xây dựng quy trình khảo sát đột biến gen jag1 trong hội chứng alagille

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN JAG1 TRONG HỘI CHỨNG ALAGILLE Mã số: Chủ nhiệm đề tài: Cử nhân NGUYỄN THẾ VINH Tp Hồ Chí Minh, 03/2018 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TĨM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN JAG1 TRONG HỘI CHỨNG ALAGILLE Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 04/2018 DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU Họ tên, học hàm học vị CN NGUYỄN THẾ VINH BS.NGUYỄN VIỆT TRƢỜNG Chức danh trình thực nhiệm vụ Đơn vị cơng tác Chủ nhiệm đề tài Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dƣợc TP.HCM Thành viên Bệnh viện Nhi Đồng Nghiên cứu sinh Bộ môn Nhi, Đại học Y Dƣợc TPHCM PGS.TS HOÀNG ANH VŨ Thành viên Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dƣợc TP.HCM MỤC LỤC CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hội chứng Allagile 1.2 1.3 1.4 Nguyên nhân chế sinh bệnh Triệu chứng Điều trị 1.5 Phƣơng pháp phát kiểu gen JAG1 10 1.5.1 Phƣơng pháp PCR 10 1.5.2 Phƣơng pháp giải trình tự 13 CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 14 2.2 Vật liệu nghiên cứu 14 2.2.1 Thiết bị - Dụng cụ 14 2.2.2 Hóa chất 14 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Thiết kế mồi 15 2.3.2 2.3.3 Phản ứng PCR 17 Kiểm tra sản phẩm PCR điện di thạch agarose 17 2.3.4 Tinh sản phẩm sau PCR 18 2.3.5 Giải trình tự DNA 18 2.4 Thời gian địa điểm thực nghiên cứu 18 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20 3.1 Kết thiết kế mồi 20 3.2 Kết PCR 21 3.3 Kết giải trình tự gen JAG1 23 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 25 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 DANH SÁCH HÌNH HÌNH 3.1 PHẢN ỨNG PCR 11 HÌNH 3.2 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR KHUẾCH ĐẠI 26 EXON GEN JAG1 22 HÌNH 3.3 ĐỘT BIẾN IVS10-1G>T TRÊN GEN JAG1CỦA MẪU ALA-04M 23 HÌNH 3.4 ĐỘT BIẾN C.3417T>C(PY1129Y) TRÊN GEN JAG1CỦA MẪU ALA-04F 24 HÌNH 3.5 ĐỘT BIẾN C.3521C>T(P.P1174L) TRÊN GEN JAG1 CỦA BỆNH NHÂN ALA-04F 24 DANH SÁCH BẢNG BẢNG 2.1 TRÌNH TỰ MỒI KHUẾCH ĐẠI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN JAG1 15 BẢNG 2.2 THÀNH PHẦN PHẢN ỨNG PCR 17 BẢNG 2.3 THÀNH PHẦN PHẢN ỨNG SEQUENCING 18 BẢNG 2.4 KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI GEN JAG1 20 BẢNG 2.5 CÁC PHẢN ỨNG PCR THỰC HIỆN KHUẾCH ĐẠI GEN JAG1 21 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG Thông tin chung: - Tên đề tài: XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN JAG1 TRONG HỘI CHỨNG ALAGILLE - Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: CN Nguyễn Thế Vinh Điện thoại: 0935 827 668 Email: vinhnguyen29391@gmail.com - Đơn vị quản lý chuyên môn (Khoa, Tổ môn): Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Thời gian thực hiện: Tháng 6-2016 đến tháng 6-2017 Mục