thiết lập quy trình realtime pcr nhằm phát hiện kiểu gen hla b27 bệnh nhân viêm cột sống dính khớp tại việt nam

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG THIẾT LẬP QUY TRÌNH REALTIME PCR NHẰM PHÁT HIỆN KIỂU GEN HLA-B27 BỆNH NHÂN VIÊM CỘT SỐNG DÍNH KHỚP TẠI VIỆT NAM Mã số: Chủ nhiệm đề tài: Cử nhân LƯƠNG BẮC AN Tp Hồ Chí Minh, 04/2018 DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU Chức danh Họ tên, học hàm học vị trình thực nhiệm vụ CN LƯƠNG BẮC AN Đơn vị công tác Chủ nhiệm đề tài Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dược TP.HCM ThS LÊ THÁI KHƯƠNG Thành viên Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dược TP.HCM PGS.TS ĐỖ THỊ THANH THUỶ Thành viên Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dược TP.HCM Nơi thực đề tài: Đại học Y Dược TPHCM MỤC LỤC CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 1.2 1.3 Bệnh lý viêm cột sống dính khớp Nguyên nhân chế sinh bệnh Dịch tể 1.4 1.5 1.6 Triệu chứng Biến chứng HLA-B27 chế gây bệnh 1.7 Phương pháp phát kiểu gen HLA-B27 1.7.1 Phương pháp giải trình tự 1.7.2 1.7.3 Phương pháp dòng chảy tế bào Phương pháp Real – time PCR 10 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.2 Vật liệu nghiên cứu 16 2.2.1 Thiết bị - Dụng cụ 16 2.2.2 Hóa chất 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 2.3.2 Thiết kế mồi 17 Phản ứng multiplex PCR 18 2.3.3 Qui trình multiplex realtime SYBR Green PCR 19 2.4 Thời gian địa điểm thực nghiên cứu 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20 3.1 Kết thiết kế mồi 20 3.2 Kết multiplex PCR 20 3.3 Kết realtime PCR 21 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 25 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 DANH SÁCH HÌNH hình 1.1: biểu đồ đường biểu diễn khuếch đại phản ứng realtime PCR 11 hình 3.1 kết điện di multiplex PCR 21 hình 3.2 điểm chảy mẫu dna dương tính HLA-B27 22 hình 3.3 điểm chảy mẫu dna âm tính HLA-B27 22 hình 3.4 mẫu dna dương tính HLA-B27 23 hình 3.5 mẫu dna âm tính HLA-B27 23 DANH SÁCH BẢNG bảng 2.1 trình tự mồi phát kiểu gen HLA-B27 gen chứng nội 18 bảng 2.2 thành phần phản ứng multiplex PCR 18 bảng 2.3 thành phần phản ứng multiplex realtime sybr green PCR 19 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Thơng tin chung: - Tên đề tài: thiết lập quy trình realtime pcr nhằm phát kiểu gen HLA-B27 bệnh nhân viêm cột sống dính khớp việt nam - Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: CN Lương Bắc An Điện thoại: 0933 908 241 Email: luongbacan@ump.edu.vn - Đơn vị quản lý chuyên môn: Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Thời gian thực hiện: Tháng 6-2016 đến tháng 6-2017 Mục tiêu: Thiết lập quy trình realtime pcr nhằm phát kiểu gen HLA-B27 bệnh nhân viêm cột sống dính khớp việt nam Nội dung chính: - Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho kiểu gen HLA-B27 - Tối ưu hoá điều kiện phản ứng multiplex realtime PCR sử dụng SYBR Green Kết đạt (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ):  Thiết lập quy trình thiết lập quy trình realtime pcr nhằm phát kiểu gen HLA-B27  Cơng bố tạp chí nước quốc tế (tên báo, tên tạp chí, năm xuất bản): thiết lập quy trình realtime pcr nhằm phát kiểu gen HLA-B27 bệnh nhân viêm cột sống dính khớp việt nam Tạp chí Y Học Thành phố, tập 22, số 2, năm 2018 Hiệu kinh tế - xã hội đề tài mang lại MỞ ĐẦU Viêm cột sống dính khớp (VCSDK) tình trạng bệnh lý viêm vị trí đốt sống dính lại với khiến khớp xương linh động Bệnh nhiều yếu tố tác động, tuổi tác, giới tính yếu tố di truyền Khoảng 5% dân số mang kiểu gen HLA-B27, 95% bệnh nhân VCSDK có mang kiểu gen dương tính HLA-B27 Do đó, dấu ấn HLA-B27 xem dấu ấn di truyền cho bệnh lý VCSDK Phương pháp điều trị VCSDK chủ yếu