XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN rtA181V/T VÀ rtN236T KHÁNG ADEFOVIR CỦA VIRUS VIÊM GAN B (Hepatitis B Virus) BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR

THƯ VIỆN BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH ‫ ٭٭٭٭‬   ‫٭٭٭٭‬ LÊ THỊ DUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN rtA181V/T VÀ rtN236T KHÁNG ADEFOVIR CỦA VIRUS VIÊM GAN B (Hepatitis B Virus) BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học Mã số: 60 40 60 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS CAO MINH NGA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2010 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài: Viêm gan (VG) gọi sưng gan, tình trạng bệnh lý phổ biến thương tổn tế bào gan Có nhiều nguyên nhân gây VG như: vi khuẩn, rượu, hóa chất vài loại thuốc vô số loại virus, có virus viêm gan B (VRVGB) [20] VRVGB hay Hepatitis B virus (HBV) virus tiêu biểu họ Hepadnaviridae, họ gây VG cho nhiều loài động vật HBV lây truyền qua đường máu, đường tình dục, từ mẹ sang con, qua tiếp xúc,… Quá trình nhiễm bệnh HBV kéo dài, diễn tiến nặng, tỷ lệ tử vong cao Theo ước tính Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) có tỷ người giới nhiễm HBV thời điểm đời, 350 triệu người mang HBV mạn, 60 triệu người chết ung thư tế bào gan 45 triệu người chết xơ gan [6] Đến năm 2004, số người nhiễm HBV toàn cầu tăng lên 400 triệu người [28] Vì vậy, nhiễm VRVGB mạn tính xem vấn đề y tế mang tính chất toàn cầu Việt Nam quốc gia thuộc vùng nội dịch bệnh với tỷ lệ nhiễm VRVGB mạn tính vào khoảng 15-20% dân số, nghĩa có 10 triệu tổng số khoảng 80 triệu người bị nhiễm VRVGB [8] Các thuốc đặc hiệu dùng để điều trị cho người mang HBV mạn tính gồm hai loại thuốc uống thuốc tiêm Thuốc tiêm gồm Interferon alfa-2b PEG Interferon alfa-2a, loại thuốc vừa ức chế siêu vi vừa tăng cường miễn dịch đắt tiền nhiều tác dụng phụ Còn thuốc uống gồm Lamivudine (LAM), Adefovir dipivoxil (ADV), Entecavir (ETV) Tenofovir (TDF) Cơ quan Quản lý Thực – Dược Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận cho sử dụng Ở Việt Nam nay, ADV LAM sử dụng chủ yếu điều trị cho bệnh nhân viêm gan B mãn tính ADV có tác dụng ức chế VRVGB chậm hơn, song hiệu với siêu vi kháng LAM Do vậy, điều trị người ta thường kết hợp ADV bắt đầu có tượng virus kháng LAM Hiện tượng kháng ADV, xuất muộn thường xuyên tìm thấy khoảng 28% bệnh nhân điều trị sau năm [26,29,39] Asparagine (N) thay Threonine (T) codon 236 vùng RT (rtN236T) alanine (A) thay Valine (V) Threonine (T) codon 181 vùng RT (rtA181V/T) nhận biết kháng ADV [38] Trên thực tế, có nhiều phương pháp khác để phát đột biến phương pháp dựa vào kiểu hình, phương pháp dựa vào kiểu gen Phương pháp dựa vào kiểu gen bao gồm phương pháp lai mẫu dò Southern blot (Southern, 1975), giải trình tự trực tiếp, tạo dòng, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - Tính đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn), Oligonucleotide Microarrays, PCR (Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase; Karl Mullis cộng sự, 1985), phương pháp real-time PCR,… phương pháp có ưu, nhược điểm riêng Tuy nhiên, tính ưu việt phương pháp real-time PCR kỹ thuật hoàn toàn mở, nhanh, nhạy, xác, không lệ thuộc vào hãng sản xuất kít nước ngoài, giá thành rẻ hơn,… nên chọn realtime PCR để phát đột biến kháng ADV HBV huyết bệnh nhân viêm gan B mãn Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, chọn đề tài “Xây dựng quy trình phát đột biến rtA181V/T rtN236T kháng Adefovir virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) kỹ thuật realtime PCR”, nhằm phát nhanh đột biến kháng thuốc, với giá thành thấp có ý nghĩa công tác theo dõi điều trị bệnh viêm gan siêu vi B Mục đích đề tài: Xây dựng quy trình xác định đột biến kháng thuốc Adefovir HBV rtA181V/T rtN236T kỹ thuật real-time PCR sử dụng TaqMan probe, chi phí thấp để phát triển thành kit phục vụ trình điều trị viêm gan siêu vi B tương lai Đối tượng nghiên cứu: Những bệnh nhân VGB mạn điều trị ADV Phạm vi nghiên cứu: Các phòng thí nghiệm, trung tâm xét nghiệm bệnh viện thuộc địa bàn thành phố Hồ Chí Minh (Bệnh viện Đại học Y Dược, Trung tâm Y khoa Medic, Phòng thí nghiệm Công ty Việt Á ) Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn đề tài: Trong năm gần đây, Việt Nam có nhiều nghiên cứu bệnh viện sở y tế ứng dụng phương pháp giải trình tự PCR để phát đột biến kháng thuốc HBV bệnh nhân viêm gan B mãn điều trị, có đột biến kháng ADV vị trí rtA181T/V rtN236T Tuy nhiên, giá thành cho mẫu xét nghiệm giải trình tự cao Do vậy, có quy trình xác định kháng