tiêu: Thiết lập quy trình giải trình tự 26 exon gen JAG1 cho bênh nhân đƣợc chẩn đoán lâm sàng mắc hội chứng Alagille Nội dung chính: - Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho kiểu gen JAG1 - Tối ƣu hoá điều kiện phản ứng PCR - Xây dựng quy trình giải trình tự gen theo phƣơng pháp Sanger cho 26 exon gen JAG1 Kết đạt đƣợc (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ):  Công bố tạp chí nƣớc (tên báo, tên tạp chí, năm xuất bản): Hiệu kinh tế - xã hội đề tài mang lại: MỞ ĐẦU Hội chứng Alagille, rối loạn di truyền trội NST thƣờng, liên quan đến bất thƣờng gan, tim, xƣơng, mắt, thận số phận khác thể Đặc trƣng hội chứng liên quan đến bất thƣờng đƣờng ống mật Đƣờng ống mật chủ gan thƣờng dị dạng, hẹp dẫn đến tích tụ mật gan, gây tổn thƣơng tế bào gan, thƣờng dẫn đến sơ gan Theo nhiều báo cáo giới, bệnh nhân thuộc hội chứng Alagille thƣờng mang đột biến gen JAG1 (94% ) NOTCH2 (2%)(3, 4) Một nửa số đột biến không đƣợc di truyền từ cha mẹ, đa số đột biến phát sinh (de novo) Kiểu đột biến gen JAG1 bao gồm đột biến gây cắt ngắn protein (đột biến vị trí cắt nối, đột biến lệch khung, đột biến vô nghĩa) (chiếm 80%), đột biến sai nghĩa (7%), đột biến làm hồn tồn gen (12%)(5) JAG1 mã hóa cho ligand quan trọng đƣờng tín hiệu Notch, quan trọng hình thành phơi Con đƣờng tín hiệu Notch điều hịa hình thành cấu trúc ống mật gan, đột biến gen JAG1 thƣờng gây biến dạng ống mật chủ gan(1) Việc điều trị hội chứng Alagille chƣa đạt đƣợc giải pháp tối ƣu để điều trị triệt để, chủ yếu dựa việc điều trị triệu chứng để làm thuyên giảm hậu bệnh Các liệu pháp điều trị cố gắng làm tăng dòng chảy mật gan, giảm ứ đọng mật, nhờ làm giảm thiếu hụt đặc biệt số chất dinh dƣỡng, giảm triệu chứng ngứa, hạ thấp nồng độ cholesterol máu, làm chậm trình sơ gan nhiều yếu tố khác Cũng nhƣ vậy, triệu chứng ngứa ứ đọng mật máu da làm giảm bớt Các thuốc khác thƣờng đƣợc dùng để giảm triệu chứng ngứa (Benadryl, Atarax) Cholesterol máu tăng cao đáp ứng với thuốc sử dụng để làm tăng dòng chảy mật Mức độ cholesterol tăng cao dẫn đến ứ đọng nhỏ màu vàng cholesterol da đầu gối, khuỷu tay, gan bàn tay, mí mắt bề mặt khác thƣờng bị cọ xát Hạ thấp mức độ cholesterol máu thƣờng giúp cải thiện ứ đọng cholesterol da Mặc dù không đẹp mắt nhƣng chúng khơng có liên quan đến triệu chứng nguy hiểm Trong việc giảm dòng chảy mật vào ruột dẫn đến tiêu hóa thức ăn béo cơng thức có mức độ chuỗi triglycerides trung bình cao (medium-chain triglycerides-MCT) trẻ em thừơng đƣợc dùng thay cho cơng thức thơng thƣờng Một vài trẻ trƣởng thành cách đầy đủ sữa mẻ thêm dầu MCT vào Thức ăn có chứa mỡ gây tiêu phân lỏng lẫn mỡ sau thời niên thiếu trẻ Tuy nhiên, chất béo cung cấp cung cấp nhiều lƣợng vitamin nên có khuyến cáo khơng nên cho trẻ ăn chế độ ăn kiêng có mỡ Khơng có chế độ ăn kiêng khác Thỉnh thoảng, MCT đƣợc coi nhƣ chất dinh