giảm đau kháng viêm giúp giảm triệu chứng bệnh lý Để tăng khả điều trị hiệu cho bệnh nhân xác định nguyên nhân gây bệnh yếu tố quan trọng Vì vậy, bệnh nhân xuất triệu chứng nghi ngờ bệnh lý VCSDK việc phát kiểu gen HLA-B27 phương pháp giúp chẩn đoán bệnh sớm để có hướng phịng ngừa điều trị kịp thời Thuốc nhuộm SYBR Green giải pháp thay hiệu cho đoạn probe, giá thành tương đối hợp lý Hiện giới có nhiều hãng sản xuất kit phát kiểu gen HLA-B27 sử dụng thuốc nhuộm SYBR Green Tuy nhiên, giá thành cho kít cao, chưa phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam Do đó, chúng tơi thiết lập quy trình phát kiểu gen HLAB27 phản ứng realtime PCR sử dụng thuốc nhuộm SYBR Green Việc phát triển kít giúp giảm giá thành xét nghiệm chủ động việc chuẩn bị kit để làm xét nghiệm Chính vậy, chúng tơi thiết lập quy trình realtime PCR nhằm phát kiểu gen HLA-B27 bệnh nhân viêm cột sống dính khớp Việt Nam CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh lý viêm cột sống dính khớp Viêm cột sống dính khớp (VCSDK) bệnh lý viêm mạn tính kéo dài đặc trưng tình trạng đau cứng cột sống tiến triển Ngoài biểu theo trục xương, VCSDK cịn có biểu ngoại biên bao gồm viêm khớp ngoại biên, viêm chỗ vào xương gân dây chằng, viêm màng bồ đào, viêm van động mạch chủ Bệnh thường khởi phát tuổi thiếu niên Nam giới có tỉ lệ mắc bệnh cao gpaas 2-3 lần so với nữ giới bệnh lý VCSDK không điều trị sớm cách tiến triển đến viêm, dính khớp cột sống khớp ngoại biên, gây gù vẹo, chức tàn phế 1.2 Nguyên nhân chế sinh bệnh Nguyên nhân bệnh lí VCSDK cịn chưa rõ ràng, nhiên nghiên cứu cho thấy bệnh liên quan đến yếu tố di truyền Các nghiên cứu cho thấy, cặp sinh đôi trứng, tỉ lệ đồng mắc bệnh 63%; cặp sinh đôi khác trứng, tỉ lệ đồng mắc bệnh 13% Nếu có người thân gia đình (cha mẹ, anh chị em, cái) mắc bệnh, khả bị VCSDK tăng 6-16 lần Các nghiên cứu tìm nhiều gen có liên quan đến VCSDK, HLAB27 dấu ấn di truyền chứng minh có liên quan đến chế sinh bệnh có tới 90% bệnh nhân VCSDK có diện kháng nguyên bề mặt HLA-B27 HLA-B27 protein >95% bệnh nhân VCSDK chủng tộc Da trắng Tuy nhiên, HLA-B27 marker thấy xuất nhiều bệnh nhân VCSDK, nghĩa tất người mang marker mắc bệnh VCSDK Các nhà khoa học nghi ngờ có số marker khác HLA-B60, HLA-DR1 với yếu tố mơi trường (ví dụ nhiễm khuẩn) có vai trị kích hoạt VCSDK 1.3 Dịch tể Tỉ lệ mắc VCSDK chiếm khoảng 1-1,4% dân số theo thống kê nhiều nước, tỉ lệ theo tuổi gới VCSDK 0,4-14/100000 người / năm Tỉ lệ VCSDK tăng lên khoảng 5% số bệnh nhân có HLA-B27 dương tính VCSDK gặp nhiều nam giới (nam gấp 2-3 lần nữ) VCSDK thông thường phát bệnh người cao tuổi Cụ thể, tỉ lệ VCSDK bắt đầu tăng cao vọt từ độ tuổi 20-30 Khoảng 80% bệnh nhân có triệu chứng độ tuổi 30 5% có triệu chứng độ tuổi 45, triệu chứng ban đầu VCSDK thường không rõ ràng dễ nhầm lẫn với bệnh lí khác, dễ bị bỏ qua Thời gian dài triệu chứng biểu rõ ràng khả điều trị phục hồi thấp hơn, để lại nhiều di chứng sức khoẻ 1.4 Triệu chứng bệnh gặp, việc chẩn đoán bệnh dễ bỏ sót chẩn đốn muộn nhiều lý chủ quan lẫn khách quan như: - Bệnh nhân không khám bệnh, cố chịu đựng tự mua thuốc giảm đau uống - Bác sĩ chẩn đoán nhầm với bệnh lý cột sống thường gặp khác thoát vị đĩa đệm, thoái hoá cột sống thắt lưng… - Các biểu bệnh khơng đặc trưng, gây khó khăn cho chẩn đoán, đặc biệt trường hợp có biểu ngoại biên Việc chẩn đốn điều trị sớm giúp bệnh nhân tránh khỏi nguy tàn phế, trở thành gánh nặng cho thân, gia đình xã hội 1.5 Biến chứng Bệnh nhân VCSDK không điều trị sớm dẫn đến biến chứng dính khớp cột sống khớp ngoại biên Dính khớp cột sống gây gù Dính khớp háng, khớp gối gây khó khan cho việc lại Dính khớp xương ức với sụn sườn gây cứng lồng ngực làm giảm dung tích chức phổi Bệnh