Adefovir rtA181T/V rtN236T đơn giản, xác, giá thành thấp cần thiết Để đáp ứng nhu cầu đó, xây dựng kỹ thuật real-time PCR nhằm phát đột biến kháng Adefovir công trình chưa công bố trước Việt Nam Bố cục đề tài: Mở đầu Chương – Tổng quan tài liệu Chương – Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu Chương – Kết thảo luận Chương – Kết luận kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục CHƯƠNG – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu nước 1.1.1 Tình hình nghiên cứu nước Bệnh VGB (VG huyết thanh) bệnh nhiễm trùng phổ biến toàn giới với nhiều đường lây truyền khác Châu Á châu Phi khu vực có tỷ lệ nhiễm bệnh cao (khoảng 180 triệu dân châu Á châu Phi mang mầm bệnh, chiếm 80% tổng số 220 triệu người mang mầm bệnh toàn giới) [20] Một số bệnh nhân nhiễm HBV sau lành bệnh mang mầm bệnh thời gian dài, số khác trở thành VG mạn tính kéo dài nhiều năm hay suốt đời, dẫn đến xơ gan, ung thư tế bào gan Do vậy, nhiễm HBV xem vấn đề sức khỏe toàn cầu Theo Dieter Glebe cộng [26,44], HBV xếp vào kiểu gen A, B, C, D, E, F, G, H phân bố tùy theo vùng địa dư Kiểu gen B C chủ yếu khu vực Đông Nam Á, có Việt Nam Theo Perrillo cộng [34], ADV chất tương tự nucleoside/tide, FDA chấp thuận sử dụng điều trị bệnh nhân mang HBV mạn tính từ năm 2005 Nó đóng vai trò chất ức chế lên vùng reverse transcriptase (RT) gen HBV polymerase, tất trường hợp hoàn toàn làm giảm nồng độ virus Tuy nhiên, chất ức chế chủ yếu tác động vào nhân lên virus làm cho virus tăng lên không tiêu diệt virus cách phá hủy cấu trúc virus hình thành theo Pawlotsky cộng [33] Đây nguyên nhân xuất đột biến kháng thuốc HBV dẫn đến điều trị thất bại diễn tiến xấu bệnh Hiện tượng kháng ADV, xuất muộn thường xuyên tìm thấy khoảng 28% bệnh nhân điều trị sau năm nghiên cứu Hadziyannis cộng (2005) [27], Lok cộng (2007) [30], Westland cộng (2003) [40] Theo Villet cộng (2008) [39], Lok cộng (2007) [30], Pawlotsky cộng (2008) [33], đột biến dẫn đến tượng kháng ADV HBV điều trị vị trí rt181 rt236 thuộc dạng đột biến điểm thay nucleotide thành nucleotide khác, làm biến đổi acide amine thành acide amine khác Hiện nay, có nhiều phương pháp phát đột biến kháng ADV HBV giải trình tự, lai mẫu dò (line probe assay – LiPA), PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism – Tính đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn), PCR (có thể kết hợp với giải trình tự), real-time PCR (PCR định lượng)… Tuy nhiên, phương pháp có ưu, nhược điểm riêng PCR kết hợp với giải trình tự có công trình Yan J cộng (2006) [39] với độ nhạy 103 sao/l Chen J.J cộng (2008) [25] sử dụng phương pháp PCR-RFLP phát virus mang đột biến rtN236T thời gian điều trị ADV từ 0-8 tháng Bộ kit INNO-LiPA HBV DR v2 (Innogenetics, 2006) sử dụng mẫu dò đặc hiệu với nhiều vị trí đột biến kháng ADV LAM Theo Carla Osiowy cộng (2006) [24], Munira Hussain cộng (2006) [31], kit có độ đặc hiệu cao, phát sớm đột biến có độ nhạy cao so với phương pháp giải trình tự chuỗi Ưu điểm lúc phát nhiều đột biến, thao tác kỹ thuật dễ thực giá thành đắt không phù hợp phát chẩn đoán, phục vụ cho trình theo dõi điều trị nhiễm HBV mạn tính Việt Nam Trong công trình nghiên cứu mình, Julien Lupo cộng (2009) [28] chứng tỏ việc phát đột biến kháng ADV LAM phương pháp real-time PCR có độ nhạy cao so với phản ứng lai mẫu dò (sử dụng kit INNO-LiPA DR v2, Innogenetics) giải trình tự Bằng cách pha trộn chủng đột biến chủng hoang dại, real-time PCR với mẫu dò phát huỳnh quang có khả phát 0,1% mang đột biến tổng số 105 Phương pháp có ưu điểm định lượng nồng độ virus mang đột biến quần thể nên giúp hiểu rõ phát triển tự nhiên dạng virus kháng thuốc suốt trình điều trị 1.1.2 Tình hình nghiên cứu nước Việt Nam nằm vùng dịch lưu hành cao với tỷ lệ nhiễm HBV cộng đồng từ 10-20% dân số [6,20] Trong số nghiên cứu y học [1,9], Việt Nam, HBV có kiểu gen A, B C Trong đó, hai kiểu gen B C chủ yếu Hiện nay, Việt Nam, ADV LAM sử dụng chủ yếu điều trị cho bệnh nhân viêm gan B mãn tính ADV có tác dụng ức chế VRVGB chậm hơn, song hiệu với siêu vi kháng LAM Do vậy, điều trị người ta thường kết hợp ADV bắt đầu có tượng virus kháng LAM Hiệu điều trị ADV không thay đổi với kiểu gen (genotype) HBV Hiện tượng kháng ADV HBV bệnh nhân mạn tính thời gian điều trị thường xuất chậm với tỷ lệ thấp Thế đột biến xuất hiện, nhân lên quần thể ảnh hưởng không nhỏ đến trình chẩn đoán chi phí điều trị Các phương pháp áp dụng phát dạng đột biến kháng thuốc HBV PCR, giải trình tự, PCR-RFLP, real-time PCR… Một số sở y tế sử dụng số kit nước kết hợp với giải trình tự hệ thống máy tự động LAM (1998) FDA chấp thuận