dƣỡng bổ sung Ở số bệnh nhân, việc chẩn đoán hội chứng Alagille dựa yếu tố biểu lâm sàng chƣa đủ Xác định đƣợc đột biến gen JAG1 dựa vào biểu lâm sàng giúp đƣa kết luận xác bệnh để đƣa phƣơng pháp điều trị theo dõi thích hợp Ngồi việc xác định đột biến gen JAG1 bệnh nhân thân nhân cịn mang lại lợi ích việc tƣ vấn di truyền tầm soát bệnh thân nhân bệnh nhân Trong nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp y sinh học phân tử để giải trình tự gen JAG1 tìm đột biến gen ngƣời bệnh mắc hội chứng Alagille CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hội chứng Allagile Hội chứng Alagille rối loạn di truyền giống nhƣ thể bệnh gan kéo dài khác xảy trẻ nhũ nhi trẻ em Tuy nhiên có nhóm đặc điểm bất thƣờng hệ thống quan giúp phân biệt hội chứng Alagille với bệnh gan ống mật chủ khác trẻ em Những trẻ bị hội chứng Alagille thƣờng có bệnh gan thể tổn thƣơng tiến triển ống mật chủ gan năm đầu sống hẹp ống mật chủ gan Điều dẫn đến tích luỹ mật gan, làm tổn thƣờng tế bào gan Hóa sẹo xuất dẫn đến xơ gan khoảng 20 đến 30% số trẻ bị bệnh 1.2 Nguyên nhân chế sinh bệnh Hội chứng Alagille rối loạn di truyền trội nhiễm sắc thể thƣờng, có nghĩa thừa hƣởng gen từ cha mẹ ngƣời có rối loạn Một đứa trẻ có cha mẹ bị hội chứng Alagille có 50% khả mắc rối loạn Hầu hết ngƣời bị hội chứng Alagille có đột biến, khuyết tật, gen Jagged1 (JAG1) Các đột biến gen NOTCH2 đƣợc tìm thấy < 1% ngƣời mắc hội chứng Alagille 1.3 Triệu chứng Các triệu chứng bệnh vàng da, xanh xao, tiêu phân lỏng chậm phát triển tháng đầu đời Sau đó, xuất vàng da kéo dài, ngứa, ú mỡ da trƣởng thành phát triển cách còi cọc suốt năm đầu thời kỳ thơ ấu Thƣờng bệnh ổn định lứa tuổi tuổi 10 tuổi với cải thiện triệu chứng Các đặc điểm khác hội chứng giúp cho việc chẩn đoán bao gồm bất thƣờng hệ thống tim mạch, cột sống, mắt thận Sự thu hẹp mạch máu nối liền tim phổi (động mạch phổi) dẫn đến tiếng tim to mức (âm thổi) nhƣng gây ảnh hƣởng xấu đến chức tim Hình dạng đốt xƣơng sống trơng giống nhƣ cánh bƣớm phim X quang nhƣng phần lớn không gây vấn đề thần kinh tuỷ sống Hơn 90% trẻ em bị hội chứng Alagille có bất thƣờng mắt Đƣờng vòng bề mặt mắt đòi hỏi kiểm tra mắt đặc biệt để phatù không dẫn đến bất thƣờng thị giác Thêm vào đó, vài trẻ có bất thƣờng khác thận dẫn đến thay đổi nhỏ chức thận Nhiều bác sĩ tin trẻ bị hội chứng Alagille có biểu vẻ mặt đặc biệt giúp họ dễ dàng chẩn đốn Các đặc điểm bao gồm trán lồi rộng, mắt sâu hoắm, mũi thẳng cằm nhọn Hội chứng Alagille thƣờng đƣợc truyền từ bố mẹ trẻ có 50% khả phát thành hội chứng Cơ sở vềø di truyền đƣợc xác định “gen Alagille” đƣợc tìm thấy Mỗi ngƣời trƣởng thành hay trẻ em bị ảnh hƣởng có tất hay có đặc điểm hội chứng Thƣờng ngƣời cha mẹ, anh chị trẻ bi ảnh hƣởng có vẻ mặt, âm thổi tim đốt sống hình cánh bƣớm, nhƣng gan ống thận hồn tồn bình thƣờng 1.4 Điều trị Việc điều trị hội