Xây dựng quy trình phát hiện đột biến kháng lamivudine bằng kỹ thuật real time pcr sử dụng mgb taqman probe

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ĐÀO THỤY MỸ CHÂU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR SỬ DỤNG MGB TAQMAN PROBE Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD: PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Dương TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2011 i LUẬN VĂN THẠC SĨ LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Dương Trong suốt thời gian vừa qua, Cơ tận tình giúp đỡ, chia sẻ, truyền đạt cho em nhiều kiến thức bổ ích kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành luận văn thạc sĩ Em xin gửi lòng biết ơn chân thành đến TS Nguyễn Thúy Hương Với vai trò giáo viên chủ nhiệm, suốt thời gian theo học trường, cô giúp đỡ, dạy bảo cho chúng em kiến thức bổ ích, thú vị Cơ ln chỗ dựa, động viên chúng em lúc khó khăn Em xin gửi lời cảm ơn đến anh Nguyễn Thành Khơi tận tình giúp đỡ em thời gian qua Em cảm ơn người công ty Khoa Thương tạo điều kiện cho em học tập làm việc thật tốt Em xin chân thành cảm ơn thầy cô trường Đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh, đặc biệt thầy Bộ môn Công nghệ Sinh học dạy bảo, truyền đạt kinh nghiệm, tạo điều kiện thuận lợi để em có kết ngày hơm Xin cảm ơn bố mẹ, gia đình người thương yêu bên cạnh, chia sẻ, động viên tạo điều kiện cho chúng em suốt thời gian theo học thực luận văn Cuối cùng, xin gửi đến tất anh chị, bạn bè – người bạn người thân đại gia đình Cơng nghệ Sinh học – lời cảm ơn ln sát cánh, giúp đỡ hỗ trợ em Thành phố Hồ Chí Minh, 01/2011 Đào Thụy Mỹ Châu     ĐÀO THỤY MỸ CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ ii ABSTRACT Lamivudine is the first nucleotide analoge that was demonstrated to have a potent effect on HBV Unfortunately, long-term lamivudine therapy promotes the selection of HBV mutants with altered DNA polymerase resistant to therapy A method base on real-time PCR with MGB Taqman probe is described for identifying lamivudine resistance mutations in HBV The detection limit for YMDD, YVDD and YIDD was 5.103 copies/ml, whereas the sensitivity was 10% within a mixed virus population with 104 copies of HBV virus/ml The real-time PCR was compared with RFLP and direct Sanger in 20 clinical patients samples, the result of the real-time PCR was correlate with the nucleotide sequence and RFLP The assay has the advantage of detecting a mixture of quasispecies with higher sensitive than sequencing and less time consuming compared to RFLP Thus, MGB real-time PCR assay should be useful for detecting lamivudine resistance variants during lamivudine therapy in clinical setting ĐÀO THỤY MỸ CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ iii TÓM TẮT Lamivudine chất tương đồng nucleotide gây ảnh hưởng lên HBV Tuy nhiên, việc sử dụng lamivudine thời gian dài làm xuất đột biến vùng DNA polymerase dẫn đến tình trạng kháng thuốc Phương pháp real-time PCR sử dụng mẫu dò MGB Taqman phát triển để phát chủng