bước đầu thiết lập quy trình phát hện đột biến gen gây hội chứng arc (arythrogryposis renal dysfunction cholestasis)

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT TOÀN VĂN ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG BƯ C Đ THIẾT P Y TR NH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN G N G Y HỘI CH NG ARC (ARYTHROGRYPOSIS, RENAL DYSFUNCTION, CHOLESTASIS) Mã số: Chủ nhiệm đề tài: CN DƯ NG BÍCH TR M T H Ch Minh th n 05 năm 2018 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN C STT Tru ĐỀ TÀI M C C 1.1 1.1.1 1.1.2 1.2 Gen VPS33B VIPAR 1.3 kỹ ậ s 1.3.1 Kỹ ậ P 1.3.2 Kỹ ậ ả ì ự ự Ậ – P ƯƠ P ÁP 2.1 ố ợ 2.2 ị– ụ ụ 2.3 ó ấ 2.3.1 Hóa ấ ế DN b e ( DN ) m 2.3.2 Hóa ấ P 2.3.3 Hóa ấ dù ệ d e a a se 2.3.4 Hóa ấ dù p ả sạ sả p m P 2.3.5 Hóa ấ dù p ả P e seq e 2.3.6 Hóa ấ dù q ì sả p m P e seq e 2.4 P 2.4.1 T ậ ậ ệ 2.4.2 T ế DN mẫ m 2.4.3 T ế kế mồ p ả P 2.4.4 P ả P 13 2.4.5 Đ ệ d 14 2.4.6 T sạ sả p m P 14 2.4.7 Cycle Sequencing PCR 14 2.4.8 Tủa sả p m e seq e P 15 2.4.9 Giải trình tự phân tích kết 15 – Ậ 17 3.1 s 17 3.2 số 17 3.3 k 18 3.3.1 Kế q ả k m a s ế mồ 18 3.3.2 Kế q ả k m a ệ mồ b P me -Blast 20 3.4 P 21 3.5 VPS33B VIPAR 23 Ậ – 25 4.1 ậ 25 4.2 ị 25 M O 26 DANH SÁCH B NG BI s 2.1 ụ P gen VPS33B s 2.2 ụ P gen VIPAR 11 2.3: ầ ó ấ P P 2.4: 14 14 2.5: ầ ấ sạ 3.1: sạ số 3.2: k số ậ s ợ ẩ P 14 vi 17 P VPS33B 18 3.3: k số P VIPAR 18 DANH SÁCH H NH NH ợ 1.1: Vai tr 1.2: ắ P - P P 1.3: 2.1: Thang DNA 1kb plus (Thermo Scientific) 2.2: ợ k P gen VPS33B 11 2.3: ợ k P gen VIPAR 13 3.1: P - P 7; VPS33B 21 3.2: P - P VIPAR 21 3.3: P VPS33B 22 3.4: P VIPAR 22 3.5: -1 24 3.6: VPS33B -1 24 DANH M C CHỮ VIẾT T T ARC Arythrogryposis, Renal dysfunction, Cholestasis ddNTP dideoxynucleotide DNA Deoxyribonucleic acid PCR Polymerase chain reaction s SNP VIPAR VPS33B ( VPS33B interacting protein, apical-basolateral polarity regulator, spe-39 homolog Vacuolar protein sorting-associated protein 33B ) THÔNG TIN KẾT NGHIÊN C ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Thơng tin chung: ầ - ậ ARC (Arythrogryposis, Renal dysfunction, Cholestasis) - Mã số - tài: 0989850374 Email: bichtram1989tn@gmail.com ị - ( , ) P 12/05/2017 – 12/05/2018 Mục tiêu: ậ ụ Nội dun ch nh: k - P P P ậ P k P , sạ s ẩ P P -P k Kết ch nh đạt (k  (số , ,k - ã , ợ , / / ụ , ): , , , ă …) Không  ố ố ( , ấ ) Không  /  P k s s , ( s ữ ữ ã ă ; k s ( ã số, ữ ; / s ấ , ) Không