Bài viết trình bày việc xây dựng quy trình chẩn đoán sớm đột biến gây bệnh ở giai đoạn tiền làm tổ nhằm giúp đỡ những gia đình có tiền sử mắc bệnh nhưng mong muốn sinh con khỏe mạnh. Bằng việc kết hợp sử dụng các phương pháp giải trình tự, đặc biệt là giải trình tự theo nguyên lí Sanger với việc thực hiện các phản ứng PCR đơn cặp mồi, có thể xây dựng được quy trình phát hiện đột biến trên gen ABCD1 liên quan đến bệnh.
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Xây dựng quy trình phát đột biến gen ABCD1 liên quan đến loạn dưỡng não chất trắng Triệu Tiến Sang1, Trần Văn Khoa1, Nguyễn Thanh Tùng2 Lê Thị Thu Hiền3, Hoàng Xuân Cường4, Trần Ngọc Thảo My5 BM Sinh học Di truyền y học, Học viện Quân y Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội, Học viện Quân y Bệnh viện Nam học muộn Hà Nội Phòng Khoa học Quân sự, Học viện Quân y Khoa Khoa học Kỹ thuật, Trường Đại học Sorbonne, Pháp TÓM TẮT Loạn dưỡng não chất trắng thượng thận (X-ALD) bệnh lí di truyền lặn liên kết giới tính gặp làm rối loạn chức tuyến thượng thận, dây thần kinh tủy sống chất trắng hệ thần kinh Theo thống kê dịch tễ học, bệnh lí gây ảnh hưởng đến 15000 người, nhiên, tỷ lệ mắc bệnh thực tế ước tính cao nhiều nhờ vào việc áp dụng kết hợp kĩ thuật đại giúp chẩn đoán sớm bệnh Khả phát bệnh thời điểm sớm giúp gia đình có tiền sử mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng xây dựng phương án sinh chữa trị triệu chứng bệnh cách chủ động an tồn Vì vậy, nghiên cứu này, chúng tơi xây dựng quy trình chẩn đốn sớm đột biến gây bệnh giai đoạn tiền làm tổ nhằm giúp đỡ gia đình có tiền sử mắc bệnh mong muốn sinh khỏe mạnh Bằng việc kết hợp sử dụng phương pháp giải trình tự, đặc biệt giải trình tự theo ngun lí Sanger với việc thực phản ứng PCR đơn cặp mồi, xây dựng quy trình phát đột biến gen ABCD1 liên quan đến bệnh Sau đó, chúng tơi ứng dụng quy trình cho mẫu tế bào phơi sinh thiết gia đình có tiền sử mắc bệnh nhằm sàng lọc phôi không mang alen gây bệnh loạn dưỡng não chất trắng Kết nghiên cứu cho thấy phát alen đột biến 5/8 phôi (62,5%) phơi cịn lại (37,5%) khơng mang alen đột biến nên phôi tiếp tục sử dụng bước sàng lọc tiền làm tổ trình thụ tinh nhân tạo ĐẶT VẤN ĐỀ Loạn dưỡng não chất trắng thượng thận (X-linked adrenoleukodystrophy, X-ALD (MIM #300100)), bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể X liên quan tới rối loạn q trình β-oxi hóa peroxisome Bệnh đột biến gen ABCD1 mã hóa cho protein xuyên màng peroxisome gây dẫn tới tích tụ mức chuỗi axit béo dài (VLCFA - very long-chain fatty acid; ≥ C22) huyết tương mô, bao gồm phần chất trắng Ngày nhận bài: 19/10/2020 Ngày phản biện: 20/11/2020 Ngày chấp nhận đăng: 09/12/2020 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 17 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG não, tủy sống vỏ thượng thận [2, 4] Cho đến thời điểm tại, giới ghi nhận nhiều ca mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng thượng thận xuất với tần suất tương tự quốc gia Với tỷ lệ mắc bệnh khoảng 14,700 trẻ sơ sinh (cả nam lẫn nữ), hội chứng rối loạn liên quan đến peroxisome phổ biến gặp [9] Tuy nhiên, tỷ lệ thực tế bệnh chưa ước tính xác hầu hết khảo sát liên quan đến bệnh thực Mỹ nước châu Âu, khảo sát thực châu Phi châu Á, đặc biệt vùng Trung Đông [1] Loạn dưỡng não chất trắng thường phân loại thành ba kiểu bệnh chính: X-ALD não, bệnh lý thượng thận – tủy – rễ thần kinh (AMN), kiểu có bệnh Addison [3] Đây thể bệnh với triệu chứng có ảnh hưởng nặng nề tới người mắc bệnh, đặc biệt nam giới Một số triệu chứng lâm sàng chung ba thể bệnh bao gồm thối hóa hệ thần kinh (vận động, thị giác,…) suy giảm tuyến thượng thận khiến cho loạn dưỡng não chất trắng trở thành bệnh phát triển nhanh chóng, nghiêm trọng chưa thể xác định phác đồ điều trị dứt điểm thực hiệu [2] Hiện có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh loạn dưỡng não chất trắng thượng thận, bao gồm phương pháp chẩn đoán trước sinh chẩn đoán sau sinh Đối với phương pháp chẩn đoán trước sinh, việc chọc dịch ối sau thực số xét nghiệm di truyền đưa chẩn đốn tình trạng mắc bệnh thai nhi, nhiên phương pháp xâm lấn gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe người mẹ đồng thời phát bệnh giai đoạn muộn [5, 6] Ngoài ra, số phương pháp chẩn đoán sau sinh bao gồm việc sàng lọc trẻ sơ sinh sử dụng kĩ thuật quang phổ khối (MS/ MS) để đo nồng độ 26:0-lyso-PC hay kĩ thuật chẩn đoán lâm sàng cận lâm sàng chụp 18 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021 ảnh MRI não, xét nghiệm sinh hóa phân tích di truyền tồn nhược điểm chung phát người bệnh giai đoạn muộn [10] Do vậy, hướng nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình giúp chẩn đốn bệnh giai đoạn sớm, đặc biệt giai đoạn tiền làm tổ, giúp gia đình có tiền sử mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng có hội sinh khơng mang gen gây bệnh sinh hệ sau cách chủ động an toàn Tất bệnh nhân mắc chứng ALD mang đột biến gen ABCD1 [8] Đây bệnh di truyền alen lặn nhiễm sắc thể X qui định thời điểm xác định khoảng 5% ca bệnh gây đột biến de novo Gen ABCD1 nằm gần cuối cánh dài nhiễm sắc X: vị trí Xq2.8 có độ dài 19.9 kb bao gồm 10 exon ABCD1 mã hóa cho loại protein xuyên màng cấu tạo từ 745 amino axit gọi adrenoleukodystrophy protein, hay ALDP (protein ALD) Protein nằm xuyên màng peroxisome thực chức vận chuyển VLCFA-CoA từ tế bào chất qua màng vào bên bào quan để tham gia vào trình β-oxi hóa Những đột biến gen ABCD1 gây ảnh hưởng trực tiếp tới protein ALD khiến cho protein bị thay đổi mặt cấu trúc số lượng khiến cho khơng thể thực chức vận chuyển từ gây tích tụ chuỗi axit béo dài tế bào chất Sự tích tụ để lại ảnh hưởng tiêu cực tới tế bào, đặc biệt tế bào hệ thần kinh [3] Chính vậy, nghiên cứu tập trung vào phát đột biến gen ABCD1 nhằm chẩn đoán bệnh loạn dưỡng não chất trắng Quy trình xây dựng nhằm ứng dụng lên mẫu phôi sinh thiết gia đình có tiền sử mắc bệnh X-ALD ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Mẫu máu cặp vợ chồng (vợ: N.T.T – NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG 26 tuổi; chồng: V.Đ.H – 28 tuổi) có tiền sử gia đình phía vợ có người mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng Tám mẫu phôi thụ tinh nhân tạo cặp vợ chồng ni cấy sinh thiết, mẫu (TR1 – TR7) sinh thiết vào ngày 5, mẫu (TR8) sinh thiết vào ngày Các mẫu sinh thiết từ đến tế bào phôi 6, rửa phôi dung dịch PBS 1X + 1% PVP, lấy tế bào phôi vào ống PCR 0,2 ml Tổng toàn dung dịch tế bào dung dịch mơi trường µl Các loại mẫu sử dụng nghiên cứu bảo quản nhiệt độ âm Toàn cam kết liên quan đến mẫu bệnh phẩm mẫu tế bào phôi sinh thiết hồ sơ, mô tả chi tiết nghiên cứu xét duyệt thông qua Hội đồng đạo đức nghiên cứu Y sinh học, Học viện Quân y Vật liệu Hóa chất trang thiết bị: kit tách chiết G-spin™ Total DNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology – Hàn Quốc); kit REPLI-g® Single Cell (QIAGEN – Đức); GoTaq Green Mastermix 2X (dNTPs, Taq polymerase, MgCl2, buffer) (Promega – Hoa Kỳ); Agarose, TBE 1X, ethidium bromide, thang chuẩn ADN (100 bp – 1000 bp 100 bp – 1500 bp) (Cleaver Scientific – Anh); hệ thống trang thiết bị máy móc đạt u cầu kỹ thuật an tồn phịng thí nghiệm Labo thuộc Bộ môn Sinh học Di truyền y học, Học viện Quân y Phương pháp Giải trình tự hệ nhằm khảo sát đột biến: Mẫu bệnh phẩm người có tiền sử gia đình mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng (N.T.T.) gửi giải trình tự hệ nhằm khảo sát đột biến gen ABCD1 Sau có kết quả, mẫu làm giải trình tự Sanger nhằm xác nhận lại đột biến xác định phương pháp NGS Kết giải trình tự hệ phát đột biến dị hợp tử c.854G>C (p.Arg285Pro) exon gen ABCD1 Đồng thời, thực quy trình xác nhận lại đột biến cách khảo sát đột biến exon gen ABCD1 hệ thống ABI 3500 Genetic Analyzer cho kết giống với giải trình tự hệ Đây đột biến lặn nên thể đồng hợp tử mang alen đột biến gây bệnh loạn dưỡng não chất trắng Ngoài ra, theo thống kê ngân hàng liệu đột biến gen ABCD1, đột biến c.854G>C ghi nhận lần khứ nên đột biến xác định bệnh nhân coi xuất lần thứ lịch sử nghiên cứu bệnh [7] Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR: Dựa vào kết giải trình tự bệnh nhân N.T.T với trình tự gen ABCD1 tham khảo ngân hàng trình tự gen quốc tế GenBank, tiến hành thiết kế cặp mồi đặc hiệu sử dụng công cụ NCBI PrimerBLAST đặt tổng hợp cặp mồi hãng Integrated DNA Technologies (IDT), Hoa Kỳ Cặp mồi nhận dạng bột đơng khơ, sử dụng, mồi pha loãng nước khử ion đến nồng độ hoạt động 10 µM Tách chiết ADN từ máu toàn phần: ADN tách chiết sử dụng kit G-spinTM Total Extraction iNtRON Biotechnology: 200 μl máu toàn phần cho vào ống ly tâm 1,5 ml; thêm 200 μl BL Buffer, 20 μl Proteinase K, μl RNase, trộn đều, ủ 56°C thời gian 15 phút; thêm 200 μl EtOH 100%, trộn đều; chuyển 800 μl dung dịch từ ống ly tâm 1,5 ml vào cột lọc, ly tâm 13000 vòng/ phút phút 25°C, đổ dịch; chuyển hết toàn dung dịch lại ống vào cột lọc lặp lại bước trước đó; thêm 700 μl Buffer WA vào cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút phút 25°C, đổ dịch; thêm 700 μl Buffer WB vào cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút phút 25°C, đổ dịch; ly tâm 13000 vòng/phút phút 25°C làm khơ màng lọc, chuyển TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 19 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG cột lọc sang ống ly tâm 1,5 ml mới; thêm 85 μl nước khử ion ủ 56°C vào cột lọc, ủ nhiệt độ phòng tối thiểu phút, ly tâm 13000 vòng/phút phút 25°C, thu ADN ống ly tâm 1,5 ml ADN đo nồng độ giá trị A260/ A280 để kiểm tra chất lượng máy SpectraMax QuickDrop Khuếch đại tồn hệ gen mẫu tế bào phơi sinh thiết: Pha dung dịch D2 với tỷ lệ 33 µl Buffer DLB : µl DTT 1M; spin nhẹ ống chứa tế bào phôi sinh thiết nhỏ lên thành mỗi ống µl dung dịch D2; ủ ống chứa mẫu nhiệt độ 65ºC vịng 10 phút; thêm vào ống µl Stop Solution; spin nhẹ ống ủ nhiệt độ 4ºC vịng phút; chuẩn bị hóa chất khuếch đại hệ gen theo tỷ lệ thể tích (cho mẫu) sau: µl H2O sc, 29 µl REPLI-g Reaction Buffer, µl REPLI-g sc DNA Polymerase; thêm vào ống chứa mẫu tế bào phôi 40 µl hóa chất khuếch đại hệ gen chuẩn bị spin nhẹ, ủ ống chứa mẫu nhiệt độ 30ºC vòng giờ; bất hoạt enzyme REPLI-g sc DNA Polymerase cách ủ mẫu nhiệt độ 65ºC