VCSDK làm tăng khống xương, bệnh nhân thường dễ bị loãng xương tang nguy gãy xương bệnh lý Gãy xẹp gãy lún đốt sống gãy xương bệnh lí thường gặp bệnh nhân VCSDK, góp phân làm nặng thêm tình trạng gù biến dạng cột sống 1.6 HLA-B27 chế gây bệnh VCSDK tình trạng bệnh lý viêm vị trí đốt sống dính lại với khiến khớp xương linh động, lâu ngày đốt sống dính lại với khiến tư đứng gập phía trước Ngoài ra, xương lồng ngực bị ảnh hưởng gây khó khăn q trình hơ hấp Bệnh lý viêm cột sống dính khớp thường ảnh hưởng nam nhiều nữ theo tỉ lệ 2:1 [2] Hiện nay, bệnh lý viêm cột sống dính khớp chưa có thuốc điều trị đặc hiệu Phương pháp điều trị chủ yếu giảm đau kháng viêm giúp giảm triệu chứng bệnh lý, phục hồi chức hệ xương khớp Viêm cột sống dính khớp có nhiều dạng, phụ thuộc vào giới tính, độ tuổi, chủng tộc Các biến thể nucleotide gen kháng nguyên bạch cầu người (HLA), chủ yếu HLA-B27, xem tác động tới chế gây bệnh VCSDK Giả thuyết đặt kiểu gen HLA-B27 có liên quan chặt chẽ với bệnh VCSDK Trạng thái alen đồng hợp hay dị hợp HLA-B27 gây mức độ nặng nhẹ bệnh lý nhiều tranh cãi Nghiên cứu Jaakkola dân số Phần Lan đưa kết luận: bệnh nhân mang kiểu gen HLA-B27 đồng hợp có nguy bị viêm cột sống dính khớp thể nhẹ so với người mang kiểu gen dị hợp Đồng thời, dân số mang kiểu gen HLA-B27 có khả khởi phát bệnh VCSDK sớm người không mang kiểu gen HLA-B27 Tuy nhiên, chế gây bệnh alen HLA-B27 chưa rõ ràng Ngoài ra, vấn đề chẩn đốn bệnh lý VCSDK gặp nhiều khó khăn giai đoạn sớm bệnh thường không biểu triệu chứng lâm sàng rõ rang Các triệu chứng biểu rõ bệnh tiến triển đến giai đoạn nặng; đó, gây khó khăn q trình điều trị phục hồi chức hệ xương khớp, ảnh hưởng đời sống sinh hoạt bệnh nhân Chính vậy, xét nghiệm phát kiểu gen HLAB27 giúp bác sĩ có thêm thơng tin kết luận bệnh viêm cột sống dính khớp mà khơng phải bệnh lí viêm khác; với đối tượng bệnh nhân nghi ngờ viêm cột sống dính khớp kiểm tra kiểu gen HLA-B27 để kịp thời đưa phương pháp điều trị, tránh tình trạng bệnh lý chuyển biến nặng, gây biến chứng nghiêm trọng HLA-B27 nằm nhiễm sắc thể có 105 subtypes khác ngày khám phá thêm [3] Trong đó, subtype B2702 đến B2705 có liên hệ tới bệnh lí VCSDK Phần lớn subtype HLA-B27 khác vài vị trí amino acid Kiểu gen HLA-B27 phân bố phụ thuộc vào chủng tộc người giới Theo ghi nhận bệnh nhân VCSDK, kiểu gen B2705 có người Da trắng (86%-90%) kiểu gen B2704 khơng xuất Ngược lại, người châu Á kiểu gen B2704 lại chiếm phần lớn bệnh nhân VCSDK (62%94%) kiểu gen B2705 (2-6%) [4] Kiểu gen B2706 B2709 chủ yếu thấy người bình thường không liên quan tới VCSDK [4] 1.7 Phương pháp phát kiểu gen HLA-B27 1.7.1 Phương pháp giải trình tự Phương pháp giải trình tự phương pháp giúp ta quan sát thứ tự nucleotide trình tự DNA quan tâm cách trực quan thơng qua sóng trình tự đọc phần mềm Phương pháp phát triển từ năm 1977, có nhiều đóng góp lớn phát triển sinh học, y học, giúp chẩn đốn nhiều loại bệnh, có khả phát nhiều loại đột biến cấu trúc gen đột biến điểm, thay thế, đột biến thêm, đảo đoạn, thêm, nucleotide Có nhiều phương pháp giải trình tự khác phương pháp hóa học Maxam Gilbert (1977), phương pháp dideoxynucleotide (phương pháp Sanger – 1977), giải trình tự tự động Lerooy Hood (1986) phương pháp giải trình tự hệ Ưu điểm:  Độ đặc hiệu độ nhạy cao  Khảo sát nhiều loại đột biến  Phân biệt thể đồng hợp, dị hợp Nhược điểm:  Chi phí cao  Tốn nhiều thời gian, quy trình có nhiều bước 1.7.2 Phương pháp dòng chảy tế bào Tuy nhiên giai đoạn cuối PCR, enzyme polymerase trở nên hoạt động hữu hiệu nên kéo dài mồi chúng bắt cặp lẫn dù đầu 3’ mồi khơng có bắt cặp đặc hiệu với nhau, nên tạo sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu từ dimer primer Sản phẩm khuếch đại