đưa vào sử dụng điều trị sớm so với ADV (2002), Việt Nam có nhiều công trình nghiên cứu phát tính kháng LAM HBV điều trị Công ty Nam Khoa (Tp Hồ Chí Minh) sử dụng phương pháp giải trình tự máy CEQ8000 (Beckman Coulter) để phát kiểu gen đột biến kháng LAM, ADV HBV Phát đột biến rt180 rt204 kháng LAM HBV sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP có đề tài nghiên cứu Nguyễn Chí Vinh [22]; sử dụng phương pháp real-time PCR có công trình nghiên cứu Nguyễn Sử Minh Tuyết cộng [19], Nguyễn Thành Khôi Hồ Huỳnh Thùy Dương [10] Sử dụng phương pháp PCR đọc kết qua điện di gel agarose 3% đề tài Trần Thiện Toàn (Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) [18] Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng mồi ngược bắt cặp với mẫu hoang dại vị trí rt181, mẫu mang đột biến cho kết âm tính (không xuất vạch) gel tia UV Trong khóa luận tốt nghiệp, Huỳnh Trường An (Đại học Mở, Tp Hồ Chí Minh) [2], sử dụng mồi ngược bắt cặp với mẫu đột biến rt236 mẫu dò phát huỳnh quang đọc tín hiệu qua chu kỳ khuếch đại Trên thực tế, việc lựa chọn phương pháp cho đắn để đưa vào chẩn đoán thường quy không dễ PCR kết hợp với giải trình tự hay PCR-RFLP phương pháp đòi hỏi kỹ thuật viên có trình độ tay nghề cao, thao tác khéo léo, thời gian cho kết lâu, thiên nghiên cứu nhiều áp dụng vào thực tiễn nhược điểm lớn độ nhạy không cao real-time PCR Với ưu điểm phát xác nồng độ virus đột biến quần thể, real-time PCR xem công cụ hữu hiệu với giá thành thấp, dùng để phát đột biến kháng ADV rt181 rt236 HBV bệnh nhân mạn tính 1.2 Đại cương virus gây bệnh viêm gan siêu vi B 1.2.1 Lịch sử phát bệnh viêm gan siêu vi B [6,7] Lịch sử loại VGVR thực lịch sử bệnh vàng da (hoàng đảm), hội chứng ghi nhận lâu lịch sử loài người với nhiều bệnh khác gây nên vàng da Vàng da dấu hiệu bệnh toàn thân, bệnh chủ yếu gan Bệnh gan gây nên vàng da có nhiều nguyên nhân, tác nhân virus chủ yếu Sau lịch sử VG ghi nhận theo kinh biểu niên Vàng da nhiễm khuẩn biết từ thời Hippocrates Tuy người ta rõ nơi trận dịch VGVR xảy Luerman (1883) mô tả trận dịch xưởng đóng tàu Bremen người chủng ngừa vaxcin đậu mùa có bạch cầu người Cùng năm này, trận vàng da sau chủng ngừa khác xảy Merzig Do vậy, diện thể VGVR lây nhiễm trực tiếp từ máu người dẫn xuất từ máu nghĩ đến Virchow (1885) mô tả bệnh gan bệnh “vàng da xuất tiết” (catarrhal) Ông cho vàng da xuất tiết có nguyên nhân viêm đường mật chất nhầy dính làm tắc đường mật, từ gây viêm chỗ nối đường mật – tá tràng bệnh vi khuẩn gây Quan niệm Virchow gây ảnh hưởng lâu dài cản trở quan điểm tiến nguyên nhân sinh bệnh học VGVR cho đến nửa đầu kỷ XX (Thế chiến thứ II) McDonald (1908) cho tác nhân vàng da xuất tiết virus Lindstedl (Thụy Điển, 1919) tiên phong việc đặt thuật ngữ VG cho bệnh vàng da xuất tiết chẩn đoán phân biệt hai dạng VG dịch tễ VG huyết Năm 1943 – 1946, nghiên cứu Anh Quân Y Mỹ cho VRVGB diện huyết gây vàng da thường mang người khỏe mạnh bình thường không vàng da Nhưng đến trận dịch VG toàn giới Thế chiến thứ II đưa đến nhận thức tổng quát chất lây nhiễm bệnh vàng da xuất tiết Virchow Năm 1947, MacCallum đề nghị gọi tên bệnh VG nhiễm huyết VGB Cuối cùng, thuật ngữ Ủy Ban Tổ chức Y tế Thế Giới VGVR chấp thuận Năm 1963, Blumberg, nghiên cứu protein huyết đa hình (polymorphic), phát protein máu thổ dân Australia trước chưa biết Năm 1965, protein Australia gọi kháng nguyên Australia (hiện gọi kháng nguyên bề mặt HBsAg) Vào lúc này, xét nghiệm miễn dịch men (EIA) dấu ấn miễn dịch loại VGVR huyết sở chẩn đoán lâm sàng Sau khám phá kháng nguyên Australia huyết thanh, Blumberg cộng nhận xét kháng nguyên diện với nồng độ cao bệnh nhân ung thư máu trẻ bị bệnh Down Năm 1968, nhà nghiên cứu khác, Prince, Okochi Murakami, xác định kháng nguyên Australia tìm thấy huyết người nhiễm VRVGB, từ VRVGB nhận biết xác lập đặc điểm Blumberg nhận giải Nobel Y học vào năm 1976 nhờ phát Từ năm 1942-1967, nghiên cứu thực nghiệm viêm gan thực người (Đức Mỹ) bị nhiều người phê phán vấn đề y đức Nhưng nhờ mà đặc điểm dịch tễ, bệnh sử phòng ngừa hai loại VG A B hiểu biết rõ Năm 1970, hạt tương tự virus phát (gọi hạt Dane) mang bề mặt kháng nguyên Australia huyết bệnh nhân VGB hạt cho VRVGB Kaplan (1973) phát DNA polymerase nội sinh bên vỏ hạt Dane Chính DNA polymerase giúp Robinson (1979) nhân dòng HBV DNA xác định chuỗi mã nucleotide DNA toàn phần, cho HBV tác nhân gây bệnh theo đường máu không chép môi trường nuôi cấy mô Từ đó, gen HBV gen độc đáo giới virus chất đậm đặc chúng, khung đọc gối lên phụ thuộc vào bước phiên mã ngược, virion chứa chủ yếu DNA Do phát này, VRVGB người