HBV đột biến kháng lamivudine Ngưỡng phát phản ứng 5.103 sao/ml, độ chọn lọc phản ứng 10% đột biến quần thể virus hoang dại đột biến với nồng độ tổng virus 104 sao/ml Nghiên cứu thực 20 mẫu bệnh phẩm, so sánh với phương pháp RFLP giải trình tự Kết thu nhận phương pháp realtime PCR tương đồng với kết RFLP giải trình tự Phương pháp real-time PCR thuận lợi phương pháp giải trình tự việc phát hỗn hợp virus có thời gian thực ngắn phương pháp RFLP Do đó, phương pháp real-time sử dụng mẫu dị MGB hữu ích việc phát chủng đột biến kháng lamivudine trình điều trị liệu pháp lamivudine                     ĐÀO THỤY MỸ CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ iv MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Virus viêm gan B (hepatitis B) 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Cấu tạo HBV 2.1.3 Vòng đời HBV 10 2.2 Lamivudine 12 2.2.1 Lamivudine 12 2.2.2 Đột biến kháng lamivudine 13 2.3 Kỹ thuật real-time PCR 14 2.3.1 Chất huỳnh quang không đặc hiệu 15 2.3.2 Mẫu dị có gắn chất huỳnh quang 16 2.3.3 Real-time PCR sử dụng mẫu dò MGB Taqman 16 2.4 Tình hình nghiên cứu 19 2.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 19 2.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 24 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 27 3.2 Hóa chất, dụng cụ trang thiết bị thí nghiệm 27 3.2.1 Hóa chất dùng để tách chiết DNA theo quy trình tách chiết tủa phenol – choloroform 27 3.2.2 Hoá chất cho phản ứng real-time PCR 27 3.2.3 Phát HBV kháng lamivudine dựa kỹ thuật RFLP 27 3.2.4 Hóa chất dùng cho điện di 28 3.2.5 Thiết bị dụng cụ 28 ĐÀO THỤY MỸ CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ v 3.3 Phương pháp nghiên cứu 29 3.3.1 Thu nhận mẫu 29 3.3.2 Tách chiết DNA từ bệnh phẩm 29 3.3.2.1 Nguyên tắc 29 3.3.2.2 Cách tiến hành 29 3.3.3 Real-time PCR sử dụng mẫu dò MGB TaqMan 30 3.3.3.1 Kiểm tra mồi mẫu dò 30 3.3.3.2 Xây dựng mẫu DNA tổng hợp (amplicon) dùng làm chứng dương 31 3.3.3.3 Đánh giá hoạt động mồi mẫu dò 31 3.3.3.4 Tối ưu hóa phản ứng real-time PCR 32 3.3.3.5 Xác định ngưỡng phát độ chọn lọc phản ứng real-time PCR đa mẫu dò 36 3.3.4 Kỹ thuật nested PCR – RFLP 38 3.3.4.1 Phản ứng nested – PCR 38 3.3.4.2 Phản ứng enzyme cắt giới hạn 38 3.3.4.3 Điện di gel agarose 2% 38 3.3.5 Kiểm tra phương pháp giải trình tự trực tiếp 39 PHẦN KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40 4.1 Kiểm tra mồi mẫu dò 41 4.2 Đánh giá hoạt động mồi mẫu dò amplicon 42 4.3 Tối ưu hóa phản ứng real-time PCR 43 4.3.1 Tối ưu phản ứng chứa mẫu dò đơn lẻ 44 4.3.1.1 Khảo sát gradient nhiệt độ với loại phản ứng chứa mẫu dò đơn lẻ (mẫu dò M, mẫu dò V, mẫu dò I) với amplicon tương ứng 44 ĐÀO THỤY MỸ CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ vi 4.3.1.2 Khảo sát nồng độ mẫu dò M phản ứng M 47 4.3.2 Phản ứng chứa hỗn hợp mẫu dò: phản ứng MV (chứa mẫu dò M mẫu dò V) phản ứng IV (chứa mẫu dò I mẫu dò V) với amplicon tương ứng 51 4.4 Xác định ngưỡng phát phản ứng real-time PCR đa mẫu dò 54 4.5 Xác định độ chọn lọc phản ứng đa mẫu dò 55 