từ dimer primer khác biệt với sản phẩm khuếch đại từ DNA đích chiều dài, từ dimer primer chiều dài khơng vượt q 50-55 bps, cịn từ DNA đích chiều dài thường 100bp Như vậy, để phân biệt đường biểu diễn khuếch đại ống phản ứng sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích hay từ dimer primer, phải dựa vào tính chất đặc trưng giúp phân biệt chiều dài hai loại sản phẩm khuếch đại này, tính chất đặc trừng nhiệt độ nóng chảy (melting T, Tm) nhiệt độ làm cho sợ đồi DNA bị biến tính 50% tức có 50% số sợi đơi bị biến tính hồn tồn Nhiệt độ chảy sợi đôi DNA tuỳ thuộc vào thành phần GC chiều dài nó: Thành phần GC cao Tm cao, sợi đơi dài Tn cao Sản phẩm khuếch đại từ DNA đích dài nên có Tm cao Tm sản phẩm khuếch đại từ dimer primer Để biết Tm sản phẩm khuếch đại có ống phản ứng, sau hoàn tất chu kỳ luân nhiệt realtime PCR, cần tiếp tục phân tíchcho máy chạy thêm chương trình phân tích nhiệt độ chảy, gọi chương trình melt-curve Tuỳ thuộc vào loại máy realtime PCR mà sử dụng chương trình cài sẵn máy, tự tạo chương trình melt curve mà thấy thích hợp Phân tích thay đổi biểu đồ chảy, cường độ huỳnh quang ống phản ứng thay đổi với cường độ huỳnh quang phát giảm dần theo bước tăng nhiệt độ buồng ủ nhiệt, lý sản phẩm khuếch đại có ống phản ứng bị biến tính dần theo gia tăng nhiệt độ buồng ủ nhiệt đến bước tăng nhiệt độ mà trùng khớp với Tm sản phẩm khuếch đại ống phản ứng cường độ huỳnh quang giảm đột ngột có đến 50% sản phẩm khuếch đại bị biến tính thành sợi đơn lúc, bước nhiệt độ thấy đường biểu diễn cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng khơng cịn đường thẳng xuống trước mà bị lao dốc xuống thấp nhiều so với độ dốc Nhờ mà người làm thí nghiệm quan sát diễn tiến q trình vẽ realtime biểu đồ chảy, hồn tồn xác định Tm sản phẩm khuếch đại có ống phản ứng Có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử nhằm xác định kiểu gen HLA-B27 Thơng thường, kiểu gen HLA-B27 phát phương pháp giải trình tự vùng gen exon gen HLAB, nhiên phương pháp địi hỏi nhiều thao tác, đắt tiền, khơng thích hợp làm xét nghiệm nhanh Phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho kiểu gen HLA-B27 phát nhanh kết quả, sản phẩm PCR cần tiến hành điện di gel agarose để đọc kết quả, nguy ngoại nhiễm tăng địi hỏi nhiều bước thí nghiệm Ngồi ra, số phương pháp cho phép đọc kết trực tiếp từ trình phản ứng (realtime PCR) sử dụng đoạn Taqman probe giúp xác định hiệu kiểu gen HLA-B27; nhiên, giá thành cho đoạn dò cao Thuốc nhuộm SYBR Green giải pháp thay hiệu cho đoạn probe, giá thành tương đối hợp lý Hiện giới có nhiều hãng sản xuất kit phát kiểu gen HLA-B27 sử dụng thuốc nhuộm SYBR Green Tuy nhiên, giá thành cho kít cao, chưa phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam Do đó, chúng tơi thiết lập quy trình phát kiểu gen HLA-B27 phản ứng realtime PCR sử dụng thuốc nhuộm SYBR Green Việc phát triển kít giúp giảm giá thành xét nghiệm chủ động việc chuẩn bị kit để làm xét nghiệm Chính vậy, chúng tơi thiết lập quy trình realtime PCR nhằm phát kiểu gen HLA-B27 bệnh nhân viêm cột sống dính khớp Việt Nam CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 2.1 Nghiên cứu thực mẫu DNA bệnh nhân chẩn đoán nghi ngờ viêm cột sống dính khớp Kết kiểu gen HLA-B27 mẫu DNA phát bằng kít PG 27 Detection kit (Pharmigen, Đài Loan); kít thương mại hố giới có chứng nhận áp dụng chẩn đốn Chúng tơi chọn 10 mẫu DNA âm tính HLA-B27 10 mẫu dương tính HLA-B27 Mẫu DNA bảo quản -30oC 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Thiết bị - Dụng cụ  Máy ly tâm thường (Eppendorf, Đức)  Máy PCR (Mastercycler® vapo protect, Eppendorf, Đức)  Máy spin (Hanil, Đức)  Máy vortex (Heidolph, Đức)  Máy Real time AG 22331 Hamburg (Erpendorf, Đức)  