vòng phút; mẫu ADN sau khuếch đại pha loãng tới nồng độ hoạt động khoảng – 20 ng/µl kiểm tra nồng độ máy SpectraMax QuickDrop Tối ưu hóa phản ứng PCR: Dựa nhiệt độ nóng chảy Tm cặp mồi thiết kế, nghiên cứu thiết lập phản ứng PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi với dải nhiệt độ dao động quanh giá trị Tm ± 5ºC với tổng thể tích 25 µl với 12,5 µl GoTaq Green Mastermix 2X, 7,5 µl nước khử ion, 0,5 µl mồi, 4,0 µl dịch ADN tách chiết Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đơn cặp mồi thể phần kết trình tối ưu phản ứng Phát đột biến gen ABCD1 phương pháp PCR giải trình tự theo phương pháp Sanger: Sau xác định nhiệt độ gắn mồi thích hợp, phản ứng PCR tiến hành với cặp mồi thiết kế nhằm khuếch đại đoạn gen mang đột biến Sản phẩm phản ứng PCR sau điện di kiểm tra tinh nhằm gửi giải trình tự Sanger để khảo sát đột biến gen ABCD1 Quá trình ứng dụng với mẫu ADN người mẹ (N.T.T.) làm giải trình tự NGS để so sánh kết quả, sau ứng dụng lên mẫu tế bào phôi sinh thiết KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trình tự cặp mồi cho phản ứng PCR Chúng tơi thiết kế cặp mồi có độ dài 18 base – độ dài lí tưởng để sử dụng nghiên cứu Đồng thời áp dụng số tiêu chí để thiết kế cặp mồi mong muốn sau: kích thước sản phẩm PCR < 500 bp, nhiệt độ nóng chảy (Tm) mồi nằm khoảng từ 50º - 65ºC, tránh lặp lại nhiều lần trình tự mồi dễ gây bắt cặp nhầm Qua đánh giá thông số, sàng lọc kết hệ thống lựa chọn cặp mồi cho hợp lí Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen ABCD1 mong muốn ABCD1F ABCD1R thiết kế thể bảng Bảng Trình tự cặp mồi kích thước sản phẩm PCR dự tính 20 Mã mồi Trình tự đoạn mồi (F – Forward, R – Reverse) Tm (°C) ABCD1F 5’ - GTG TTC CTC ACG GCC AAC - 3’ 56,6 ABCD1R 5’ - CTC CCT GCC ACA CGC TTC - 3’ 59 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021 Kích thước sản phẩm PCR (bp) 199 bp NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Kết tách chiết ADN từ máu toàn phần kết khuếch đại toàn hệ gen mẫu tế bào phôi sinh thiết Mẫu bệnh phẩm người mẹ mang đột biến (NTT-ABCD1) sau tách chiết ADN đo OD đạt nồng độ theo yêu cầu 10,0 ng/µl với số A260/A280 2,0 Mẫu ADN hoàn toàn đạt chất lượng để sử dụng bước quy trình Tám mẫu tế bào phôi sau sinh thiết tiến hành khuếch đại toàn hệ gen pha lỗng với tỷ lệ thể tích 10 µl ADN : 200 µl nước khử ion Kết nồng độ ADN mẫu tế bào phôi sinh thiết sau khuếch đại pha loãng thể bảng Dựa vào bảng kết quả, mẫu tế bào phôi sinh thiết khuếch đại hệ gen thành công nồng độ ADN đạt ngưỡng phù hợp để sử dụng cho bước chu trình đến 58ºC từ 59ºC đến 64ºC, sau sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 2% Kết điện di sản phẩm PCR phản ứng tối ưu nhiệt độ gắn mồi cặp mồi ABCD1F ABCD1R với dải gradient nhiệt độ từ 51ºC đến 64ºC thể hình Bảng Kết nồng độ ADN sau khuếch đại toàn hệ gen mẫu tế bào phơi sinh thiết Nồng độ STT (ng/µl) Mã mẫu Nồng độ (ng/µl) STT Mã mẫu TR1 23,5 TR5 18,5 TR2 21,0 TR6 20,3 TR3 21,6 TR7 21,2 TR4 19,7 TR8 19,4 Kết phản ứng PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi Quá trình tối ưu phản ứng PCR sử dụng mẫu ADN người mang gen gây bệnh (NTTABCD1) làm khuôn để khuếch đại đoạn gen ABCD1 Dựa vào nhiệt độ nóng chảy mồi xi mồi ngược tương ứng 56,6ºC 59ºC, tiến hành hai phản ứng PCR độc lập với dải gradient nhiệt độ gắn mồi từ 51ºC Hình Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phản ứng tối ưu