Hiệu kinh tế - xã hội đề tài man lại: , ă ấ ố ) Không ă ố  ợ ,  P ị ị ỉ ụ k ợ s ẩ s ẩ , ( ị ị ậ ): Không / ( ) c k k s ợ , ấ ó ụ k ụ s ụ s Đ T VẤN ĐỀ (Arythrogryposis, Renal dysfunction, Cholestasis) ầ ợ z k ă , ố ợ é k s ậ , ó dịng ậ , 97 ó, k , ậ ố ă 990, báo ữ cáo ã ợ ợ gen VPS33B số ,s ă ó ố ậ ậ M k s ậ ỡ , ấ , ị ấ VIPAR k ị ấ , ầ ỏ, ố , ằ k , ễ … Xé ậ ó s ố ậ ỏ, , số ă , , ấ ậ ậ ậ ậ , ắ ố số , ó ị , s s s ó s , ấ ố ấ, , ậ … k ầ ấ ậ ấ M ấ ầ k ấ ợ k ók ấ ă ị , ầ số , ợ ữ , , é ậ k ẳ k ók ă ấ ị ẩ ẩ ị ầ s X ấ ầ ễ , ằ ậ gen VPS33B ẩ k , ấ ợ ó s ụ VIPAR ụ s Chươn 1: TỔNG AN TÀI IỆ T n quan ề hội ch n ARC 1.1 1.1.1 ) (Arythrogryposis, Renal dysfunction, Cholestasis Syn ầ ầ ợ z s k k ă , ố ợ ậ , ậ , é ó 97 ố ó, , ậ ă ữ ằ ấ,s s ỡ ị ấ , , số , ậ ị ấ , ầ ỏ, k , ậ ó s ố ấ ó ỏ, , ó , ă , tính, ấ ậ s s ậ ố 1.1.2 ố , ằ ậ ậ … ậ ậ , ắ ố ậ [7] , ẩ ẩ ẩ s ầ ữ ị k ó , ậ ó k ấ ố, s s ấ ợ số ó, k ễ … Xé , k 990, [7] s ậ ầ k ấ ữ ós s ó ậ số ậ ữ Xé ậ ấ s ấ ós ă s s ấ s ă s ữ , s s ỉ ậ ậ ă ợ ă ẹ ợ ă s s ậ ằ ậ , ó ậ ó ó , ấ ễ ó s ố ỡ , k ố ậ ậ ấ ấ ,k ẩ , ị ậ số ị ậ ó s ĩ, ă ậ ị ị ấ, ã ẳ ók ă ,k ó ữ k ỏ, ă Gen VPS33B ,k ầ P ) ằ ã ó 23 exon Gen VPS33B P /M ( s) ấ s ằ ấ [2] s ) ó ị s ợ ắ [7] VIPAR (hay gen VIPAS39) ị , , ã ó ó s s P 33B-VIPAR ( ã , P ố s ós ầ ố P ó ấ ấ ă s - ụ ấ ã P ợ 1.1)[1],[7] ợ , ụ ấ VPS33B ó ẩ ậ ợ ố s k Gen VIPAR ằ ụ s , [4],[6] ợ VPS33B ( ấ ắ k P M , , ụ s ị s ,s ữ s ă VIPAR[5],[7] n VIPAR Gen VPS33B ( ị ó ị VPS33B k k ễ 1.2 ấ , ậ s s ấ ụ [3],[7] P Hì ế ế kế mồ p ả P bả b e gen VIPAR 2.4.4 P ả P ậ P VPS33B 2.1 s 2.2 ầ VIPAR ả T p ầ óa ả ấ P Tên hóa chất 1X MgCl2 1,5 mM dNTP 0, / ợ Takara Taq polymerase gDNA Chu trình nhiệt phút 98oC 10 giây 58oC 20 giây Kéo dài 72oC 1,5 phút ố 72oC phút kỳ - 0,1 µM HS ệ P 98oC M/ ỗ ì Giai đoạn N n độ cuối PCR Buffer M 24 ắ - 0,5 U é 700 kỹ ( ẹ ã ) - ỏ ị 7μ Ủ C 15 phút ị , k ) f , kỹ, oC, phút -30o ữ - - 70 o / 8o ( Ủ - 00 μ sạ - C 25 phút , 000 - o ( ĩ ) 2.4.9 Giải trình tự phân tích kết ầ 00 tr ằ ầ z M ợ ( s s W k ó ỗ VPS33B ( ằ , Mỹ) ợ sắ VPS33B ó ị ố ó VIPAR ợ ss M 8 ) VIPAR ( ss M_022067.3) GenBank J s ấ ă 000 Chươn III: KẾT ố ợ s ã ậ s 3.2 ẩ ,k ấ ó ậ ó ợ , - , k k ă , ó < 7, … Kết t ch chiết DNA t n số số ợ s k ầ ậ , s ấ s ị s , ợ s é ó, k k M ợ P M ợ só só k ị 80 , k ó ị ấ ,8 – ,0 ụ – Optical density) s só ụ ấ 80 só sạ ậ 3.1 Đ sạ DN ầ s ậ mẫ m Mã số Độ tinh (A260/A280) ARC-1 1,88 ARC-1F 1,82 ARC-1M 1,90 ARC-1S 