trở thành kiểu nguyên sinh họ hepadnavirus, Hepadnaviridae Năm 1972, Magnus phát HBeAg Mullis K.B (1983) tìm phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Đây phương pháp nhân dòng in vitro nhằm tạo số lượng lớn chuỗi mã định Nhờ phát minh này, Mullis nhận giải Nobel (1993) sinh học phân tử có bước tiến Sự khuếch đại virus PCR giúp phát trực tiếp nhạy HBV DNA huyết thanh, tế bào mô, phát nhiễm HBV gián tiếp qua đáp ứng miễn dịch ký chủ kháng nguyên virus Nhờ thập kỷ vừa qua, nhiều tiến đạt sinh học phân tử, dịch tễ học, sinh bệnh học, chẩn đoán, điều trị dự phòng HBV 1.2.2 Phân loại kiểu gen HBV 1.2.2.1 Phân loại HBV Hiện nay, virus có tính hướng gan xếp vào danh sách ngày dài, thường xếp theo thứ tự mẫu la tinh từ A (HAV), B (HBV), C (HCV), D (HDV) , E (HEV), G, TTV (đến có 16 kiểu huyết TTV), virus SENV (phát năm 1999, đến có kiểu gen), virus SANBAN, virus nhỏ giống TTV, virus YONBAN, virus Sentinel… [6,7] Trong đó, có virus A E truyền theo đường tiêu hóa (thường gặp vụ dịch Châu Á, Bắc Phi Mexico); virus khác (B, C, D) truyền theo đường máu; VRVG G cho truyền qua đường máu, tác nhân gây bệnh hiếm, có thường gây VG rõ rệt Năm 1994, VRVG F báo cáo, nay, VRVG F xem thể biến dị HBV gặp Nhật Bản [6,16] Dựa theo xuất tự nhiên: HBV thuộc virus động vật có xương sống Dựa theo nhóm acide nucleic virus động vật, HBV nằm nhóm 1, chứa sợi DNA có cấu trúc xoắn vòng, mạch phiên mã tạo mRNA (dịch mã tạo protein vỏ capsid) HBV có cấu trúc 20 mặt, 42 capsomer, có vỏ ngoài, trọng lượng phân tử 1,6kD, sợi thứ hai chưa hoàn chỉnh có khác chiều dài Dựa theo khả gây bệnh: HBV virus gây viêm gan (viêm nhiễm tuyến) [4] Hệ thống phân loại HBV: Họ Hepadnaviridae Chi Orthohepadnavirus Hepatitis B virus [20] 1.2.2.2 Các kiểu gen HBV Dựa vào mức độ tương đồng trình tự nucleotide, người ta chia HBV thành kiểu gen (genotype) gọi theo thứ tự mẫu la tinh: A, B, C, D, E, F, G, H [44] Các kiểu gen HBV khác 8% Bên cạnh đó, chúng đa dạng, kiểu gen lại chia thành nhiều phân týp (subgenotype) phân týp khác 4% [26] Các kiểu gen HBV khác phân bố vùng địa lí đặc trưng khác nhau: kiểu gen A phổ biến Bắc Mỹ, Châu Âu, Nam Phi, Ấn Độ; kiểu gen B C phổ biến Châu Á; kiểu gen D phổ biến Châu Âu (vùng Địa Trung Hải), Trung Đông, Ấn Độ Nam Phi; kiểu gen E phổ biến Tây Phi; kiểu gen F phổ biến Trung Nam Mỹ, Alaska; kiểu gen G phổ biến Châu Âu, Mexico, Mỹ; kiểu gen H thường thấy Trung Mỹ, Mỹ Nhật Bản [37] Hình 1.1: Sự phân bố kiểu gen HBV giới Nguồn: Marion Peters MD (2008), Hepatitis B - Diagnosis, Serology, Virology, UCSF 1.2.3 Tình hình nhiễm virus HBV giới Việt Nam Nhiễm HBV bệnh thường gặp giới gây VG mạn người VGB mạn tính dẫn đến xơ gan chết suy gan; nguyên nhân yếu ung thư tế bào gan giới TÀI LIỆU THAM KHẢO A – Tài liệu tiếng Việt Đông Thị Hoài An, Cao Minh Nga, Phạm Hoàng Phiệt, Kenji Abé (2003), “Kỹ thuật định típ gen siêu vi viêm gan B multiplex PCR bệnh nhân nhiễm siêu vi viêm gan B mãn tính”, Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, tập 7, phụ số Huỳnh Trường An, Lê Huyền Ái Thúy, Lê Thị Trúc Linh (2009), “Xây dựng quy trình phát đột biến rtN236T kháng thuốc Adefovir bệnh nhân viêm gan B mạn tính Việt Nam kỹ thuật real-time PCR”, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Mở Tp Hồ Chí Minh Lê Huy Chính, Nguyễn Vũ Trung (2005), Cẩm nang vi sinh vật y học, Nhà xuất Y học Nguyễn Thị Chính, Ngô Tiến Hiển (2001), Virus học, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003), Sinh học phân tử, Nhà xuất Giáo Dục Bùi Đại (2002), Viêm gan vi rút B D, Nhà xuất Y học Châu Hữu Hầu (2006), Viêm gan virus C, Nhà xuất Y học TP Hồ Chí Minh Bùi Hữu Hoàng (2002), “Ý nghĩa dấu ấn huyết chẩn đoán điều trị viêm gan siêu vi B”, Chuyên đề nghiên cứu Bùi Hữu Hoàng, Đinh Dạ Lý Hương, Phạm Hoàng Phiệt, Erwin Sablon (2003), “Kiểu gen siêu vi viêm gan B bệnh nhân xơ gan ung thư gan nguyên phát”, Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, tập 7, phụ số 10 Nguyễn Thành Khôi, Hồ Huỳnh Thùy Dương (2009), “Xây dựng quy trình phát đột biến điểm có độ nhạy độ đặc hiệu cao phương pháp real-time allele-specific PCR”, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc – khu vực phía Nam 11 Võ Thị Thương Lan (2008), Sinh học phân tử, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 12 Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu (2005), Sinh học phân tử: Giới thiệu phương pháp ứng dụng, Nhà xuất Nông nghiệp 13 Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 14 Cao Minh Nga, Phan Quốc Việt, Hồ Thị Thanh Thủy (2008), “Tài liệu tập huấn: Ứng dụng sinh học phân tử chẩn đoán