chứng Alagille đƣợc dựa việc cố gắng làm tăng dòng chảy mật từ gan, trì hình thành phát triển bình thƣờng, ngăn chặn điều chỉnh thiếu hụt đặc biệt dinh dƣỡng mà thiếu hụt thƣờng tăng lên Bởi hội chứng Alagille dòng mật chảy từ gan vào ruột chậm, thuốc dùng để tăng dòng chảy mật thƣờng đƣợc kê toa, kể ursodeoxycholic acid S T T Mồi xi (5’-3’) Tên mồi Trình tự Mồi ngƣợc (5’-3’) Tên mồi Trình tự JAG1_g1 F JAG1_g2 F JAG1_g3 F JAG1_g4 F JAG1_g5 F JAG1_g6 F JAG1_g8 F JAG1_g9 F JAG1_g10 F JAG1_g12 F JAG1_g13 F JAG1_g14 F JAG1_g15 F JAG1_g16 F JAG1_g19 F JAG1_g21 F JAG1_g22 F JAG1_g24 F JAG1_g26 JAG1_g1 R JAG1_g2 R JAG1_g3 R JAG1_g4 R JAG1_g5 R JAG1_g7 R JAG1_g8 R JAG1_g9 R JAG1_g11 R JAG1_g12 R JAG1_g13 R JAG1_g14 R JAG1_g15 R JAG1_g18 R JAG1_g20 R JAG1_g21 R JAG1_g23 R JAG1_g25 R JAG1_c8 1 1 gaaagccgggaggtgga aga gtcgccacctctatactcg a attttggaaagtcgaccctg gccaaaatggtcagggaa ga tgcaatgggccattctcatg tgtacaggtgtctcttaacg tgtggtgtgggattcggttg agcccctcatgtaagaggt g gagatgggggttgaacttc a tgaagccctgtgtttgtgga ccagagaagttatcgtgac a taggaatgccgcatctgtg g gggagccatgaaaactgc tg gtgaatggtcctggatctc g aagaccgctttccctgttga tctcaaaacattgccacac a ttgaaccccgatccggttc a gccttttgttcttcctctca tttctttctttcttggagag gtgcggaagaaatccga cga aatccctctcgcaaggga ta gatccagctccaactggt tg tgctggtggggtgataaa tg gaggcatagtcacaataa ag gctgagtacagaaaaatt ag acactggacaagcctag gta ggctttgacaatcaaagc ca agctctcctagtgtcgca ca ggaaattccagacacaa gag gtagtaagtggggacaa aag ttcaacaccaatgatccc ag gttgaagtgggatccctc ca tgtcaggatctgctccga ca gtgaggcatggaatgaa gcg aagtcaaatggtgactgc aa agcaagcaagcagacat cca gataatccctcgacctgat g taaagaactacaagccct Kích thƣớc sản phẩm (bp) 615 Vùng exon khuếc h đại 458 184 389 221 580 6,7 288 262 702 10,11 345 12 286 13 318 14 264 15 713 719 16, 17, 18 19, 20 241 21 543 22, 23 606 24, 25 559 26 F R ca 2.3.2 Phản ứng PCR Thiết lập điều kiện cho PCR khuếch đại tạo vùng trình tự ngắn bao phủ exon (1, 2, 3, 21, 22, 23, 24, 25, 26): Mỗi tube PCR tích 15 l chứa thành phần: 1,5μl PCR buffer 10X; 1,5μl dNTP 2,5mM; 0,75μl mồi xuôi ngƣợc (10nM/μl), 0,1μl TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản), 2μl genomic DNA (20-50ng/μl) 8,4μl nƣớc cất lần khử ion Các phản ứng kèm theo chứng âm khơng chứa DNA để kiểm sốt ngoại nhiễm Chu trình luân nhiệt cho PCR đƣợc thực máy Mastercycler@Pro S (eppendorf, Đức) Chu kỳ nhiệt: khởi đầu 98oC phút, với 40 chu kỳ lặp lại bƣớc 98oC : 10 giây, 59oC : 20 giây, 72oC : phút 30 giây; với bƣớc 72oC : phút Trữ sản phẩm PCR 4oC Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ phản ứng 10X buffer PCR 1.5 1X dNTPs 250nm 1.5 20 nM Primer forward (10µM) 0,75 500 nM Primer reverse (10µM) 0,75 500 nM Taq Takara HS 0,1 DNA 50-100 ng H2 O 8,4 Vừa đủ 15 µl 2.3.3 Kiểm tra sản phẩm PCR điện di thạch agarose Sử dụng thạch agarose 2% cho sản phẩm PCR kích thƣớc ngắn( ≤ 2000bp), thạch