4.5.1 Phát đột biến M204V quần thể virus hoang dại đột biến M204V 55 4.5.2 Phát đột biến M204I hỗn hợp virus hoang dại đột biến M204I 58 4.5.3 Phát đột biến M204I M204V hỗn hợp virus hoang dại đột biến M204V, M204I 59 4.6 Thực quy trình real-time PCR sử dụng mẫu dò MGB 20 mẫu huyết từ bệnh nhân viêm gan B 61 4.7 Thực quy trình nested PCR – RFLP 20 mẫu huyết 63 4.8 Kiểm tra 20 mẫu bệnh phẩm phương pháp giải trình tự 64 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 68 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHẦN PHỤ LỤC 77 ĐÀO THỤY MỸ CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ vii DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 2.1: Cấu trúc bên ngồi HBV Hình 2.2: Cấu trúc gen HBV Hình 2.3 Quá trình xâm nhiễm HBV 11 Hình 2.4 Chu trình HBV 12 Hình 2.5: Cấu trúc hóa học lamivudine 13 Hình 2.6: Cấu trúc MGB 17 Hình 2.7: Sự gắn mẫu dị MGB Taqman lên sợi DNA 17 Hình 3.1 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát nhiệt độ lai phản ứng đơn mẫu dò 33 Hình 3.2 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát nồng độ mẫu dò M phản ứng M 34 Hình 3.3 Sơ đồ thí nghiệm phản ứng đa mẫu dị 35 Hình 4.1 Vị trí bắt cặp mồi mẫu dị DNA HBV 41 Hình 4.2 Kết đánh giá hoạt động mồi mẫu dò amplicon 43 Hình 4.3 Kết độ nhạy thí nghiệm khảo sát gradient nhiệt độ phản ứng đơn mẫu dò 45 Hình 4.4 Kết khơng đặc hiệu thí nghiệm khảo sát gradient nhiệt độ phản ứng đơn mẫu dò 46 Hình 4.5 Kết độ nhạy thí nghiệm khảo sát nồng độ mẫu dò M phản ứng M với amplicon M nồng độ 5.103 sao/ml dãy nhiệt độ 49 Hình 4.6 Kết khơng đặc hiệu thí nghiệm khảo sát nồng độ mẫu dị M phản ứng M với loại amplicon 50 Hình 4.7 Kết thí nghiệm phản ứng chứa hỗn hợp mẫu dị 53 Hình 4.8 Kết xác định ngưỡng phát phản ứng real-time PCR 55 ĐÀO THỤY MỸ CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ viii MỤC LỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Mối liên quan kiểu huyết (serotype) kiểu gen (genotype) Bảng 2.2: Bản đồ phân bố kiểu gen HBV Bảng 3.1 Trình tự mồi mẫu dị 30 Bảng 3.2 Đột biến M204V (hoặc M204I) chiếm 5% quần thể hỗn hợp hoang dại đột biến M204V (hoặc M204I) 36 Bảng 3.3 Đột biến M204V (hoặc M204I) chiếm 10% quần thể hỗn hợp hoang dại đột biến M204V (hoặc M204I) 37 Bảng 3.4 Đột biến M204V M204I chiếm đồng thời với tỉ lệ 5% quần thể hỗn hợp hoang dại đột biến M204V M204I 37 Bảng 3.5 Đột biến M204V M204I chiếm đồng thời với tỉ lệ 10% quần thể hỗn hợp hoang dại đột biến M204V M204I 37 Bảng 4.1 Đặc tính mồi mẫu dò 41 Bảng 4.2 Kết đánh giá hoạt động mồi mẫu dò amplicon 42 Bảng 4.3 Kết khảo sát gradient nhiệt độ với loại phản ứng chứa mẫu dò đơn lẻ với amplicon tương ứng 44 Bảng 4.4 Kết khảo sát nồng độ mẫu dò M phản ứng M 48 Bảng 4.5 Kết phản ứng đơn mẫu dò phản ứng đa mẫu dò nhiệt độ 62,2°C 52 Bảng 4.6 Kết xác định ngưỡng phát phản ứng đa mẫu dò 54 Bảng 4.7 Kết xác định độ chọn lọc phản ứng đột biến M204V chiếm tỷ lệ 5% quần thể virus hoang dại đột biến M204V 56 Bảng 4.8 Kết xác định độ chọn lọc phản ứng đột biến M204V chiếm tỷ lệ 10% quần