biến cKIT phát hiên trên bệnh nhân. 2 kiểu đột biến và 2 biến thể (đa hình) phát hiện trên BN6 (A), và hình ảnh đột biến D816V (B) BÀN LUẬN số nghiên cứu khác đã khảo sát ảnh hưởng của ... tự cKIT của 15 BN gồm 8 BN nam và 7 BN nữ, chúng tôi phát hiện 5 BN có đột biến cKIT, chiếm 33,3%. Đột biến trong 5 BN là các đột biến điểm, trong đó BN6 có 2 kiểu đột biến