xây dựng quy trình kỹ thuật real time pcr để khảo sát sự biểu hiện gen mmp12 trong tế bào thu từ mẫu đàm của bệnh nhân bị bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT REAL-TIME PCR ĐỂ KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN GEN MMP12 TRONG TẾ BÀO THU TỪ MẪU ĐÀM CỦA BỆNH NHÂN BỊ BỆNH PHỔI TẮC NGHẼN MẠN TÍNH Mã số: Chủ nhiệm đề tài: Cử nhân NGUYỄN THẾ VINH Tp Hồ Chí Minh, 03/2018 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TĨM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT REAL-TIME PCR ĐỂ KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN GEN MMP12 TRONG TẾ BÀO THU TỪ MẪU ĐÀM CỦA BỆNH NHÂN BỊ BỆNH PHỔI TẮC NGHẼN MẠN TÍNH Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 04/2018 DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU Chức danh Họ tên, học hàm học vị trình thực nhiệm vụ CN NGUYỄN THẾ VINH Đơn vị công tác Chủ nhiệm đề tài Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dƣợc TP.HCM BS NGUYỄN CÔNG TRUNG Thành viên Bệnh viện Nguyễn Trãi PGS.TS HỒNG ANH VŨ Thành viên Nghiên cứu sinh mơn Lão Khoa, Đại học Y Dƣợc TP.HCM Trung tâm Y Sinh học Phân tử Đại học Y Dƣợc TP.HCM MỤC LỤC CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh phổi tắc nghẹn mạn tính 1.2 Nguyên nhân chế sinh bệnh 1.3 Dịch tể 10 1.4 Triệu chứng 10 1.5 MMP12 chế gây bệnh 12 1.6 Phƣơng pháp định lƣợng biểu MMP12 15 1.6.1 Phƣơng pháp giải trình tự 15 1.6.2 Phƣơng pháp Real – time PCR 16 CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 21 2.2 Vật liệu nghiên cứu 21 2.2.1 Thiết bị - Dụng cụ 21 2.2.2 Hóa chất 21 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Thiết kế mồi 22 2.3.2 Tách chiết tế bào từ mẫu đàm 23 2.3.3 Tách chiết RNA từ tế bào trữ Trizol 23 2.3.4 Tổng hợp cDNA từ RNA mẫu 24 2.3.5 Thực phản ứng PCR 24 2.3.6 Giải trình tự phƣơng pháp Sanger 25 2.3.7 Qui trình multiplex realtime SYBR Green PCR 25 2.4 Thời gian địa điểm thực nghiên cứu 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 3.1 Kết giải trình tự gen MMP12 27 3.2 Kết xây dựng đƣờng chuẩn kiểm tra đƣờng cong nóng chảy sản phẩm realtime PCR 27 3.3 Kết realtime PCR 29 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 30 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 DANH SÁCH HÌNH HÌNH 1.1: BIỂU ĐỒ ĐƢỜNG BIỂU DIỄN KHUẾCH ĐẠI CỦA PHẢN ỨNG REALTIME PCR 17 HÌNH 3.1 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ SẢN PHẨM KHUẾCH ĐẠI TỪ CẶP MỒI MMP12F/MMP12R 27 HÌNH 3.2 KẾT QUẢ DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN TỪ AMPLICON MMP12 28 HÌNH 3.3 KẾT QUẢ DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN TỪ AMPLICON Β-ACTIN 28 HÌNH 3.4 KẾT QUẢ ĐƢỜNG CONG NÓNG CHẢY SẢN PHẨM KHUẾCH ĐẠI MMP12 (78,4OC) VÀ Β-ACTIN (89,8OC) 28 DANH SÁCH BẢNG BẢNG 2.1 THÔNG SỐ MỒI KHUẾCH ĐẠI CDNA MMP12 VÀ Β-ACTIN 22 BẢNG 3.1 KẾT QUẢ REALTIME PCR VỚI CÁC NỒNG ĐỘ AMPLICON MMP12 VÀ Β-ACTIN PHA LOÃNG BẬC 100 27 BẢNG 3.2 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT RNA VÀ REALTIME-PCR CỦA NHÓM MẪU 29 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG Thông tin chung: - Tên đề tài: XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT REAL-TIME PCR ĐỂ KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN GEN MMP12 TRONG TẾ BÀO THU TỪ MẪU ĐÀM CỦA BỆNH NHÂN BỊ BỆNH PHỔI TẮC NGHẼN MẠN TÍNH - Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: CN Nguyễn Thế Vinh Điện thoại: 0935 827 668 Email: vinhnguyen29391@gmail.com - Đơn vị quản lý chuyên môn (Khoa, Tổ môn): Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Thời gian thực hiện: Tháng 6-2016 đến tháng 6-2017 Mục tiêu: Xây dựng đƣợc quy trình ứng dụng kỹ thuật real-time PCR định lƣợng tƣơng đối biểu gen MMP12 mẫu đàm Nội dung chính: - Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho gen MMP12 - Tách tế bào bạch cầu từ mẫu đàm nhóm đối tƣợng 9bệnh nhân COPD 60 tuổi ngƣời khỏe mạnh 60 tuổi) - Xây dựng điều kiện phản ứng realtime PCR sử dụng SYBR Green Kết đạt đƣợc (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ):  Công bố tạp chí nƣớc (tên báo, tên tạp chí, năm xuất bản): Hiệu kinh tế - xã hội đề tài mang lại: MỞ ĐẦU Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD) thách thức quan trọng sức khoẻ cộng đồng nguyên nhân gây tử vong bệnh tật mãn tính toàn giới COPD nguyên nhân gây tử vong, đứng hàng thứ tƣ giới, nhƣng đƣợc dự báo nguyên nhân tử vong hàng thứ vào năm 2020 Theo thống kê Hơn triệu ngƣời chết COPD vào năm 2012, chiếm 6% tổng số ca tử vong toàn cầu Trên toàn cầu, gánh nặng COPD dự kiến tăng lên thập kỷ tới tiếp tục phơi nhiễm với yếu tố nguy lão hóa dân số Theo Hiệp Hội Hơ hấp Châu Á Thái Bình Dƣơng, tần suất COPD( giai đoạn trung bình nặng ) 12 nƣớc Châu Thái bình dƣơng là: 6,3%, Hong Kong 3,5%; Singapore là: 3,5%; cao Việt nam: 6,7% Theo nhà nghiên cứu: Cơ chế bệnh sinh dẫn đến COPD gồm yếu tố là: Tình trạng viêm dai dẳng, cân protease – antiprotease tình trạng stress oxy hóa Các nhà nghiên cứu ý nhiều đến vai trò Protease Antiprotease COPD, đặc biệt Protease MMPS MMP12 Theo nhà nghiên cứu: Matrix metalloproteinase-12 (MMP-12) có vai trị quan trọng việc kích hoạt hay bất hoạt tình trạng viêm, gây phá hủy thành phần mô liên kết, phá hủy protein thành phế nang, phá hủy cấu trúc elastine thành phần mơ liên kết, dẫn đến COPD Do đó, nhà nghiên cứu ý nhiều đến hƣớng điều trị cho COPD, cách can thiệp vào tình trạng cân protease-antiprotease, nhà nghiên cứu thử nghiệm dùng ức chế chọn lọc tác động đến protease - MMP12 Theo Hiệp Hội Hô Hấp Châu Âu: Cho đến nay, việc can thiệp vào bệnh COPD cách dùng chất ức chế chọn lọc, tác động đến MMP-12 có lẽ phƣơng thức điều trị khả thi(viable) cho khí phế thũng tái cấu trúc khí đạo nhỏ Từ nhận định nhà nghiên cứu vai trò quan trọng Matrix metalloproteinase-12 (MMP-12) chế bệnh sinh COPD từ lời cảnh báo nguy bệnh COPD gia tăng toàn giới Chúng tơi nghĩ rằng: việc nghiên cứu vai trị Matrix metalloproteinase-12 (MMP-12) bệnh lí COPD sở có ích quản lí điều trị bệnh COPD Vì chúng tơi xin thực nghiên cứu Hiện nay, Trung Tâm Sinh Học Phân Tử Đại Học Y Dƣợc thực đƣợc xét nghiệm biểu hiện, hoạt động, định lƣợng, bán định lƣợng gene Matrix metalloproteinase-12 (MMP-12) đàm bệnh nhân phƣơng pháp Realtime RT - PCR, tạo điều kiện cho thực nghiên cứu này, nhằm tìm mối liên quan gene MMP-12 đến đặc điểm, biểu lâm sàng, chức hơ hấp nhóm bệnh COPD đƣợc phân tích nhóm theo GOLD CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh phổi tắc nghẹn mạn tính Theo GOLD 2017: Global initiative for Chronic Obstructive Lung Disease ) : Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD) bệnh phổ biến, bệnh ngăn ngừa điều trị đƣợc, đặc tính bệnh triệu chứng hơ hấp tình