Tủ ATSH cấp II (ESCO Labculture®, Hoa Kì)  Cân điện tử (Sartorius, Hoa Kì); lị vi sóng (SANYO, Nhật)  Máy điện di (ADVANCE, Mupid®-exU System, Đức)  Máy đọc gel UV (UVP, GelDoc-It® 310, Hoa Kì)  Tủ mát 4oC tủ đông -30oC, -80oC (SANYO, Nhật)  Vật liệu tiêu hao 2.2.2 Hóa chất - Kit PCR TaKaRa®Taq HS (Takara, Nhật)  TaKaRa HS Taq (5 units/µl)  10X PCR buffer  100mM Tris-HCl (pH8.3)  500mM KCl  15mM MgCl2  Thành phần dNTP  2,5mM cho loại dNTP  Hòa tan nước có pH 7-9 - Kit SYBR® Green Premix Ex Taq TM (Takara, Nhật) - Nước PCR (MiliQ), dung dịch EDTA 0.5 pH = (Merck, Đức) 2.2.2.1 2.3 Điện di  Dung dịch 5X TBE  Tris (Merck, USA): 54g  Acid boric (Merck, USA): 27.5g  0.5M EDTA pH8: 20ml  Nước: thêm đủ 1000 ml (từ dung dịch 5X pha thành 0.5X)  Dung dịch nạp mẫu 6X (Thermo Scientific, Hoa Kì)  Agarose dạng bột (Promega, Hoa Kì)  GelRed Dye (Thẻmo Scientific, Hoa Kì)  Thang DNA 1kbplus (0.5 µg/µL) (Thermo Scientific, Hoa Kì) Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Thiết kế mồi Mồi thiết kế nhận diện vị trí xác định kiểu gen HLA-B27 vùng exon gen HLA-B Các vị trí nhiều báo giới sử dụng để thiết kế phản ứng nhận diện kiểu gen HLA-B27 [10,11] Gen chứng nội sử dụng gen G6PD (NG_009015) Phản ứng multiplex PCR gồm cặp mồi: cặp mồi gen chứng nội G6PD cặp mồi nhận diện kiểu gen HLA-B27 Tên trình tự cặp mồi liệt kê chi tiết (bảng 2.1) Bảng 2.1 Trình tự mồi phát kiểu gen HLA-B27 gen chứng nội Kích thước PCR Tên mồi Trình tự (5’-3’) B27a GTGGGCTACGTGGACGACACGCT B27b GTCAGTCTGTGCCTTGGCCTTGC AN-G6PD-F CATCTTCCACCAGCAGTGCAAGC AN-G6PD-R CCACACTGCTCCTTCTCTGTAGG (bp) 150 178 2.3.2 Phản ứng multiplex PCR Thành phần phản ứng multiplex PCR gồm cặp mồi phát kiểu gen HLA-B27 cặp mồi chứng nội Phản ứng PCR với tổng thể tích 15µl gồm thành phần (bảng 2.2) Bảng 2.2 Thành phần phản ứng multiplex PCR Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ phản ứng 10X buffer PCR 1.5 1X dNTPs 250nm 1.2 20 nM Primer B27a (10µM) 0.375 250 nM Primer B27b (10µM) 0,375 250 nM Primer AN-G6PD-F (10µM) 0,75 500 nM Primer AN-G6PD-R (10µM) 0,75 500 nM Taq Takara HS 0,1 DNA 1,5 50-100 ng H2 O 8,45 Vừa đủ 15 µl Chu trình ln nhiệt cho PCR thực máy Mastercycler@Pro S (Eppendorf, Đức) Chu kì nhiệt: khởi đầu 98oC phút; với 40 chu kì lặp lại bước 98oC: 10 giây, nhiệt độ lai tương ứng là: 58 oC, 60 oC, 62oC 30 giây, 72oC 30 giây; với bước nhiệt 72oC phút Sản phẩm giữ 4oC sau chương trình PCR kết thúc Kiểm tra sản phẩm PCR điện di thạch agarose 2% có thuốc nhuộm GelRed quan sát với hệ thống chụp ảnh điện di GelDoc-ItTM (UVP, Mỹ) 2.3.3 Qui trình multiplex realtime SYBR Green PCR Thành phần phản ứng thực bảng (2.3) Bảng 2.3 Thành phần phản ứng multiplex realtime SYBR Green PCR Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ phản ứng SYBR Green 2X 7,5 1X Primer B27a (10µM) 0,2 133 nM Primer B27b (10µM) 0,2 133 nM Primer AN-G6PD-F (10µM) 0,4 267 nM Primer AN-G6PD-R (10µM) 0,4 267 nM DNA 1,5 50-100 ng H2 O 4,8 Vừa đủ 15ul Chu trình luân nhiệt đọc tín hiệu huỳnh quang thực hệ thống máy Mastercycler epgradients realplex (Eppendorf, Đức) Chu kì nhiệt: khởi đầu 95oC phút; với 35 chu kì lặp lại bước: 95oC 15 giây, 60oC 30 giây, ghi nhận tín hiệu huỳnh quang sau bước Nhiệt độ melting curve: 98oC 15 giây, nhiệt độ từ 65oC 15 giây sau tăng dần lên 98oC vòng 20 phút Cuối bước 98oC 15 giây 2.4 Thời gian địa điểm thực nghiên cứu Thời gian thực nghiên cứu từ tháng 6/2016 đến tháng 6/2017 Địa điểm thực nghiên cứu: Trung tâm Y Sinh học Phân tử - ĐH Y Dược Tp Hồ Chí Minh, 217 Hồng Bàng, P11, Q5, Tp Hồ Chí Minh CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết thiết kế mồi Cặp mồi thiết kế phần mềm CLC Main Workbench 5.5; vị trí nucleotide thay đổi quy định kiểu