1,96 k ấ s sạ (O ậ ợ ả k ậ s ó ằ , ằ ó sạ N Đ c điểm lâm sàn bệnh nhân 3.1 s – BIỆN ấ số ợ ó ậ só 80 k 3.3 Kết kiểm tra m i 3.3.1 Kế q ả k m a , z ả ( ế mồ ợ k , ă ắ s số ợ (s f- ) , ỳ) ấ k ă Tm (oC) 57,2 59,8 60,0 48,7 52,9 53,5 48,4 56,8 54,7 54,8 55,0 55,7 56,2 54.5 49,6 54,1 53,1 51,0 54,2 55,9 48,8 49,9 53,5 53,7 55,8 55,9 ó ( e ó ), k ằ ầ ế mồ dù ă O p ả P P 33B Năn lượn t (∆G kcal.mol-1) HeteroHairpin Self-dimer dimer 0,21 -4,64 -6,44 -0,22 -4,62 -2,25 -10,24 -5,12 -1,48 -4,52 -1,34 -5,25 -5,49 0,58 -3,14 -4,39 -8,78 -5,24 -0,98 -4,89 -0,60 -3,53 -6,37 1,18 -6,34 -0,01 -6,30 -9,31 -3,08 -7,48 0,73 -10,24 -9,76 -0,48 -3,55 0,73 -3,65 -5,37 -0,04 -4,64 0,15 -12,90 -9,31 0,50 -3,54 1,01 -4,62 -5,02 0,40 -9,28 -0,82 -6,84 -6,84 -1,12 -6,84 -0,04 -6,34 -7,48 0,25 -3,55 -0,32 -4,77 -7,81 -2,58 -9,74 ế mồ dù p ả P %GC 55 55 59 45 45 50 40 55 55 50 55 55 55 50 45 55 45 45 50 55 45 40 50 50 55 55 s bả M i ắ s bả Chiều M i dài (bp) VPS33B-1F1 20 VPS33B-1R2 20 VPS33B-2F 20 VPS33B-2R 20 VPS33B-3F 20 VPS33B-3R 20 VPS33B-4F 20 VPS33B-5R 20 VPS33B-6F2 20 VPS33B-6R 20 VPS33B-7F2 20 VPS33B-8R 20 VPS33B-9F1 20 VPS33B-11R 20 VPS33B-12F 20 VPS33B-13R 20 VPS33B-14F 20 VPS33B-16R1 20 VPS33B-17F 20 VPS33B-17R 20 VPS33B-18F 20 VPS33B-19R 20 VPS33B-20F 20 VPS33B-22R 20 VPS33B-23F 20 VPS33B-23R 20 ả 3.3 Kế q ả k m a kẹ - ợ ó 3.2 Kế q ả k m a Chiều dài (bp) , e IPAR Năn lượn t (∆G kcal.mol-1) Tm %GC Hairpin Self-dimer Hetero- dimer VIPAR-1F VIPAR-1R VIPAR-2F VIPAR-2R VIPAR-3F VIPAR-3R VIPAR-4F VIPAR-4R VIPAR-5F VIPAR-7R VIPAR-8F VIPAR-8R VIPAR-9F VIPAR-10R VIPAR-11F VIPAR-11R VIPAR-12F VIPAR-12R VIPAR-13F VIPAR-14R VIPAR-15F VIPAR-16R VIPAR-17F VIPAR-17R VIPAR-18F VIPAR-18R VIPAR-19F VIPAR-19R VIPAR-20F1 VIPAR-20R2 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 53,2 53,0 53,1 54,2 53,6 52,0 52,8 55,1 53,6 55,4 54,4 53,5 53,1 52,2 53,1 53,3 50,5 53,2 52,1 52,7 53,8 55,0 53,4 52,2 51,8 53,5 54,0 55,1 54,7 52,6 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 45 50 50 50 50 55 50 50 50 50 50 50 50 50 , -1,89 0,27 -2,91 -0,26 1,19 0,82 0,60 -1,15 -1,91 -1,23 -0,44 -0,77 -1,05 0,77 -2,98 -0,06 -2,31 0,56 -1,23 -0,93 1,20 0,34 -0,22 -0,82 -0,53 -0,38 -1,22 0,67 -0,21 -0,85 ậ ậ k ắ ó k -4,67 -5,02 -5,37 -6,97 -4,74 -5,63 -3,78 -3,17 -4,74 -6,70 -11,64 -6,62 -3,90 -6,95 -4,67 ấ ó ợ -5,50 -3,43 -6,14 -4,89 -5,36 -4,16 -5,38 -3,17 -5,02 -6,34 -3,40 -4,67 -3,55 -3,17 -7,84 -3,61 -8,26 -3,14 -5,13 -6,60 -6,34 -3,54 -5,02 -4,89 -12,68 -5,02 -7,55 -7,05 -4,67 -4,89 ễ , s s k k ắ [9] ( P m) VIPAR ( ắ ữ ấ 55,4o ; ấ ấ 0, o P ) ậ ố ợ P VPS33B, ó s ấ 60,0o ; ( ấ 8,6oC)[8],[9] ấ ầ k s k ó ấ kẹ ắ , ấ k ắ ó ấ ấ kẹ ấ ó ầ , P k ó ịΔ P ấ -9 kcal.mol-1 ( ậ , ó k số s k ỉ ầ ỉ ịΔ P [8],[9] ã ợ k ợ ệ k ầ gen VPS33B 3.3.2 Kế q ả k m a M VPS33B- số P , ỉ -10 [8],[9] k VIPAR) ấ ố số - fắ -10 kcal.mol-1 ắ ắ t ( ịΔ ỏ 2F, VPS33B-9F1, VIPAR-18F ịΔ ó số ắ ó số , [8],[9] ợ s ấ P kcal.mol-1 M ấ ) ó k -6 kcal.mol-1 ầ ’ fạ kẹ s ấ P k ấ ấ ầ [8],[9] k -6 kcal mol- ầ ) kẹ óΔ ầ ợ ó ( ầ k – ấ ữ 13 mồ b VIPAR P me -Blast ợ k ằ ầ Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) ắ ụ số ợ k P ụ k VPS33B v ẩ k s ẩ k s k s ấ ị VIPAR ók ó ị k ( ắ ầ k P ầ k ’ ầ ầ , số , 3.2) k k k ’ ós ó, k s ắ ă ữ s ẩ k s ó ắ ấ ó k ắ ụ ằ ă Hì Kế q ả P me - L T p mồ P dù VPS33B bả e 7; e Hì Kế q ả P me - L T p mồ P bả e e nh PCR dù VIPAR 3.4 Kết hản n PCR DNA số ợ s P P ậ k ầ k ụ k s ấ VPS33B VIPAR ằ ằ ằ kỹ kỹ ậ P , ỉ ấ ó ố ợ P ữ s ắ , ố ợ s k số ợ , ị ợ ắ ké ỗ ã , ó , ; ( ) ; ố 9; P ợ s s k s 8; ó , , s é, k ụ 0; ; ẩ P ẩ P ợ ấ k ó ă ậ Hì 3.3: Kế q ả P s e gen VIPAR ằ e e bả 3.4: Kế q ả P e e ấ P mẫ m a m (k s ằ 3.4) M VPS33B Hì ụ 7; ( s ; ợ ụ ụ ; ợ s s ẩ 9, 0, , ằ ă VIPAR, k k VPS33B ằ DN bệ (1kb plus) ế a DNA) e VIPAR bả mẫ m a DN bệ (1kb plus) (-) Kết iải trình t 3.5 h t đột biến n VPS33B n VIPAR bệnh nhi n i thân ẩ P ó, sạ ẩ ó ằ P s ầ ợ ,s k sạ k VPS33B s ụ ậ ợ ẩ ợ ợ s s - ẩ VPS33B ấ VIPAR ố ữ ó ấ - ,k VPS33B ã ấ VPS33B, Tr ấ ị ị s ạ ó, P số , ãk 0, ãk 20 ấ k ĩ , ị s ị > s ós , ( 0 ( 3.5 ) ợ ã ợ P ị ợ ị số , ( ã ợ ợ k ợ f VIPAR ầ 3.5 ) P P-IT® PCR Product Cleanup s VIPAR k ẩ ấ ậ s , s ợ ữ P( 1000 genomes, s )k 3.5C)[10] ợ k ậ - , s ữ ấ , ( ( ) - ) - ỉ ẹ( ợ s ( 3.6) ợ s - M) ấ ấ ó, ị ị ợ , ó k ấ k Hì (p L s e P Hì 3.6 3.5 Kế q ả ả ì ự mẫ ) e 4( ) bế ( ) ế (p ậ NP (m NP s ồp ả ệp bế - p ) 4) e P ệ b ế 242de T T (p ) e ( ) e e P s 1000 genomes a ì bệ -1 Chươn IV: KẾT 4.1 N – KIẾN NGH Kết luận , ã số k ậ s : k P k VPS33B P ị ợ ( fsX ké ắ ) > ( ầ VPS33B ó ấ k ợ k ỉ ó 4.2 Kiến n hị ố VPS33B VIPAR ó P X) ( ĩ ữ ố ợ 8oC ắ VIPAR số ), ị ấ TÀI IỆ THAM KH O TÀI LIỆU TIẾNG NH Aflatounian M, Smith H, Farahani F, Naeem AT, Straatman-Iwanowska A, Zoghi S, Khatri U, Tajdini P, Fallahi GH, Gissen P (2016), "Novel VIPAS39 mutation in a syndromic patient with arthrogryposis, renal