thể virus hoang dại đột biến M204V 57 Bảng 4.9 Kết xác định độ chọn lọc phản ứng đột biến M204I ĐÀO THỤY MỸ CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ ix chiếm tỷ lệ 5% quần thể virus hoang dại đột biến M204I 58 Bảng 4.10 Kết xác định độ chọn lọc phản ứng đột biến M204I chiếm tỷ lệ 10% quần thể virus hoang dại đột biến M204I 59 Bảng 4.11 Kết xác định độ chọn lọc phản ứng đột biến M204V M204I chiếm tỷ lệ 5% quần thể virus hoang dại đột biến M204V, M204I 60 Bảng 4.12 Kết xác định độ chọn lọc phản ứng đột biến M204V M204I chiếm tỷ lệ 10% quần thể virus hoang dại đột biến M204V, M204I 61 Bảng 4.13 Kết thực quy trình real-time PCR sử dụng mẫu dị MGB 20 mẫu huyết 62 Bảng 4.14 Kết thực quy trình RFLP 20 mẫu huyết 64 Bảng 4.15 Kết giải trình tự 20 mẫu huyết so sánh với kết real-time PCR RFLP 64 ĐÀO THỤY MỸ CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ 76 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [51] Nguyễn Chí Vinh, 2008 Sử dụng kỹ thuật Nested PCR-RFLP để xác định đột biến kháng Lamivudine đột biến Basal Core Promoter virus viêm gan B Vườn Ươm Sáng Tạo KH&CN [52] Nguyễn Thành Khôi, Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2009 Xây dựng quy trình phát đột biến điểm có độ nhạy độ đặc hiệu cao phương pháp Real-time AlleleSpecific PCR Hội nghị Công nghệ Sinh học tồn quốc – khu vực phía Nam [53] Phạm Hùng Vân, 2009 PCR real-time PCR, vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học, TP.HCM [54] Phạm T Lệ Hoa, Nguyễn Hữu Chí, Cao Ngọc Nga, Nguyễn T Cẩm Hường, Phạm Hùng Vân, 2008 Đặc tính kháng lamivudine bệnh nhân viêm gan B mạn không đáp ứng với điều trị Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Y Học TP Hồ Chí Minh, 12 (1), 1-7 ĐÀO THỤY MỸ CHÂU 77 LUẬN VĂN THẠC SĨ Phần 7: Phụ lục 7.1 Bảng giá trị khảo sát gradient nhiệt độ phản ứng đơn mẫu dò (mẫu dò M, mẫu dò V, mẫu dò I) Nồng độ amplicon (bản sao/ml) Nhiệt độ (°C) Mẫu dò M Giá trị Ct 64,1 62,2 59,8 57,8 55,8 Mẫu dò I amp amp amp amp amp amp amp amp amp M V I M V I M V I 5.10 65,3 Mẫu dò V 5.10 5.10 5.10 5.10 5.10 5.10 5.10 5.109 Lần - - - - 38,00 - - - 38,43 Lần - - - - 37,92 - - - 38,11 Trung bình - - - - 37,96 - - - 38,27 Lần 37,24 - - - 36,72 - - - 37,11 Lần 36,78 - - - 36,62 - - - 37,67 Trung bình 37,01 - - - 36,67 - - - 37,39 Lần 35,48 - - - 35,47 - - - 35,54 Lần 35,98 - - - 34,78 - - - 36,10 Trung bình 35,73 - - - 35,10 - - - 35,82 Lần 34,65 18,49 - - 34,55 - 19,64 - 35,19 Lần 34,35 18,31 - - 34,41 - 18,94 - 34,89 Trung bình 34,50 18,40 - - 34,48 - 19,29 - 35,04 Lần 33,39 15,66 - - 33,80 - 16,43 - 34,28 Lần 33,67 15,82 - - 34,56 - 16,77 - 33,82 Trung bình 33,53 15,74 - - 34,18 - 16,60 - 34,05 Lần 33,15 13,89 - - 33,45 - 14,32 - 33,05 Lần 33,33 14,21 - - 32,89 - 13,78 - 33,21 Trung bình 33,24 14,05 - - 33,17 - 14,05 - 33,13 ĐÀO THỤY MỸ CHÂU 78 LUẬN VĂN THẠC SĨ 7.2 Bảng giá trị khảo sát nồng độ mẫu dò M phản ứng M Nồng độ amplicon (bản sao/ml) Nhiệt Giá trị độ Ct (°C) Mẫu dò M 200 nM amp amp amp amp amp amp amp amp amp amp amp M V I M V I M V I M V