với gradient nhiệt độ gắn mồi từ 51ºC đến 64ºC M: Thang chuẩn marker (100 bp) Phân tích kết điện di sản phẩm phản ứng PCR đơn cặp mồi gel agarose 2% (hình 1) cho thấy có băng sản phẩm với kích thước tính tốn xuất nhiệt độ gắn mồi từ 59 đến 61ºC – kích thước khoảng 199 bp Kết điện di thu nhiệt độ gắn mồi 59ºC cho băng sáng rõ nhất, khơng có sản phẩm phụ vậy, nhiệt độ 59ºC lựa chọn làm nhiệt độ gắn mồi để tiến hành phản ứng PCR cho bước Kết phản ứng PCR giải trình tự kiểm tra lại đột biến mẫu ADN mẹ Dựa vào nhiệt độ gắn mồi xác định, tiến hành thực phản ứng PCR đối tượng ADN người mẹ mang alen đột biến (NTTABCD1) với chu trình nhiệt sau: 95ºC TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 21 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG phút, 40 chu kỳ với 94ºC – 30s, 59ºC – 30s, 72ºC – 30s, 72ºC phút Sản phẩm PCR điện di gel agarose 2% 25 phút với cường độ dòng điện khoảng 125V nhuộm với Ethidium bromide Kết điện di sản phẩm PCR phản ứng thể hình với kết giải trình tự theo phương pháp Sanger trình tự đoạn mang đột biến giống hệt với kết giải trình tự phương pháp NGS – nghĩa phát đột biến c.854G>C Từ chúng tơi kết luận xây dựng quy trình phát đột biến gen ABCD1 liên quan đến bệnh loạn dưỡng não chất trắng ứng dụng quy trình lên tám mẫu tế bào phơi sinh thiết có sẵn Kết ứng dụng quy trình tế bào phôi sinh thiết Phản ứng PCR với thành phần chu trình nhiệt sử dụng bước trước áp dụng cho ADN mẫu tế bào phôi khuếch đại Sản phẩm phản ứng PCR điện di gel agarose 2% quan sát ánh đèn tia UV hình Hình Kết điện di sản phẩm sau phản ứng PCR với ADN mẫu tế bào phôi M: Thang chuẩn marker (100 bp); (+): ADN mẫu NTT-ABCD1; TR1 – TR8: sản phẩm ADN sau khuếch đại Hình Hình ảnh ứng dụng quy trình phát đột biến lên mẫu ADN NTT-ABCD1 (A): Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng PCR, M: Thang chuẩn marker (100 bp); (B): Kết giải trình tự Sanger đoạn gen khuếch đại cặp mồi ABCD1F ABCD1R mẫu NTT-ABCD1 Qua hình ảnh điện di, sản phẩm ADN khuếch đại có kích thước dự kiến không xuất băng sản phẩm phụ Sau đó, sản phẩm phản ứng PCR tinh gửi giải rình tự Sanger với cặp mồi thiết kế, cho kết 22 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021 Kết điện di sản phẩm ADN mẫu tế bào phôi sinh thiết nhằm nhân đoạn gen ABCD1 cho thấy phản ứng PCR khuếch đại thành công đoạn gen mong muốn Băng sản phẩm lên sáng rõ ràng vị trí tương ứng với kích thước thang chuẩn khoảng 200 bp, chứng tỏ đoạn nhân lên có kích thước 199 bp phù hợp tính tốn ban đầu Từ đây, sản phẩm PCR tinh giải trình tự Sanger nhằm khảo sát đột biến c.854G>C mẫu phôi sinh thiết Kết giải trình tự đọc phần mềm BioEdit thể bảng NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Bảng Tổng hợp kết giải trình tự theo phương pháp Sanger cho ADN mẫu tế bào phôi TR1 – TR8 STT Mã mẫu Kết giải trình tự theo phương pháp Sanger Kết chẩn đốn TR1 Bình thường, khơng mang gen gây bệnh TR2 Bình thường, mang gen gây bệnh TR3 Bình thường, mang gen gây bệnh TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 23 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG TR4 Bình thường, mang gen gây bệnh TR5 Bình thường, khơng mang gen gây bệnh TR6 Bị bệnh 24 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG TR7 Bình thường, khơng mang gen gây bệnh TR8 Bình thường, mang gen gây bệnh Kết giải trình tự theo phương pháp Sanger cho thấy, tổng số phôi sinh thiết