tubular dysfunction and intrahepatic cholestasis", European journal of medical genetics 59(4): 237-239 Gissen P, Johnson CA, Morgan NV, Stapelbroek JM, Forshew T, Cooper WN, McKiernan PJ, Klomp LW, Morris AA, Wraith JE (2004), "Mutations in VPS33B, encoding a regulator of SNARE-dependent membrane fusion, cause arthrogryposis–renal dysfunction–cholestasis (ARC) syndrome", Nature genetics 36(4): 400 Hershkovitz D, Mandel H, Ishida-Yamamoto A, Chefetz I, Hino B, Luder A, Indelman M, Bergman R, Sprecher E (2008), "Defective lamellar granule secretion in arthrogryposis, renal dysfunction, and cholestasis syndrome caused by a mutation in VPS33B", Archives of dermatology 144(3): 334-340 Li L-T, Zhao J, Chen R, Wang J-S (2014), "Two novel VPS33B mutations in a patient with arthrogryposis, renal dysfunction and cholestasis syndrome in mainland China", World Journal of Gastroenterology: WJG 20(1): 326 Smith H, Galmes R, Gogolina E, Straatman‐Iwanowska A, Reay K, Banushi B, Bruce CK, Cullinane AR, Romero R, Chang R (2012), "Associations among genotype, clinical phenotype, and intracellular localization of trafficking proteins in ARC syndrome", Human mutation 33(12): 1656-1664 Wang J-S, Zhao J, Li L-T (2014), "ARC syndrome with high GGT cholestasis caused by VPS33B mutations", World Journal of Gastroenterology: WJG 20(16): 4830 Zhou Y, Zhang J (2014), "Arthrogryposis–renal dysfunction–cholestasis (ARC) syndrome: from molecular genetics to clinical features", Italian journal of pediatrics 40(1): 77 TÀI LIỆU INTE NET http://www.sigmaaldrich.com/technicaldocuments/articles/biology/oligoarchitect-online.html ậ /0 / https://sg.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer ậ 03/05/2018 10 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/?gts=rs11073964 ậ /0 / ... k ók ă ấ ị ẩ ẩ ị ầ s X ấ ầ ễ , ằ ậ gen VPS33B ẩ k , ấ ợ ó s ụ VIPAR ụ s Chươn 1: TỔNG AN TÀI IỆ T n quan ề hội ch n ARC 1.1 1.1.1 ) (Arythrogryposis, Renal dysfunction, Cholestasis Syn ầ ầ ợ... kinh tế - xã hội đề tài man lại: , ă ấ ố ) Không ă ố  ợ ,  P ị ị ỉ ụ k ợ s ẩ s ẩ , ( ị ị ậ ): Không / ( ) c k k s ợ , ấ ó ụ k ụ s ụ s Đ T VẤN ĐỀ (Arythrogryposis, Renal dysfunction, Cholestasis). .. KẾT NGHIÊN C ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Thơng tin chung: ầ - ậ ARC (Arythrogryposis, Renal dysfunction, Cholestasis) - Mã số - tài: 0989850374 Email: bichtram1989tn@gmail.com ị -