I 5.10 5.10 5.10 5.10 5.10 5.10 5.10 5.10 5.10 5.10 5.109 - - 37,00 - - 37,56 - - 38,75 - - Lần 35,82 - - 37,20 - - 36,92 - - 38,43 - - 35,68 - - 37,10 - - 37,24 - - 38,59 - - Lần 34,87 18,51 - 34,33 22,73 - 36,06 - - 36,39 - - Lần 34,29 18,17 - 34,67 22,65 - 35,88 - 36,07 - - 34,58 18,34 - 34,50 22,69 - 35,97 - - 36,23 - - Lần 33,87 15,34 - 34,37 17,57 - 34,13 18,09 - 36,17 18,43 - Lần 33,97 16,04 - 34,71 17,45 - 34,91 17,45 - 36,13 17,61 - 33,92 15,69 - 34,54 17,51 - 34,52 17,77 - 36,15 18,02 - Lần 33,80 14,78 - 33,46 14,61 - 34,27 14,88 - 35,12 15,43 - Lần 33,66 14,54 - 33,24 14,39 - 34,35 15,16 - 34,98 15,55 - 33,73 14,66 - 33,85 14,50 - 34,31 34,72 - 35,05 15,49 - Trung bình Trung bình 55,8 35,54 bình 57,8 Mẫu dị M 50 nM Lần Trung 59,8 Mẫu dò M 100 nM amp 5.10 62,2 Mẫu dị M 150 nM Trung bình ĐÀO THỤY MỸ CHÂU 79 LUẬN VĂN THẠC SĨ 7.3 Bảng giá trị khảo sát phản ứng đa mẫu dò (phản ứng MV phản ứng IV) nhiệt độ 62,2°C Giá trị Ct Nồng độ amplicon (bản sao/ml) Lần Lần Trung bình 35,46 35,94 35,70 Phản ứng V amp V (5.10 ) 35,45 35,75 35,10 Phản ứng I amp I (5.103) 35,59 36,11 35,85 amp M (5.103) 36,31 35,97 36,14 amp V (5.103) 35,51 36,01 35,76 amp M (5.109) 15,77 15,89 15,83 amp V (5.109) 15,42 15,36 15,39 Phản ứng M Phản ứng MV amp M (5.10 ) amp I (5.10 ) - - - 35,78 36,10 35,94 35,64 35,74 35,69 amp M (5.10 ) amp V (5.10 ) Phản ứng IV ĐÀO THỤY MỸ CHÂU amp M (5.109) - amp V (5.109) 15,84 15,90 15,87 amp I (5.109) 15,52 15,20 15,36 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ 7.4 Bảng giá trị xác định ngưỡng phát độ đặc hiệu phản ứng đa mẫu dò Giá trị Ct Nồng độ amplicon Phản ứng MV (bản sao/ml) amp M amp V Lần Lần 5.101 - - 5.102 38,80 Trung Trung Lần Lần - - - - 38,72 38,76 - - - 35,47 35,59 35,53 - - - 30,76 31,08 30,92 - - - 5.10 23,99 23,61 23,80 - - - 5.109 15,39 15,25 15,32 - - - 5.101 - - - - - - 5.102 38,61 39,06 38,83 38,65 38,75 38,70 5.103 35,13 35,37 35,25 35,19 35,21 35,20 5.105 28,43 28,79 28,61 28,77 28,89 28,83 21,55 21,21 21,38 21,22 21,12 21,17 5.10 14,28 14,70 14,49 14,69 14,49 14,59 5.101 - - - - - - 5.102 - - - 38,94 38,64 38,79 5.103 - - - 35,30 35,26 35,28 5.105 - - - 28,67 28,93 28,80 5.107 - - - 22,24 22,00 22,12 - - - 14,68 15,04 14,86 5.10 5.10 5.10 amp I Phản ứng IV 5.10 ĐÀO THỤY MỸ CHÂU bình bình 81 LUẬN VĂN THẠC SĨ 7.5 Bảng giá trị Phát tỷ lệ 5% đột biến M204V quần thể hoang dại đột biến M204V Tổng nồng độ amplicon (bản sao/ml) Mẫu dò V Lần Phản ứng MV Mẫu dò V Phản ứng MV Giá trị Mẫu dò V Ct Phản ứng MV Lần Mẫu dò M Phản ứng MV Mẫu dị V Trung Phản ứng MV bình Mẫu dò M Phản ứng MV 103 - 104 39,78 105 106 107 108 109 37,16 33,04 28,76 25,34 22,48 38,03 34,79 32,05 28,70 25,20 22,49 19,47 - 39,84 36,67 33,40 28,89 25,51 22,60 38,35 35,09 32,14 29,05 24,97 22,81 19,58 - 39,81 36,92 33,22 28,83 25,43 22,54 38,19 34,94 32,10 28,88 25,05 22,65 19,53 7.6 Bảng giá trị Phát tỷ lệ 10% đột biến M204V quần thể hoang dại đột biến M204V Tổng nồng độ amplicon (bản sao/ml) Mẫu dò V Lần Phản ứng MV Mẫu dò V Phản ứng MV Giá trị Mẫu dò