gen HLA-B27 Cặp mồi thiết kế chỉnh sửa số vị trí nucleotide quy định kiểu gen HLA-B27, đặc biệt vị trí c.167A>T tương ứng với đầu 3’ mồi xi B27a vị trí c.272A>G tương ứng với vị trí đầu 3’ mồi ngược B27b; kích thước khuếch đại 150bp Do có khác biệt nucleotide đầu 3’ mồi nên mẫu DNA khơng thuộc kiểu gen HLA-B27 khơng xuất sản phẩm PCR Các vị trí nucleotide nhiều công bố giới sử dụng điểm thiết kế mồi phát kiểu gen [10,11] Ngoài ra, để nâng cao độ tin cậy phản ứng PCR, thiết kế thêm cặp mồi AN-G6PD-F/R làm chứng nội chạy phản ứng; kích thước khuếch đại 178bp 3.2 Kết multiplex PCR Phản ứng multiplex PCR đồng thời cặp mồi phát kiểu gen HLA-B27 cặp mồi cho gen G6PD làm chứng nội mẫu DNA dương tính HLA-B27 Kết từ hình cho thấy, giếng chứng âm (giếng 5) không xuất sản phẩm, phản ứng PCR không bị nhiễm Các giếng 1,2 đại diện cho mức nhiệt độ lai 58, 60 62oC với mẫu DNA dương tính với HLA-B27 Kết hình điện di cho thấy, nhiệt độ 58oC (giếng 1) 60oC (giếng 2) xuất đồng thời vạch gồm chứng nội (kích thước 178bp) alen HLA-B27 (kích thước 150 bp) với kích thước quan tâm Cịn nhiệt độ 62oC (giếng 3), xuất vạch gen chứng nội Nhiệt độ lai 60oC (giếng 2) cho sản phẩm thể vạch sáng rõ vạch; đó, nhiệt độ lai điều kiện thích hợp cho phản ứng multiplex PCR Chúng lựa chọn nhiệt độ lai 60oC cho mẫu DNA không mang kiểu gen HLA-B27 (giếng 4); kết xuất vạch gen chứng nội Chứng tỏ, cặp mồi thiết kế hoạt động hiệu quả, có khả nhận diện xác kiểu gen HLA-B27 L 300 200 75 Hình 3.1 Kết điện di multiplex PCR Giếng L: thang chuẩn; giếng 1: nhiệt độ lai 58oC; giếng 2: nhiệt độ lai 60oC; giếng 3: nhiệt độ lai 62oC; giếng 4: mẫu DNA âm HLA-B27; giếng 5: mẫu âm H2O Ngoài ra, nồng độ mồi tham gia phản ứng đóng vai trị quan trọng Nồng độ mồi gen chứng nội G6PD alen HLA-B27 ảnh hưởng lẫn ảnh hưởng tới kết PCR Hiệu chỉnh nồng độ mồi dựa vào độ sáng vạch điện di vạch sản phẩm phải có độ đậm nhạt tương đương Tránh trường hợp chiều hướng phản ứng nghiêng khuếch đại gen chứng nội, làm ức chế phản ứng cặp mồi phát kiểu gen HLA-B27, xuất âm tính giả Sau nhiều kết điều chỉnh nồng độ mồi (không trình bày liệu) chúng tơi đưa nồng độ cặp mồi AN-G6PD-F/R cao lần nồng độ cặp mồi B27a/b thích hợp (bảng 2.2) 3.3 Kết realtime PCR Phản ứng multiplex realtime PCR sử dụng SYBR Green thuốc nhuộm, kết realtime PCR phải phân tích thơng qua đường cong nóng chảy sản phẩm khuếch đại (melting curve) Về nguyên tắc, nhiệt độ điểm chảy phụ thuộc vào chiều dài sản phẩm khuếch đại thành phần % GC chuỗi trình tự khuếch đại 87,1oC 88,8oC Hình 3.2 Điểm chảy mẫu DNA dương tính HLA-B27 87,1oC Hình 3.3 Điểm chảy mẫu DNA âm tính HLA-B27 Phân tích biểu đồ đường cong nóng chảy cho thấy, phản ứng sử dụng DNA dương tính HLA-B27 (hình 3.2), cặp mồi B27a/b cho sản phẩm khuếch đại có kích thước 150 bp thành phần %GC trình tự khuếch đại 65,3%; tương đương với điểm nóng chảy 88,8oC Cặp mồi AN-G6PD-F/R cho sản phẩm khuếch đại có kích thước 178 bp thành phần %GC trình tự khuếch đại 58,4%; tương đương có điểm nóng chạy 87,1oC Kết phân tích đường cong chảy xuất đỉnh sóng tương ứng với điểm nhiệt độ tương ứng Tuy điểm nóng chảy gần (chênh lệch khoảng 2oC), kết hình đường cong chảy cho đỉnh sóng rõ ràng Do chiến lược thiết kế mồi chưa thật chặt chẽ, cặp mồi chứng nội alen B27 thiết kế cho kích thước sản phẩm khuếch đại gần (150 bp 178 bp) dẫn tới kết điểm nóng chảy gần nhau, gây khó khăn phân tích kết Trong nghiên cứu tiếp theo, cần ý vấn đề chiều dài đoạn khuếch đỉnh sóng tách biệt rõ Kết luận, cặp mồi chứng nội alen HLA-B27 đồng thời hoạt động tốt 87,1oC 88,8oC Hình 3.4 Các mẫu DNA dương tính HLA-B27 87,1oC Hình 3.5 Các mẫu DNA âm tính HLA-B27 Tương tự, mẫu sử dụng DNA âm tính với kiểu gen HLA-B27 (hình 3.3) Kết xuất đỉnh chảy 87,1oC ứng với sản phẩm khuếch đại từ cặp mồi chứng nội Kết luận, cặp mồi chứng nội hoạt động tốt, cặp mồi B27a/b khơng bắt nhầm vào vị trí khác gen người phân biệt xác kiểu gen HLA-B27 Khi thực chạy đồng thời 10 mẫu DNA xác định kiểu gen HLA-B27 dương tính kít PG27 (Pharmigene, Đài Loan), kết phân tích đường cong nóng chảy cho kết gồm nhiều đỉnh sóng khác chồng lên nhiệt độ 88,8oC 87,1oC (hình 3.4) Ngược lại, 10 mẫu DNA âm tính kiểu gen HLA-B27 đỉnh sóng hội tụ đỉnh nhiệt độ 87,1oC (hình 3.5) Do đó, kiểu gen HLA-B27 xác định phương pháp multiplex realtime PCR SYBR Green kít PG27 (Pharmigene, Đài Loan) cho kết tương đồng 100% Phản ứng realtime PCR thiết kế dạng multiplex kết hợp mồi chứng nội mồi phát kiểu gen HLA-B27, điều giúp tránh trường hợp âm tính giả thao tác kỹ thuật chất lượng hoá chất sử dụng phản ứng, tiết kiệm chi phí hố chất CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN Kháng nguyên bạch cầu người (HLA)-B27 phân tử phức hợp phù hợp mơ lớp (MHC-I) mã hoá NST6p Kháng nguyên tồn nhiều loại tế bào biểu mạnh tế bào trình diện kháng nguyên Sau dịch mã gấp cuộn tạo cấu trúc bậc 3, chuỗi nặng HLA-B27 hình thành phức hợp heterotrimeric với ß2 microglobulin (ß2m) chuỗi peptide nội bào có nguồn gốc từ protein tự thân từ vi rút vi khuẩn Với cấu trúc giúp tế bào trình diện kháng ngun ngoại lai Mối quan hệ kiểu gen HLA-B27 với viêm cột sống dính khớp mơ tả lần vào năm 1973 alen HLA bệnh lí viêm nhiễm [8] Tuy nhiên, chế gây bệnh chưa giải thích rõ ràng Nhiều chứng khác subtype HLA-B27 ảnh hưởng khác tới bệnh VCSDK Khoảng 105 kiểu subtype HLA-B27 báo cáo số tiếp tục gia tăng Hầu hết subtype khác biệt vài amino acid, lại thay đổi lớn khả bám lên phân tử peptides, dẫn tới thay đổi chức thụ thể HLA Những kiểu gen phổ biến có liên quan tới bệnh VCSDK HLA-B2705, B2704, B2702 B2707, kiểu gen B2706 B2709 phổ biến Nam Á lại khơng có liên hệ với bệnh VCSDK [1] Có nhiều giả thuyết vai trị kiểu gen HLA-B27 chế phân tử gây bệnh VCSDK Trong đó, giả thuyết trình diện peptides tự thân gây viêm khớp, đoạn peptides HLA-B27 trình diện với tế bào T-CD8+ cấu hình gấp cuộn HLA-B27 giống với cấu trúc peptide từ vi khuẩn, điều không xảy với phân tử HLA khác Các tế bào T gây chết tế bào, hình thành nên tình trạng viêm mạn tính [9] Giả thuyết cấu trúc homodimer HLA-B27 trình diện bề mặt tế bào cho chuỗi nặng HLA-B27 đồng thời trình diện bề mặt tế bào Sự hình thành cấu trúc homodimer gồm chuỗi nặng HLA-B27 mà khơng có tham gia ß2M Cấu trúc homodimer HLA-B27 bám vào thụ thể đặc biệt tế bào NK, tế bào lympho T Quá trình trình diện cho thấy homodimer HLA-B27 đóng vai trị kháng nguyên gây bệnh tự miễn [5] Giả thuyết HLA-B27 gấp cuộn sai, cho thấy bệnh lí VCSDK xuất phát từ tích luỹ peptide HLA-B27 gấp cuộn bất thường mạng lưới nội chất (ER), gây phản ứng viêm [6] Bệnh lý VCSDK ghi nhận tác nhân khác vi khuẩn vi rút gây như: Salmonella, Shiella Cladimydia Do cấu trúc HLA-B27 bị bất thường dẫn tới hoạt động trình diện kháng ngun khơng hiệu cho tế bào T Vì vậy, tác nhân khơng tế bào T tiêu diệt triệt để, từ kích hoạt phản ứng viêm khớp [12] Tuy nhiên, chế phản ứng chưa hiệu rõ Trong nghiên cứu này, thiết kế mồi phát kiểu gen HLA-B27 dựa khác biệt vị trí nucleotide thay đổi dẫn tới thay đổi amino acid chuỗi peptide Cụ thể chuỗi trình tự kiểu gen HLA-B2704, kiểu gen HLA-B27 phổ biến dân cư khu vực Trung Quốc Đông Nam Á [4, 3] Ngồi ra, vị trí nucleotide nhiều cơng bố giới dựa vào để thiết kế mồi cho mục đích phát kiểu gen HLA-B27 [10,11] Tối ưu hố thành cơng quy trình realtime PCR phát kiểu gen HLA-B27 góp phần nâng cao tiền đề chăm sóc sức khoẻ cho bệnh nhân, hạn chế phụ thuộc vào kít nước ngồi, giảm giá thành