bệnh nhiễm người”, Công ty cổ phần Công nghệ Việt Á 15 Khuất Hữu Thanh (2005), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 16 Tierney, Mc Phee, Papadakis (2008), Chẩn đoán điều trị y học đại – tập 2, Nhà xuất Y học 17 Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích DNA – tập 2, Nhà xuất Khoa học Tự nhiên Công nghệ Hà Nội 18 Trần Thiện Toàn, Lê Huyền Ái Thúy, Nguyễn Văn Hưng (2009), “Xây dựng quy trình phát đột biến kháng Adefovir HBV phương pháp PCR bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính Việt Nam”, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Tp Hồ Chí Minh 19 Nguyễn Sử Minh Tuyết, Hồ Thị Thanh Thủy, Nguyễn Thanh Bảo, Cao Minh Nga (2010), “Phát đột biến rtL180M rtM204V/I kháng Lamivudine bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính kỹ thuật real-time PCR”, Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, tập 14, phụ số 20 Phạm Văn Ty (2007), Virus học, Nhà xuất Giáo dục 21 Phạm Hùng Vân (2009), PCR real-time PCR – Các vấn đề áp dụng thường áp dụng, Nhà xuất Y học TP Hồ Chí Minh 22 Nguyễn Chí Vinh (2006), “Xây dựng quy trình phát đột biến kháng Lamivudine 180rt – 204rt đột biến Basal core promoter virus viêm gan B (Hepatitis B virus) kỹ thuật PCRRFLP”, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp Hồ Chí Minh B – Tài liệu tiếng Anh 23 Adams abd M.O.Moss (2001), Food Microbiology, published by the Royal society of chemistry, 60-81 24.Carla Osiowy, Jean-Pierre Villeneuve, E Jenny Heathcote, Elizabeth Giles and Jamie Borlang (2006), “Detection of rtN236T and rtA181V/T mutations associated with resistance to Adefovir dipivoxil in samples from patients with chronic Hepatitis B virus infection by the INNO-LiPA DR line probe assay (version 2)”, Journal of Clinical Microbiology, Vol 44, No 6, p 1994-1997 25 Chen J.J., Ma S.W., Wang Z.H., Sun J., Hou J.L (2008), “Kinetics of HBV mutants conferring adefovir resistance (rtn236t) and a method to detect them rapidly”, Article in Chinese, 16 (1): 33-7 26 Dieter Glebe, PhD, Series Editor (2007) Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes, p 14-15 27 Hadziyannis, S J., Tassopoulos, N C., Heathcote, E J., Chang, T T., Kitis, G., Rizzetto, M., Marcellin, P., Lim, S G., Goodman, Z., Ma, J., Arterburn, S., Xiong, S., Currie, G., Brosgart, C L., (2005), “Long-term therapy with adefovir dipivoxil for HBeAg-negative chronic hepatitis B”, The New England Journal of Medicine 352, 2673–2681 28 Julien Lupo, Sylvie Larrat, Marie-Noёlle Hilleret, Raphaёle Germi, Véronique Boyer, Sandrine Nicod, Gérard Barguès, Vincent Leroy, Jean-Marie Seigneurin, Jean-Pierre Zarski, Patrice Morand (2009), “Assessment of selective real-time PCR for quantitation of lamivudine and adefovir Hepatitis B virus-resistant strains and comparision with direct sequencing and line probe assays”, Journal of Virological Methods 156, p 52-58 29 Lai, C.L., Ratziu, V., Yuen, M F., Poynard, T (2004), Viral hepatitis B, Lancet 362, 2089–2093 30 Lok, A S., Zoulim, F., Locarnini, S., Bartholomeusz, A., Ghany, M G., Pawlotsky, J M., Liaw, Y F., Mizokami, M., Kuiken, C., (2007), “Antiviral drug-resistant HBV: standardization of nomenclature and assays and recommendations formanagement”, Hepatology 46, 254–265 31.Munira Hussain, Scott Fung, Evelien Libbrecht, Erwin Sablon, Carmela Cursaro, Pietro Andreone, and Anna S F Lok (2006), “Sensitive Line Probe Assay That Simultaneously Detects Mutations Conveying Resistance to Lamivudine and Adefovir”, Journal of Clinical Microbiology, p 10941097, Vol 44, No 32 Osiowy C, Villeneuve JP, Heathcote EJ, Giles E, Borlang J (2006), “Detection of rtN236T and rtA181V/T mutations associated with resistance to adefovir dipivoxil in samples from patients with chronic hepatitis B virus infection by the INNO-LiPA HBV DR line probe assay (version 2)”, J Clin Microbiol, 44: 1994-1997 33 Pawlotsky, J M., Dusheiko, G., Hatzakis, A., Lau, D., Lau, G., Liang, T J., Locarnini, S., Martin, P., Richman, D D., Zoulim, F., (2008), “Virologic monitoring of hepatitis B virus therapy in clinical trials and practice: recommendations for a standardized approach”, Gastroenterology 134, 405–415 34 Perrillo, R P (2005), “Current treatment of chronic hepatitis B: benefits and limitations Semin”, Liver Dis 25 (Suppl 1), 20–28 35 Rajib Kishore Hazam, Premashis Kar (2007), “HBV Drug resistant: its elevance in clinical practice”, Hepatitis B Annual, Vol 4, Issue 1, p 24-39 36 Stephanos J Hadziyannis, George V Papatheodoridis (2003), “Treatment of HBeAg negative chronic Hepatitis B: Treatment with