agarose 0,75% cho sản phẩm PCR có kích thƣớc dài ( ≥ 2000bp), thạch agarose nhuộm với Gel Red quan sát hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ) 2.3.4 Tinh sản phẩm sau PCR Trƣờng hợp có băng phụ xuất hiện, sản phẩm PCR mong muốn đƣợc cắt từ gel tinh Sản phẩm PCR trực tiếp cắt từ gel sau đƣợc tinh illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) theo hƣớng dẫn sử dụng nhà sản xuất Tinh trực tiếp sản phẩm PCR enzyme Exo Sap 2.3.5 Giải trình tự DNA Sản phẩm PCR đƣợc tinh đƣợc thực phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hai chiều xuôi ngƣợc Bảng 2.3 Thành phần phản ứng Sequencing Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ phản ứng 1X buffer sequencing 6.4 1X BigDye 20 nM Primer (5µM) 0,6 500 nM Sản phẩm PCR 50-100 ng Sản phẩm sau đƣợc kết tủa ethanol tuyệt đối, lạnh, với hỗ trợ tủa muối NH4OAC, hòa tan Hi-Di formaldehyde, biến tính 96C trƣớc làm lạnh đột ngột 4oC Trình tự DNA đƣợc đọc máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ) 2.4 Thời gian địa điểm thực nghiên cứu Thời gian thực nghiên cứu từ tháng 6/2016 đến tháng 6/2017 Địa điểm thực nghiên cứu: Trung tâm Y Sinh học Phân tử - ĐH Y Dƣợc Tp Hồ Chí Minh, 217 Hồng Bàng, P11, Q5, Tp Hồ Chí Minh CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết thiết kế mồi Cặp mồi đƣợc thiết kế phần mềm CLC Main Workbench 5.5; vùng thiết kế dựa trình tự vùng mã hóa gen JAG1 Tổng số mồi thiết kế 19 cặp mồi, khuếch đại 26 vùng mã hóa protein gen JAG1 Bảng 2.4 Kết thiết kế mồi gen JAG1 ST Mồi xuôi (5’-3’) T Mồi ngƣợc (5’-3’) Tên mồi JAG1_g1F Trình tự gaaagccgggaggtggaaga Tên mồi JAG1_g1R JAG1_g2F JAG1_g3F JAG1_g4F JAG1_g5F gtcgccacctctatactcga attttggaaagtcgaccctg gccaaaatggtcagggaaga tgcaatgggccattctcatg JAG1_g2R JAG1_g3R JAG1_g4R JAG1_g5R JAG1_g6F JAG1_g8F tgtacaggtgtctcttaacg tgtggtgtgggattcggttg JAG1_g7R JAG1_g8R JAG1_g9F JAG1_g10 F JAG1_g12 F JAG1_g13 F JAG1_g14 F JAG1_g15 F JAG1_g16 F JAG1_g19 F agcccctcatgtaagaggtg gagatgggggttgaacttca JAG1_g9R JAG1_g11 R JAG1_g12 R JAG1_g13 R JAG1_g14 R JAG1_g15 R JAG1_g18 R JAG1_g20 R 10 11 12 13 14 15 tgaagccctgtgtttgtgga ccagagaagttatcgtgaca taggaatgccgcatctgtgg gggagccatgaaaactgctg gtgaatggtcctggatctcg aagaccgctttccctgttga Kích thƣớc sản phẩm (bp) Vùng exon khuếch đại 615 458 184 389 221 580 288 6,7 262 702 10,11 345 12 286 13 318 14 gttgaagtgggatccctcca 264 15 tgtcaggatctgctccgaca 16, 17, 18 19, 20 Trình tự gtgcggaagaaatccgacg a aatccctctcgcaagggata gatccagctccaactggttg tgctggtggggtgataaatg gaggcatagtcacaataaa g gctgagtacagaaaaattag acactggacaagcctaggt a ggctttgacaatcaaagcca agctctcctagtgtcgcaca ggaaattccagacacaaga g gtagtaagtggggacaaaa g ttcaacaccaatgatcccag 713 gtgaggcatggaatgaagc 719 g 16 17 18 19 JAG1_g21 F JAG1_g22 F JAG1_g24 F JAG1_g26 F 3.2 tctcaaaacattgccacaca ttgaaccccgatccggttca gccttttgttcttcctctca tttctttctttcttggagag