V Ct Phản ứng MV Lần Mẫu dò M Phản ứng MV Mẫu dị V Trung Phản ứng MV bình Mẫu dò M Phản ứng MV ĐÀO THỤY MỸ CHÂU 103 104 105 106 107 108 109 - 39,67 36,18 33,46 28,98 25,87 22,77 38,35 35,20 32,33 28,57 24,98 22,57 18,74 - 39,91 36,22 33,39 28,76 25,15 22,34 38,48 35,18 32,60 28,65 25,74 22,77 18,26 - 39,79 36,20 33,43 28,87 25,01 22,56 38,37 35,19 32,60 28,61 25,36 22,67 19,50 82 LUẬN VĂN THẠC SĨ 7.7 Bảng giá trị Phát tỷ lệ 5% đột biến M204I quần thể hoang dại đột biến M204I Tổng nồng độ amplicon (bản sao/ml) Mẫu dò I Phản ứng IV Lần Mẫu dò V Phản ứng MV Giá trị Mẫu dò I Ct Phản ứng IV Lần Mẫu dò M Phản ứng MV Mẫu dị I Trung Phản ứng IV bình Mẫu dò M Phản ứng MV 103 104 105 106 107 108 109 - 39,42 35,84 32,78 28,36 25,54 22,87 38,89 35,71 32,39 28,58 25,37 21,85 19,76 - 39,02 35,60 32,83 29,04 25,18 22,05 39,19 35,70 32,19 28,83 25,32 22,20 19,03 - 39,22 35,72 32,81 28,70 25,36 22,46 39,04 35,71 32,29 28,71 25,35 22,03 19,40 7.8 Bảng giá trị Phát tỷ lệ 10% đột biến M204I quần thể hoang dại đột biến M204I Tổng nồng độ amplicon (bản sao/ml) Mẫu dò I Phản ứng IV Lần Mẫu dò V Phản ứng MV Giá trị Mẫu dò I Ct Phản ứng IV Lần Mẫu dò M Phản ứng MV Mẫu dò I Trung Phản ứng IV bình Mẫu dị M Phản ứng MV ĐÀO THỤY MỸ CHÂU 103 104 105 106 107 108 109 - 39,13 35,07 32,52 28,49 25,25 22,88 38,80 35,63 32,51 29,20 25,14 22,69 19,01 - 39,07 35,52 32,30 28,99 25,48 22,37 38,76 35,21 31,72 28,51 24,78 22,91 19,33 - 39,10 35,30 32,41 28,74 25,37 22,63 38,78 35,42 32,12 28,86 24,96 22,80 19,17 83 LUẬN VĂN THẠC SĨ 7.9 Bảng giá trị Phát tỷ lệ 5% đột biến M204I M204V quần thể hoang dại đột biến M204I/M204V Tổng nồng độ amplicon (bản sao/ml) Mẫu dò V Phản ứng MV Mẫu dò M Lần Phản ứng MV Mẫu dò I Phản ứng IV Mẫu dò V Phản ứng IV Mẫu dò V Phản ứng MV Mẫu dò M Giá trị Ct Lần Phản ứng MV Mẫu dò I Phản ứng IV Mẫu dò V Phản ứng IV Mẫu dị V Phản ứng MV Trung bình Mẫu dị M Phản ứng MV Mẫu dò I Phản ứng IV Mẫu dò V Phản ứng IV ĐÀO THỤY MỸ CHÂU 103 104 105 106 107 108 109 - 39,24 36,98 35,14 28,75 25,58 22,10 38,87 35,63 32,35 28,45 25,71 22,97 19,13 - 39,63 36,07 35,03 28,75 25,09 22,58 - 39,44 36,79 35,28 28,80 25,76 22,31 - 39,78 36,63 35,04 28,48 25,80 22,18 38,59 35,72 32,16 28,28 25,10 22,83 19,89 - 39,01 36,67 35,11 28,32 25,02 22,42 - 39,12 36,63 35,24 28,01 25,85 22,67 - 39,51 36,78 33,09 28,62 25,69 22,14 38,73 35,68 32,26 29,37 26,41 22,91 19,51 - 39,32 36,37 32,07 28,56 25,06 22,50 - 39,28 36,71 32,26 28,41 25,81 22,49 84 LUẬN VĂN THẠC SĨ 7.10 Bảng giá trị phát tỷ lệ 10% đột biến M204I M204V quần thể hoang dại đột biến M204I/M204V Tổng nồng độ amplicon (bản sao/ml) Mẫu dò V Phản ứng MV Mẫu dò M Lần Phản ứng MV Mẫu dò I Phản ứng IV Mẫu dò V Phản ứng IV Mẫu dò V Phản ứng MV Mẫu dò M Giá trị Ct Lần Phản ứng MV Mẫu dò I Phản ứng IV Mẫu dò V Phản ứng IV Mẫu dị V Phản ứng MV Trung bình Mẫu dị M Phản ứng MV Mẫu dò I Phản ứng IV Mẫu dò V Phản ứng IV ĐÀO THỤY MỸ CHÂU 103 104 105 106 107 108 109 - 39,33 35,42 32,13 28,42 24,58 21,48 38,38 35,72 32,15 29,31 25,42 22,58 19,25 - 39,36 34,80 