new drugs (Adefovir and others)”, Journal of Hepatology, Vol 39, Supplement 1, p 172-176 37 Tania M Welzel, Wendell J Miley, Thomas L Parks, James J Goedert, Denise Whitby, and Betty A Ortiz-Conde (2006), “Real-time PCR assay for detection and quantification of Hepatitis B virus genotypes A to G”, Journal of Clinical Microbiology, p 3325–3333 38 Tim Shaw, Angeline Bartholomeusz, Stephen Locarnini (2006), “HBV drug resistance: Mechanisms, detection and interpretation”, Journal of Hepatology, p 593-606 39 Villet, S., Pichoud, C., Billioud, G., Barraud, L., Durantel, S., Trepo, C., Zoulim, F (2008), “Impact of hepatitis B virus rtA181V/T mutants on hepatitis B treatment failure”, Journal of Hepatology 48, p 747–755 40 Westland, C.E., Yang, H., Delaney,W.E.T., Gibbs, C.S., Miller, M.D.,Wulfsohn, M., Fry, J., Brosgart, C.L., Xiong, S (2003), “Week 48 resistance surveillance in two phase clinical studies of adefovir dipivoxil for chronic hepatitis B”, Hepatology 38, p 96-103 41 Yan J., Xie W., Wang L., Wang J.B., Feng X., Song S.J., Liu S.A., Wei H.S (2006), “Application of nest PCR-RFLP in the detection of adefovir dipivoxil resistance-associated mutation in Hepatitis B virus”, Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 14 (7): 714-717 C – Các Webside 42 www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ 43 www.elsevier.com/locate/jviromet 44 www.ncbi.nlm.nih.gov 45 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ 46 http://www1.qiagen.com/Default.aspx PHỤ LỤC Bảng gen sử dụng STT Mã số NCBI Mã số gi Số bp Ghi AP011102 gi|251822209|dbj|AP011102.1| 3215 Genome AP011108 gi|251822239|dbj|AP011108.1| 3215 Genome DQ993686 gi|149211580|gb|DQ993686.1| 3215 Genome DQ993688 gi|149211593|gb|DQ993688.1| 3215 Genome DQ993689 gi|149211598|gb|DQ993689.1| 3215 Genome DQ993691 gi|149211607|gb|DQ993691.1| 3215 Genome DQ993692 gi|149211614|gb|DQ993692.1| 3215 Genome DQ993693 gi|149211621|gb|DQ993693.1| 3215 Genome DQ993697 gi|149211638|gb|DQ993697.1| 3215 Genome 10 DQ993703 gi|149211679|gb|DQ993703.1| 3215 Genome 11 DQ993704 gi|149211686|gb|DQ993704.1| 3215 Genome 12 DQ993705 gi|149211692|gb|DQ993705.1| 3215 Genome 13 DQ993706 gi|149211698|gb|DQ993706.1| 3215 Genome 14 DQ993707 gi|149211705|gb|DQ993707.1| 3215 Genome 15 DQ993708 gi|149211712|gb|DQ993708.1| 3215 Genome 16 DQ993709 gi|149211719|gb|DQ993709.1| 3215 Genome 17 DQ993710 gi|149211726|gb|DQ993710.1| 3215 Genome 18 DQ993711 gi|149211732|gb|DQ993711.1| 3215 Genome 19 FJ621619 gi|224809850|gb|FJ621619.1| 1032 Gen P 20 FJ621620 gi|224809852|gb|FJ621620.1| 1032 Gen P 21 FJ621623 gi|224809858|gb|FJ621623.1| 1032 Gen P STT Mã số NCBI Mã số gi Số bp Ghi 22 FJ621629 gi|224809870|gb|FJ621629.1| 1032 Gen P 23 FJ621659 gi|224809930|gb|FJ621659.1| 1032 Gen P 24 FJ621708 gi|224810028|gb|FJ621708.1| 1032 Gen P 25 FJ621720 gi|224810052|gb|FJ621720.1| 1032 Gen P 26 FJ621760 gi|224810132|gb|FJ621760.1| 1032 Gen P 27 FJ621779 gi|224810170|gb|FJ621779.1| 1032 Gen P 28 FJ621836 gi|224810284|gb|FJ621836.1| 1032 Gen P 29 FJ621866 gi|224810344|gb|FJ621866.1| 1032 Gen P 30 FJ621928 gi|224810468|gb|FJ621928.1| 1032 Gen P 31 FJ621929 gi|224810470|gb|FJ621929.1| 1032 Gen P 32 FJ621979 gi|224810570|gb|FJ621979.1| 1032 Gen P 33 FJ622026 gi|224810664|gb|FJ622026.1| 1032 Gen P 34 FJ622054 gi|224810720|gb|FJ622054.1| 1032 Gen P 35 FJ622069 gi|224810750|gb|FJ622069.1| 1032 Gen P 36 FJ622078 gi|224810768|gb|FJ622078.1| 1032 Gen P 37 FJ622095 gi|224810802|gb|FJ622095.1| 1032 Gen P 38 FJ622097 gi|224810806|gb|FJ622097.1| 1032 Gen P 39 FJ622120 gi|224810852|gb|FJ622120.1| 1032 Gen P 40 FJ622127 gi|224810866|gb|FJ622127.1| 1032 Gen P 41 FJ622158 gi|224810928|gb|FJ622158.1| 1032 Gen P 42 FJ622168 gi|224810948|gb|FJ622168.1| 1032 Gen P 43 FJ622179 gi|224810970|gb|FJ622179.1| 1032 Gen P 44 FJ622183 gi|224810978|gb|FJ622183.1| 1032 Gen P STT Mã số NCBI Mã số gi Số bp Ghi 45 FJ622029 gi|224811030|gb|FJ622029.1| 1032 Gen P 46 FJ622293 gi|224811198|gb|FJ622293.1| 1032 Gen P 47 FJ622321 gi|224811253|gb|FJ622321.1| 1032 Gen P 48 FJ622325 gi|224811261|gb|FJ622325.1| 1032 Gen P 49 FJ622331 gi|224811273|gb|FJ622331.1| 1044 Gen P 50 FJ622340 gi|224811291|gb|FJ622340.1| 1032 Gen P 51 FJ622356 gi|224811323|gb|FJ622356.1| 1032 Gen P 52 FJ622364 gi|224811339|gb|FJ622364.1| 1031 Gen P 53 FJ622367 gi|224811345|gb|FJ622367.1| 1032 Gen P 54 FJ622378 gi|224811367|gb|FJ622378.1| 1032 Gen P 55 FJ622382 gi|224811375|gb|FJ622382.1| 1032 Gen P 56 FJ622391 gi|224811393|gb|FJ622391.1| 1032 Gen P 57 FJ622393 gi|224811397|gb|FJ622393.1| 1032 Gen P 58 FJ622400 