JAG1_g21 R JAG1_g23 R JAG1_g25 R JAG1_c8R aagtcaaatggtgactgcaa 241 21 agcaagcaagcagacatcc 543 a gataatccctcgacctgatg 606 22, 23 taaagaactacaagccctca 559 26 24, 25 Kết PCR Để khuếch đại tồn vùng trình tự mã hóa gen JAG1 chúng tơi sử dụng kết hợp cặp mồi để tiết kiệm chi phí thời gian, nhƣng đảm bảo đƣợc tính trung thực kết thí nghiệm Bảng 2.5 Các phản ứng PCR thực khuếch đại gen JAG1 Cặp mồi JAG1_g1F/ JAG1_g 2R JAG1_g3F/ JAG1_g 3R JAG1_g4F/ JAG1_g 5R JAG1_g6F/ JAG1_g 8R JAG1_g9F/ JAG1_g 12R JAG1_g12F/ JAG1_g 14R JAG1_g15F/ JAG1_g 20R JAG1_g21F/ JAG1_g 23R JAG1_g24F/ JAG1_c8R Genomic DNA từ máu bệnh nhân Phản ứng Phản ứng Phản ứng Phản ứng Phản ứng Phản ứng Phản ứng Phản ứng Phản ứng Kích thƣớc vùng khuếch đại (bp) 1186 184 2472 1165 2003 1948 2450 1251 1858 Hình 3.2 Kết phản ứng PCR khuếch đại 26 exon gen JAG1 Các sản phẩm PCR sau đƣợc tiến hành tinh giải trình tự cho kết trùng khớp với trình tự gen tham khảo JAG1 (NG_007496 ) cặp mồi khuếch đại thành cơng với sản phẩm có kích thƣớc mong muốn phản ứng kèm với chứng âm âm tính, khơng thể hình 3.3 Kết giải trình tự gen JAG1 Phát đƣợc điểm đột biến gen JAG1 bệnh nhân ALA-04:  p.Y255Y (rs1131695) - Ex6 – dị hợp tử  p.P1174L (rs775363555)- Ex26 – dị hợp tử  IVS10-1G>T Trên gen JAG1 mẫu ALA-04M (mẹ bệnh nhân ALA-04) phát đột biến vị trí -1 intron 10 Hình 3.3 Đột biến IVS10-1G>T gen JAG1của mẫu ALA-04M Trên gen JAG1 mẫu ALA-04F (bố bệnh nhân ALA-04F) phát đột biến exon 26:  c.3521C>T(p.P1174L)  c.3417T>C(pY1129Y) Hình 3.4 Đột biến c.3417T>C(pY1129Y) gen JAG1của mẫu ALA-04F Hình 3.5 Đột biến c.3521C>T(p.P1174L) gen JAG1 bệnh nhân ALA04F CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN Hội chứng Alagille, rối loạn di truyền trội NST thƣờng, liên quan đến bất thƣờng gan, tim, xƣơng, mắt, thận số phận khác thể Đặc trƣng hội chứng liên quan đến bất thƣờng đƣờng ống mật Đƣờng ống mật chủ gan thƣờng dị dạng, hẹp dẫn đến tích tụ mật gan, gây tổn thƣơng tế bào gan, thƣờng dẫn đến sơ gan Theo nhiều báo cáo giới, bệnh nhân thuộc hội chứng Alagille thƣờng mang đột biến gen JAG1 (94% ) NOTCH2 (2%)(3, 4) Một nửa số đột biến không đƣợc di truyền từ cha mẹ, đa số đột biến phát sinh (de novo) Kiểu đột biến gen JAG1 bao gồm đột biến gây cắt ngắn protein (đột biến vị trí cắt nối, đột biến lệch khung, đột biến vô nghĩa) (chiếm 80%), đột biến sai nghĩa (7%), đột biến làm hồn tồn gen (12%)(5) JAG1 mã hóa cho ligand quan trọng đƣờng tín hiệu Notch, quan trọng hình thành phơi Con đƣờng tín hiệu Notch điều hịa hình thành cấu trúc ống mật gan, đột biến gen JAG1 thƣờng gây biến dạng ống mật chủ gan(1) Việc điều trị hội chứng Alagille chƣa đạt đƣợc giải pháp tối ƣu để điều trị triệt để, chủ yếu dựa việc điều trị triệu chứng để làm thuyên giảm hậu bệnh Các liệu pháp điều trị cố gắng làm tăng dòng chảy mật gan, giảm ứ đọng mật, nhờ làm giảm thiếu hụt đặc biệt