31,74 28,30 24,14 21,08 - 39,80 35,23 31,82 28,65 24,10 21,69 - 39,41 35,49 32,94 27,71 23,97 20,60 38,20 35,87 32,93 28,61 25,12 22,26 18,63 - 39,29 34,74 31,94 27,68 24,03 21,24 - 39,42 35,45 32,09 28,89 24,42 21,56 - 39,37 35,46 32,52 28,07 24,26 21,04 38,29 35,80 32,54 28,96 25,27 22,42 18,94 - 39,33 34,77 31,84 27,99 24,09 21,16 - 39,61 35,34 31,99 28,77 24,26 21,63 LUẬN VĂN THẠC SĨ 85 7.11 Phụ lục kết áp dụng quy trình real-time PCR 20 mẫu bệnh phẩm Mẫu Mẫu Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu dò V phản ứng MV Mẫu dò V phản ứng IV Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu dò V phản ứng IV Mẫu Mẫu Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu dò V phản ứng MV Mẫu dò I phản ứng IV Mẫu Mẫu Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu Mẫu Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu dò I phản ứng IV Mẫu Mẫu dò V phản ứng MV Mẫu dò I phản ứng IV ĐÀO THỤY MỸ CHÂU Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu dò V phản ứng MV Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu 10 Mẫu dò I phản ứng IV LUẬN VĂN THẠC SĨ Mẫu 11 86 Mẫu 12 Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu 13 Mẫu 14 Mẫu dò I phản ứng IV Mẫu 15 Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu 18 Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu 19 Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu 16 Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu 17 Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu 20 Mẫu dò V phản ứng IV Mẫu dò M phản ứng MV Mẫu dò V phản ứng MV ĐÀO THỤY MỸ CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ 87 7.12 Phụ lục kết RFLP 20 mẫu bệnh phẩm Hình 7.1 Kết cắt sản phẩm PCR với NdeI Hình 7.2 Kết cắt sản phẩm PCR với NlaIII ĐÀO THỤY MỸ CHÂU 88 LUẬN VĂN THẠC SĨ 7.13 Kết giải trình tự 20 mẫu bệnh phẩm G Mẫu – hoang dại Mẫu – không xác định G G A Mẫu – hoang dại Mẫu – không xác định G G Mẫu – M204V Mẫu – hoang dại + M204I T G ĐÀO THỤY MỸ CHÂU Mẫu – M204I G Mẫu – hoang dại 89 LUẬN VĂN THẠC SĨ Mẫu – hoang dại + M204V/M204I G A G Mẫu 10 – hoang dại + M204I G C G T Mẫu 11 – hoang dại G G G Mẫu 12 – hoang dại G Mẫu 13 – không xác định Mẫu 14 – hoang dại G G Mẫu 15 – hoang dại G ĐÀO THỤY MỸ CHÂU Mẫu 16 – hoang dại G 90 LUẬN VĂN THẠC SĨ Mẫu 17 – không xác định Mẫu 18 – không xác định Mẫu 19 – hoang dại G A ĐÀO THỤY MỸ CHÂU Mẫu 20 – hoang dại G ... thực đề tài ? ?Xây dựng quy trình phát đột biến kháng lamivudine sử dụng kỹ thuật real- time PCR dùng MGB TaqMan probe? ?? ĐÀO THỤY MỸ CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ Nội dung đề tài bao gồm: - Xây dựng phản ứng... real- time PCR sử dụng mẫu dò MGB Taqman phát triển để phát chủng HBV đột biến kháng lamivudine Ngưỡng phát phản ứng 5.103 sao/ml, độ chọn lọc phản ứng 10% đột biến quần thể virus hoang dại đột biến. .. dụng quy trình huyết bệnh nhân; xây dựng quy trình phát đột biến kháng basal core promoter rt180 – rt204 thử nghiệm ứng dụng quy trình huyết bệnh nhân Kết nghiên cứu cải tiến thành cơng quy trình