gi|224811411|gb|FJ622400.1| 1032 Gen P 59 FJ622405 gi|224811421|gb|FJ622405.1| 1032 Gen P 60 FJ622407 gi|224811425|gb|FJ622407.1| 1032 Gen P 61 FJ622420 gi|224811451|gb|FJ622420.1| 1032 Gen P 62 FJ622423 gi|224811457|gb|FJ622423.1| 1032 Gen P 63 FJ622428 gi|224811467|gb|FJ622428.1| 1032 Gen P 64 FJ622445 gi|224811501|gb|FJ622445.1| 1032 Gen P 65 FJ622481 gi|224811573|gb|FJ622481.1| 1032 Gen P 66 FJ622488 gi|224811587|gb|FJ622488.1| 1032 Gen P 67 FJ622515 gi|224811641|gb|FJ622515.1| 1032 Gen P STT Mã số NCBI Mã số gi Số bp Ghi 68 FJ622643 gi|224811897|gb|FJ622643.1| 1032 Gen P 69 FJ622681 gi|224811973|gb|FJ622681.1| 1032 Gen P 70 FJ622699 gi|224812009|gb|FJ622699.1| 1032 Gen P 71 FJ622710 gi|224812031|gb|FJ622710.1| 1032 Gen P 72 FJ622742 gi|224812095|gb|FJ622742.1| 1032 Gen P 73 FJ622763 gi|224812137|gb|FJ622763.1| 1032 Gen P 74 FJ622764 gi|224812139|gb|FJ622764.1| 1032 Gen P 75 FJ622772 gi|224812155|gb|FJ622772.1| 1032 Gen P 76 FJ622805 gi|224812221|gb|FJ622805.1| 1032 Gen P 77 FJ622809 gi|224812229|gb|FJ622809.1| 1032 Gen P 78 FJ622819 gi|224812249|gb|FJ622819.1| 1032 Gen P 79 FJ622830 gi|224812271|gb|FJ622830.1| 1032 Gen P 80 FJ622840 gi|224812291|gb|FJ622840.1| 1032 Gen P 81 FJ751281 gi|224978596|gb|FJ751281.1| 1032 Gen P 82 FJ751285 gi|224978604|gb|FJ751285.1| 1028 Gen P 83 FJ751286 gi|224978606|gb|FJ751286.1| 1024 Gen P 84 FJ751289 gi|224978612|gb|FJ751289.1| 1032 Gen P 85 FJ751292 gi|224978618|gb|FJ751292.1| 1024 Gen P 86 FJ751315 gi|224978663|gb|FJ751315.1| 1028 Gen P 87 FJ751564 gi|224979145|gb|FJ751564.1| 1028 Gen P 88 FJ751362 gi|224978751|gb|FJ751362.1| 1030 Gen P 89 FJ751364 gi|224978755|gb|FJ751364.1| 1022 Gen P 90 FJ751385 gi|224978797|gb|FJ751385.1| 1032 Gen P STT Mã số NCBI Mã số gi Số bp Ghi 91 FJ751421 gi|224978868|gb|FJ751421.1| 1031 Gen P 92 FJ751423 gi|224978872|gb|FJ751423.1| 1028 Gen P 93 FJ751429 gi|224978883|gb|FJ751429.1| 1024 Gen P 94 FJ751432 gi|224978888|gb|FJ751432.1| 1028 Gen P 95 FJ751434 gi|224978892|gb|FJ751434.1| 1032 Gen P 96 FJ751437 gi|224978898|gb|FJ751437.1| 1032 Gen P 97 FJ751439 gi|224978902|gb|FJ751439.1| 1032 Gen P 98 FJ751440 gi|224978904|gb|FJ751440.1| 1032 Gen P 99 FJ751446 gi|224978915|gb|FJ751446.1| 1024 Gen P 100 FJ751452 gi|224978927|gb|FJ751452.1| 1018 Gen P 101 FJ751460 gi|224978943|gb|FJ751460.1| 1021 Gen P 102 FJ751461 gi|224978945|gb|FJ751461.1| 1021 Gen P 103 FJ751463 gi|224978949|gb|FJ751463.1| 1023 Gen P 104 FJ751470 gi|224978963|gb|FJ751470.1| 1022 Gen P 105 FJ751478 gi|224978979|gb|FJ751478.1| 1022 Gen P 106 FJ751481 gi|224978985|gb|FJ751481.1| 1026 Gen P 107 FJ751492 gi|224979004|gb|FJ751492.1| 1032 Gen P 108 FJ751495 gi|224979009|gb|FJ751495.1| 1027 Gen P 109 FJ751498 gi|224979015|gb|FJ751498.1| 1031 Gen P 110 FJ751500 gi|224979019|gb|FJ751500.1| 1028 Gen P 111 FJ751502 gi|224979023|gb|FJ751502.1| 1032 Gen P 112 FJ751503 gi|224979025|gb|FJ751503.1| 1028 Gen P 113 FJ751508 gi|224979035|gb|FJ751508.1| 1024 Gen P STT Mã số NCBI Mã số gi Số bp Ghi 114 FJ751517 gi|224979053|gb|FJ751517.1| 1023 Gen P 115 FJ751523 gi|224979065|gb|FJ751523.1| 1020 Gen P 116 FJ751547 gi|224979112|gb|FJ751547.1| 1021 Gen P 117 FJ751560 gi|224979137|gb|FJ751560.1| 1024 Gen P 118 FJ751577 gi|224979168|gb|FJ751577.1| 1028 Gen P 119 FJ751579 gi|224979172|gb|FJ751579.1| 1028 Gen P 120 FJ751590 gi|224979193|gb|FJ751590.1| 1028 Gen P 121 FJ751591 gi|224979195|gb|FJ751591.1| 1028 Gen P 122 FJ751599 gi|224979209|gb|FJ751599.1| 1032 Gen P 123 FJ751601 gi|224979212|gb|FJ751601.1| 1032 Gen P 124 FJ751602 gi|224979214|gb|FJ751602.1| 1028 Gen P Kết real-time PCR 35 mẫu bệnh phẩm 2.1 Lô – Chạy 14 mẫu bệnh phẩm PCR Quantification Report PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: Data generated on: 12-Aug-10 09:59 AM 27-Mar-10 at 12:57 PM Optical data file name: Plate Setup file used: Protocol file used: CHAY 14 MAU BENH PHAM 26-03-2010.opd HBV Khang Aderfovir 26-03-2010.pts Taqman.tmo Sample volume: Hot Start? Well factor collection: 25.00 ul No Experimental Plate Comments Protocol Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC Step 2: 66.0ºC Data collection and real-time analysis enabled for 13:30 for 00:15 for 01:00 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 Data Analysis Parameters Calculated threshold using the maximum curvature approach is 46.8 Per-well baseline cycles have been determined automatically Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle Weighted Mean digital filtering has been applied Global filtering is off PCR Quantification Spreadsheet Data for FAM-490 Well Identifier Ct B02 B03 B04 B05 B06 B07 B08 