số chất dinh dƣỡng, giảm triệu chứng ngứa, hạ thấp nồng độ cholesterol máu, làm chậm trình sơ gan nhiều yếu tố khác Ở số bệnh nhân, việc chẩn đoán hội chứng Alagille dựa yếu tố biểu lâm sàng chƣa đủ Xác định đƣợc đột biến gen JAG1 dựa vào biểu lâm sàng giúp đƣa kết luận xác bệnh để đƣa phƣơng pháp điều trị theo dõi thích hợp Ngồi việc xác định đột biến gen JAG1 bệnh nhân thân nhân mang lại lợi ích việc tƣ vấn di truyền tầm soát bệnh thân nhân bệnh nhân Trong nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp y sinh học phân tử để giải trình tự gen JAG1 tìm đột biến gen ngƣời bệnh mắc hội chứng Alagille Nghiên cứu đƣợc thực mẫu DNA bệnh nhân đƣợc chẩn đoán lâm sàng mắc hội chứng Alagille Kết trình tự gen JAG1 mẫu DNA đƣợc phát phƣơng pháp giải trình tự gen Sanger hệ thống may ABI 3500 Mẫu genomic DNA đƣợc thu nhận từ máu bệnh nhân đƣợc chẩn đoán hội chứng Alagille Mẫu máu bệnh nhân đƣợc đánh mã số ALA-4 ngƣời nhà bệnh nhân ALA-04M (mẹ) ALA-04F (bố) Mặc dù ban đầu thí nghiệm xây dựng mồi để giải trình tự gen JAG1 gồm 19 cặp mồi nhƣng trình tiến hành thí nghiệm chúng tơi tổ hợp cặp mồi có khả khuếch đại nhiều exon lúc, hoạt động hiệu điều kiện phản ứng PCR để giảm chi phí tiết kiệm thời gian Do mồi tối ƣu cho việc giải trình tự gen JAG1 cịn cặp mồi để khuếch đại 26 exon gen JAG1, với nhiệt độ bắt cặp mồi 59oC mà không cần phải sử dụng phƣơng pháp Long Range PCR để giảm thiểu phản ứng PCR thực Kết giải trình tự cho thấy phản ứng PCR xảy đặc hiệu, khuếch đại sản phẩm mong muốn, tín hiệu sóng giải trình tự tốt, sóng thấp khơng bị nhiễu Kết khảo sát đột biến bệnh nhân ALA-04 cho thấy gen JAG1 bệnh nhân có mang đột biến điểm, đột biến đƣợc báo cáo SNP không gây bệnh : p.Y255Y (rs1131695)-Ex6-dị hợp tử p.P1174L (rs775363555)Ex26-dị hợp tử Đột biến IVS10-1G>T chƣa đƣợc báo cáo nhƣng có khả cao đột biến gây bệnh vị trí đột biến vị trí bảo tồn cho việc nhận diện cắt nối intron-exon(2), có khả cao ảnh hƣởng đến việc trƣởng thành mRNA gen JAG1 dẫn đến thay đổi protein gen Vấn đề nên đƣợc nghiên cứu thêm để chứng minh, phƣơng pháp giải trình tự cho mRNA gen JAG1 Từ kết giải trình tự thành viên gia đình bệnh nhân ALA-04 thấy bệnh nhân bị di truyền đột biến IVS10-1G>T từ mẹ, đột biến p.P1174L từ bố CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Từ kết thí nghiệm cho thấy xây dựng thành công quy trình giải trình gen JAG1 cho mục đích nghiên cứu đột biến gen bệnh nhân mắc hội chứng Alagille Ở số bệnh nhân, việc chẩn đoán hội chứng Alagille dựa yếu tố biểu lâm sàng chƣa đủ Xác định đƣợc đột biến gen JAG1 dựa vào biểu lâm sàng giúp đƣa kết luận xác bệnh để đƣa phƣơng pháp điều trị theo dõi thích hợp Ngồi việc xác định đột biến gen JAG1 bệnh nhân thân nhân mang lại lợi ích việc tƣ vấn di truyền tầm soát bệnh thân nhân bệnh nhân Từ vấn đề thấy cần thực thí nghiệm thí nghiệm với số lƣợng