sản phẩm, đáp ứng nhu cầu làm xét nghiệm di truyền sinh học phân tử Việt Nam CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Chúng thiết kế cặp mồi phát kiểu gen HLA-B27 cặp mồi gen chứng nội G6PD Chúng thiết lập điều kiện phản ứng multiplex realtime PCR SYBR Green nhằm phát kiểu gen HLA-B27 Sự tương đồng xác định kiểu gen HLA-B27 phương pháp multiplex realtime PCR SYBR Green kít PG27 (Pharmigene, Đài Loan) 100% Tuy nhiên, cỡ mẫu sử dụng cho nghiên cứu hạn chế, khiến kết nghiên cứu nhiều hạn chế độ nhạy độ lặp lại Cần có nhiều nghiên cứu mở rộng nhằm tăng độ tinh cậy độ ổn định xét nghiệm cách tăng cỡ mẫu nghiên cứu Ngoài ra, HLA-B27 kháng nguyên bề mặt, đó, phát kiểu gen HLA-B27 bước kết luận ban đầu người bệnh có mang kiểu gen này, cịn vấn đề kiểu gen có biểu thành protein có đầy đủ chức cần phải có xét nghiệm đánh giá trực tiếp kháng nguyên HLA-B27 biểu trực tiếp bề mặt tế bào thơng qua phương pháp dịng chảy tế bào Chính vậy, phương pháp có xác cần so sánh với mẫu có kết kiểu gen HLA-B27 từ phương pháp dòng chảy tế bào để so sánh Ngoài ra, nghiên cứu cần phải chuẩn hố số điều kiện ngưỡng (cut off) có xét nghiệm để phù hợp với quần thể người Việt Nam chung TÀI LIỆU THAM KHẢO Ball EJ, et al (2001) HLA-B27 polymorphism Joint Bone Spine, 68(5), 378– 382 Feldtkeller E, Khan M, et al (2003) Age at disease onset and diagnosis delay in HLA-B27 negative vs positive patients with ankylosing spondylitis Rheumatol Int, 23(2), 61–66 Khan MA, et al (2013) Polymorphism of HLA-B27: 105 subtypes currently known Curr Rheumatol Rep, 15(10), 362 Khan MA, Mathieu A, et al (2007) The pathogenetic role of HLA-B27 and its subtypes Autoimmun Rev, 6(3), 183–189 Kollnberger S, Bird L, et al (2002) Cell-surface expression and immune receptor recognition of HLA–B27 homodimers Arthritis Rheumatol, 46(11), 2972– 2982 Mear JP, Schreiber KL, et al (1999) Misfolding of HLA-B27 as a result of its B pocket suggests a novel mechanism for its role in susceptibility to spondyloarthropathies J Immunol, 163(12), 6665–6670 Reveille JD, Arnett FC, et al (2005) Spondyloarthritis: update on pathogenesis and management Am J Med, 118(6), 592–603 Schlosstein L, Terasaki PI, et al (1973) High association of an HL-A antigen, W27, with ankylosing spondylitis N Engl J Med, 288(14), 704–706 Smith JA, Märker-Hermann E, et al (2006) Pathogenesis of ankylosing spondylitis: current concepts Best Pract Res Clin Rheumatol, 20(3), 571–591 10 Sylvain K, Aurélie H, et al (2004) Rapid screening for HLA-B27 by a TaqMan-PCR assay using sequence-specific primers and a minor groove binder probe, a novel type of TaqManTM probe J Immunol Methods, 287(1), 179–186 11 Vanvi D, Raja P, et al (2012) Optimization of In-House PCR-SSP Technique for HLA B27 detection in saurashtra patients International Journal of Modern Engineering Research (IJMER), 2(3), 996-1000 12 Virtala M, Kirveskari J, et al (1997) HLA-B27 modulates the survival of Salmonella enteritidis in transfected L cells, possibly by impaired nitric oxide production Infect Immun, 65(10), 4236–4242 ... tơi thiết lập quy trình realtime PCR nhằm phát kiểu gen HLA- B27 bệnh nhân viêm cột sống dính khớp Việt Nam CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh lý viêm cột sống dính khớp Viêm cột sống dính khớp. .. realtime pcr nhằm phát kiểu gen HLA- B27  Công bố tạp chí nước quốc tế (tên báo, tên tạp chí, năm xuất bản): thiết lập quy trình realtime pcr nhằm phát kiểu gen HLA- B27 bệnh nhân viêm cột sống dính khớp. .. Thời gian thực hiện: Tháng 6-2016 đến tháng 6-2017 Mục tiêu: Thiết lập quy trình realtime pcr nhằm phát kiểu gen HLA- B27 bệnh nhân viêm cột sống dính khớp việt nam Nội dung chính: - Thiết kế cặp