B09 B10 B11 C02 C03 C04 C05 C06 C07 C08 C09 C10 C11 D02 D03 D04 D05 D06 D07 D08 D09 D10 D11 E02 E03 E04 E05 E06 E07 E08 E09 E10 E11 F02 F03 F04 F05 F06 F07 F08 F09 181-1 (+) 181-1 (-) 181-1-622 181-1-625 181-1-651 181-1-721 181-1-728 181-1-731 181-1-763 181-1-818 181-1-819 181-1-827 181-1-846 181-1-852 181-1-853 181-1-854 181-2 (+) 181-2 (-) 181-2-622 181-2-625 181-2-651 181-2-721 181-2-728 181-2-731 181-2-763 181-2-818 181-2-819 181-2-827 181-2-846 181-2-852 181-2-853 181-2-854 236(+) 236(-) 236-622 236-625 236-651 236-721 236-728 236-731 236-763 236-818 236-819 236-827 236-846 236-852 236-853 236-854 29.9 N/A N/A N/A 34.6 N/A 32.6 27.8 N/A 26.7 N/A 33 N/A 26.2 30.5 N/A 26.9 N/A 34.6 N/A N/A N/A 32.6 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 31.6 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A Wells Excluded from Analysis No wells have been excluded from analysis Setpoint 2.2 Lô – Chạy mẫu bệnh phẩm PCR Quantification Report PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: Data generated on: 12-Aug-10 09:59 AM 27-Mar-10 at 12:57 PM Optical data file name: Plate Setup file used: Protocol file used: CHAY MAU BENH PHAM 28-03-2010.opd HBV Khang Aderfovir 28-03-2010.pts Taqman.tmo Sample volume: Hot Start? Well factor collection: 25.00 ul No Experimental Plate Comments Protocol Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC Step 2: 66.0ºC Data collection and real-time analysis enabled for 13:30 for 00:15 for 01:00 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 Data Analysis Parameters Calculated threshold has been replaced by the user selected threshold 63.9 Per-well baseline cycles have been determined automatically Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle Weighted Mean digital filtering has been applied Global filtering is off PCR Quantification Spreadsheet Data for FAM-490 Well Identifier Ct B02 B03 B04 B05 B06 B07 B08 B09 B10 B11 B12 C02 C03 C04 C05 C06 C07 C08 C09 C10 C11 C12 D02 D03 D04 D05 D06 D07 D08 D09 D10 D11 D12 181-1 (+) 181-1 (-) 181-1-021 181-1-091 181-1-092 181-1-432 181-1-433 181-1-441 181-1-522 181-1-527 181-1-528 181-2 (+) 181-2 (-) 181-2-021 181-2-091 181-2-092 181-2-432 181-2-433 181-2-441 181-2-522 181-2-527 181-2-528 236 (+) 236 (-) 236-021 236-091 236-092 236-432 236-433 236-441 236-522 236-527 236-528 28.5 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 33.8 29.4 N/A N/A N/A N/A N/A 28.8 N/A N/A 29.9 N/A 29.0 N/A N/A 30.3 28.8 N/A N/A N/A N/A N/A N/A Setpoint Wells Excluded from Analysis No wells have been excluded from analysis Modified Well Contents No wells have been modifed 2.3 Lô – Chạy 12 mẫu bệnh phẩm PCR Quantification Report PCR Base Line Subtracted Curve Fit Data Current Date: Data generated on: 12-Aug-10 09:59 AM 27-Mar-10 at 12:57 PM Optical data file name: CHAY 12 MAU BENH PHAM 02-04-2010.opd Plate Setup file used: Protocol file used: HBV Khang Aderfovir 02-04-2010.pts Taqman.tmo Sample volume: Hot Start? Well factor collection: 25.00 ul No Experimental Plate Comments Protocol Cycle 1: ( 1X) Step 1: 95.0ºC Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.0ºC Step 2: 55.0ºC Data collection and real-time analysis enabled Step 3: 72.0ºC for 03:30 for 00:15 for 01:00 for 00:20 PCR Amp/Cycle Graph for FAM-490 Data Analysis Parameters Calculated threshold has been replaced by the user selected threshold 75.8 Per-well baseline cycles have been determined automatically Data analysis window is set at 95.00% of a cycle, centered at end of the cycle Weighted Mean digital filtering has been applied Global filtering is off PCR Quantification Spreadsheet Data for FAM-490 Well Identifier Ct B02 B03 B04 B05 B06 B07 B08 B09 181-1 (+) 181-1 (-) 181-1-933 181-1-977 181-1-978 181-1-979 181-1-981 181-1-982 25.0 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A Setpoint B10 C02 C03 C04 C05 C06 D02 D03 D04 D05 D06 D07 D08 D09 D10 E02 E03 E04 E05 E06 F02 F03 F04 F05 F06 F07 F08 F09 F10 G02 G03 G04 G05 G06 181-1-983 181-1-984 181-1-1010 181-1-1012 181-1-1013 181-1-1016 181-2 (+) 181-2 (-) 181-2-933 181-2-977 181-2-978 181-2-979 181-2-981 181-2-982 181-2-983 181-2-984 181-2-1010 181-2-1012 181-2-1013 181-2-1016 236 (+) 236 (-) 236-933 236-977 236-978 236-979 236-981 236-982 236-983 236-984 236-1010 236-1012 236-1013 236-1016 27,6 N/A N/A N/A 29.5 29.1 26.0 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 27.8 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A Wells Excluded from Analysis No wells have been excluded from analysis Modified Well Contents No wells have been modifed