mẫu lớn để cung cấp thêm thông tin gen di truyền cho nghiên cứu hội chứng Alagille sau TÀI LIỆU THAM KHẢO Bauer RC, Laney AO, Smith R, Gerfen J, Morrissette JJ, Woyciechowski S, Garbarini J, Loomes KM, Krantz ID, Urban Z et al(2010) Jagged1 (JAG1) mutations in patients with tetralogy of Fallot or pulmonic stenosis Human mutation, 31(5):594-601 Burset M, Seledtsov IA, Solovyev VV(2000) Analysis of canonical and non- canonical splice sites in mammalian genomes Nucleic acids research, 28(21):43644375 Li L, Krantz ID, Deng Y, Genin A, Banta AB, Collins CC, Qi M, Trask BJ, Kuo WL, Cochran J et al(1997) Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1 Nature genetics, 16(3):243-251 McDaniell R, Warthen DM, Sanchez-Lara PA, Pai A, Krantz ID, Piccoli DA, Spinner NB(2006) NOTCH2 mutations cause Alagille syndrome, a heterogeneous disorder of the notch signaling pathway American journal of human genetics, 79(1):169-173 Penton AL, Leonard LD, Spinner NB(2012) Notch signaling in human development and disease Seminars in cell & developmental biology, 23(4):450-457 Bauer RC, et al (2010) Jagged1 (JAG1) mutations in patients with tetralogy of Fallot or pulmonic stenosis Human mutation, 31(5):594-601 Burset M, et al (2000) Analysis of canonical and non-canonical splice sites in mammalian genomes Nucleic acids research, 28(21):4364-4375 Deutsch GH, et al (2001) Proliferation to paucity: evolution of bile duct abnormalities in a case of Alagille syndrome Pediatric and Developmental Pathology, 4(6):559-563 Kamath BM, et al (2010) Alagille syndrome and liver transplantation Journal of pediatric gastroenterology and nutrition, 50(1):11-15 10 Li L, et al (1997) Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1 Nature genetics, 16(3):243-251 11 McDaniell R, et al (2006) NOTCH2 mutations cause Alagille syndrome, a heterogeneous disorder of the notch signaling pathway American journal of human genetics, 79(1):169-173 12 Oda T, et al (1997) Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome Nature genetics, 16(3):235-242 13 Penton AL, et al (2012) Notch signaling in human development and disease Seminars in cell & developmental biology, 23(4):450-457 ... F JAG1_ g21 F JAG1_ g22 F JAG1_ g24 F JAG1_ g26 JAG1_ g1 R JAG1_ g2 R JAG1_ g3 R JAG1_ g4 R JAG1_ g5 R JAG1_ g7 R JAG1_ g8 R JAG1_ g9 R JAG1_ g11 R JAG1_ g12 R JAG1_ g13 R JAG1_ g14 R JAG1_ g15 R JAG1_ g18 R JAG1_ g20... JAG1_ g1F/ JAG1_ g 2R JAG1_ g3F/ JAG1_ g 3R JAG1_ g4F/ JAG1_ g 5R JAG1_ g6F/ JAG1_ g 8R JAG1_ g9F/ JAG1_ g 12R JAG1_ g12F/ JAG1_ g 14R JAG1_ g15F/ JAG1_ g 20R JAG1_ g21F/ JAG1_ g 23R JAG1_ g24F/ JAG1_ c8R Genomic... Trình tự Mồi ngƣợc (5’-3’) Tên mồi Trình tự JAG1_ g1 F JAG1_ g2 F JAG1_ g3 F JAG1_ g4 F JAG1_ g5 F JAG1_ g6 F JAG1_ g8 F JAG1_ g9 F JAG1_ g10 F JAG1_ g12 F JAG1_ g13 F JAG1_ g14 F JAG1_ g15 F JAG1_ g16 F JAG1_ g19