sử dụng nghiên cứu, có phơi (37,5%) khơng mang alen đột biến gây bệnh, phôi (50%) mang alen đột biến gây bệnh thể dị hợp phôi (12,5%) mang alen gây bệnh thể bán dị hợp tử Điều chứng tỏ, phôi mang alen gây bệnh trình giảm phân hình thành giao tử nhận alen đột biến từ mẹ Những phôi đánh giá không phù hợp để sử dụng cho q trình chuyển phơi phôi không mang alen đột biến tiếp tục làm xét nghiệm sàng lọc tiền làm tổ (PGS - Preimplantation Genetic Screening) để đánh giá chất lượng phôi trước tiến hành thụ tinh nhân tạo Đối với mẫu ADN phôi TR1, TR5 TR7 có kết bình thường khơng có alen gây bệnh thực giải trình tự theo phương pháp giải trình tự hệ để sàng lọc bất thường nhiễm sắc thể Kết sàng lọc PGS cho phôi không mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng thể hình TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 25 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG phơi TR5 khơng phát bất thường 24 nhiễm sắc thể Vì vậy, chúng tơi đưa kết luận phơi TR5 có chất lượng tốt, phù hợp để tiến hành chuyển phơi vào thể người mẹ q trình thụ tinh nhân tạo Hình Kết giải trình tự hệ trình sàng lọc tiền làm tổ nhiễm sắc thể mẫu tế bào phôi (A): Kết mẫu TR1; (B): Kết mẫu TR5; (C): Kết mẫu TR7 Với kết giải trình tự trên, việc sử dụng công cụ tin sinh thống kê sinh học, nhận thấy hai phơi TR1 TR7 có bất thường nhiễm sắc thể, cụ thể phơi TR1 có bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể số 11, phơi TR7 có bất thường số lượng nhiễm sắc thể 2, 4, 6, 8, 11, 11, 18, KẾT LUẬN Xây dựng quy trình phát đột biến gen ABCD1 liên quan đến bệnh loạn dưỡng não chất trắng đồng thời ứng dụng quy trình phát đột biến gen nhằm chọn phôi thụ tinh nhân tạo không mang alen gây bệnh Tuy nhiên cần mở rộng thí nghiệm nhằm ứng dụng quy trình cho thành viên khác đại gia đình giúp chẩn đốn bệnh cho phơi cặp vợ chồng khác đột biến di truyền cho nhiều thành viên từ ln tồn khả sinh mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng mang đột biến c.854G>C Cần nghiên cứu mở rộng thí nghiệm nhằm ứng dụng quy trình cho đột biến khác gen ABCD1 nghiên cứu mở rộng thí nghiệm nhằm ứng dụng quy trình cho đột biến liên quan đến bệnh di truyền đơn gen khác ABSTRACT Establishment of the procedure to detect ABCD1 gene mutations related to X-linked Adrenoleukodystrophy Adrenoleukodystrophy (X-ALD) is a rare sex-linked recessive disorder that disrupts adrenal gland function, the spinal nerves, and the white matter of the nervous system According to recent epidemiological statistics, this disease affects in 15,000 people, however, the actual incidence rate is estimated to be much higher with the combined application of modern genetic techniques used for early diagnosis The earlier the diagnose of the disease, the safer and the more active for families with a history of X-ALD to develop plans for childbirths and treatments of disease's symptoms Therefore, in this study, we developed an early preimplantation diagnosis process to help families with the background of having the disease but wish to have healthy children By combining the use of sequencing methods, especially Next-Generation Sequencing (NGS) and Sanger sequencing with other molecular techniques such as PCR, we were able to develop a procedure to detect mutations on the ABCD1 gene which is involved in the disease We then applied this 26 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG procedure to the family's biopsied embryonic cells with the disease in order to screen for embryos that not carry alleles that cause X-ALD The results of the study showed that we were able to detect mutant alleles in 5/8 embryos (62.5%) while the remaining embryos (37.5%) did not carry mutant alleles; therefore, these embryos could further be used in pre-implantation screening tests during in-vitro fertilization TÀI LIỆU THAM KHẢO Ashrafi M R., M Amanat, M Garshasbi, R Kameli, Y Nilipour, M Heidari, Z Rezaei and A R Tavasoli (2020), “An update on clinical, pathological, diagnostic, and therapeutic perspectives of childhood leukodystrophies”, Expert Review of Neurotherapeutics, 20(1), pp 65-84 Engelen M., S Kemp, M De Visser, B M van Geel, R J Wanders and P Aubourg (2012), “X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD): clinical presentation and guidelines for diagnosis, follow-up and management”, Orphanet journal of rare diseases, 7(1), pp 51 Kemp S (2014), Molecular Genetics of X-linked Adrenoleukodystrophy, eLS, pp 4.KempS.,I.C.Huffnagel,G.E.Linthorst,R.J.WandersandM.Engelen(2016),“Adrenoleukodystrophy– neuroendocrine pathogenesis and redefinition of natural history”, Nature Reviews Endocrinology, 12(10), pp 606-615 Lan F., Z Wang, L Ke, H Xie, L Huang, H Huang, X Tu, D Zheng, J Zeng and H Li (2010), “A rapid and sensitive protocol for prenatal molecular diagnosis of X-linked adrenoleukodystrophy”, Clinica Chimica Acta, 411(23-24), pp 1992-1997 Maier E M., A A Roscher, S Kammerer, K Mehnert, E Conzelmann and A Holzinger (1999), “Prenatal diagnosis of X‐linked adrenoleukodystrophy combining biochemical, immunocytochemical and DNA analyses”, Prenatal Diagnosis: Published in Affiliation With the International Society for Prenatal Diagnosis 19(4), pp 364-368 Moser A B., N Kreiter, L Bezman, S E Lu, G V Raymond, S Naidu and H W Moser (1999), “Plasma very long chain fatty acids in 3,000 peroxisome disease patients and 29,000 controls”, Annals of Neurology: Official Journal of the American Neurological Association the Child Neurology Society, 45(1), pp 100-110 Mosser J., A.-M Douart, C.-O Sarde, P Kioschisi, R Feil, H Moser, A.-M Poustka, J.-L Mandel and P Aubourgi (1993), “Adrenoleukodystrophy gene shares unexpected homology”, Nature, 361(pp 25 Turk B R., C Theda, A Fatemi and A B Moser (2020), “X‐linked adrenoleukodystrophy: Pathology, pathophysiology, diagnostic testing, newborn screening and therapies”, International Journal of Developmental Neuroscience, 80(1), pp 52-72 10 Zhu J., F Eichler, A Biffi, C N Duncan, D A Williams and J A Majzoub (2020), “The Changing Face of Adrenoleukodystrophy”, Endocrine Reviews, 41(4), pp 1-17 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210 27 ... 4, 6, 8, 11, 11, 18, KẾT LUẬN Xây dựng quy trình phát đột biến gen ABCD1 liên quan đến bệnh loạn dưỡng não chất trắng đồng thời ứng dụng quy trình phát đột biến gen nhằm chọn phôi thụ tinh nhân... giải trình tự theo phương pháp Sanger trình tự đoạn mang đột biến giống hệt với kết giải trình tự phương pháp NGS – nghĩa phát đột biến c.854G>C Từ kết luận xây dựng quy trình phát đột biến gen ABCD1. .. đột biến cách khảo sát đột biến exon gen ABCD1 hệ thống ABI 3500 Genetic Analyzer cho kết giống với giải trình tự hệ Đây đột biến lặn nên thể đồng hợp tử mang alen đột biến gây bệnh loạn dưỡng não