trạng giới hạn luồng khí dai dẵng bất thƣờng phế nang và, khí đạo, thƣờng phơi nhiễm với phân tử độc hại khí độc hại, đợt cấp bệnh lí đồng mắc (comorbidities) góp phần làm bệnh nặng theo cá thể Đặc tính tình trạng giới hạn luồng khí dai dẳng có nguyên nhân kết hợp bệnh khí đạo nhỏ (viêm tiểu phế quản tắc nghẽn) phá hủy nhu mơ phổi - khí phế thũng Trên giới, hút thuốc yếu tố nguy phổ biến gây COPD, Tuy nhiên, nhiều nƣớc phát triển, nhiễm khơng khí việc đốt củi than nhiên liệu sinh khối( biomass) khác đƣợc xác định yếu tố nguy 1.2 Nguyên nhân chế sinh bệnh Bệnh COPD đƣợc hình thành tác động qua lại gene môi trƣờng; hai ngƣời với tiền sử hút thuốc nhƣ nhau, ngƣời phát triển thành COPD khác biệt gene thời gian sống họ Khói thuốc nguy cao gây COPD Những ngƣời hút thuốc có tỉ lệ giảm FEV1 tăng hàng năm, tử vong tăng nhiều so với ngƣời không hút Hút ống điếu, xì gà gây tăng tỉ lệ bệnh tật tử vong COPD nhiều ngƣời không hút: có thấp so với ngƣời hút thuốc Nguy hút thuốc liên quan đến lƣợng thuốc hút, tuổi khởi đầu hút, tổng số gói thuốc hút nhiều năm tình trạng hút thuốc tại, có ý nghĩa tiên lƣợng tử vong COPD Không phải tất ngƣời hút thuốc mắc bệnh COPD Điều gợi ý bên cạnh yếu tố di truyền, phải có tác động nguy gây COPD Hút thuốc gây ức chế antiproteases kích thích bạch cầu đa nhân phóng men tiêu protein Nguy tử vong bệnh COPD gia tăng gấp 30 lần ngƣời hút thuốc nặng ( > 25 điếu/ngày ) so với ngƣời khơng hút thuốc Hút thuốc thụ động góp phần gây triệu chứng hô hấp bệnh COPD Hút thuốc lúc mang thai ảnh hƣởng đến phát triển hình thành thai nhi ảnh hƣởng hệ thống miễn dịch Theo Robert M Senior ( 2002 ) có 10-20% ngƣời hút thuốc thời gian dài tiến triển thành COPD, nguyên nhân gây nhạy cảm cao với thuốc chƣa đƣợc biết, nhƣng yếu tố di truyền đóng vai trò chủ yếu Phổi nhiễm nghề nghiệp bao gồm bụi vô hữu tác nhân hóa chất hóa học Theo hiệp hội lồng ngực Mỹ (ATS) phơi nhiễm nghề nghiệp khoảng 10-20% có triệu chứng suy giảm chức phổi COPD Ô nhiễm nhà đốt, nấu nƣớng mơi trƣờng khơng thơng thống, yếu tố nguy gây COPD, thƣờng gặp ngƣời phụ nữ nƣớc phát triển Tần suất COPD cao ngƣời phụ nữ nấu nƣớng nội trợ không hút thuốc nƣớc Trung Đông, Châu Phi Châu Á Vai trị nhiễm khơng khí gây COPD khơng rõ ràng Tuy nhiên có tỉ lệ nhỏ COPD ô nhiễm môi trƣờng gây ra, tỉ lệ thấp so với nguy hút thuốc Ơ nhiễm khơng khí từ việc đốt cháy nhiên liệu xe cộ lƣu thơng có ảnh hƣởng xấu, làm giảm chức hô hấp Bệnh COPD đƣợc hình thành tác động qua lại gene môi trƣờng; hai ngƣời với tiền sử hút thuốc nhƣ nhau, ngƣời phát triển thành COPD khác biệt gene thời gian sống họ quang Đƣờng thẳng cắt ngang cƣờng độ huỳnh quang gọi đƣờng Một thông số quan trọng phản ứng Realtime chu kì ngƣỡng Ct (threshold cycle) Ct giá trị chu kì nhiệt mà tín hiệu cƣờng độ huỳnh quang sản phẩm vƣợt đƣờng Nếu số lƣợng trình tự đích phản ứng nhiều số lần khuếch đại (số chu kì nhiệt) để đạt đến ngƣỡng phát tín hiệu cƣờng độ huỳnh quang máy thấp so với số lƣợng Do đó, Ct thấp số lƣợng trình tự mục tiêu ban đầu nhiều Nhƣ vậy, giá trị Ct tỷ lệ nghịch với số lƣợng trình tự đích 1.6.2.2 Chất phát huỳnh quang Có nhiều chất phát huỳnh quang khác đƣợc sử dụng phản ứng Realtime PCR nhƣ màu huỳnh quang chèn nhƣ SYBR, đoạn dị đặc hiệu cho trình tự đích nhƣ Beacon, Taqman Trong nghiên cứu sử dụng chất chèn huỳnh quann SYBR Nguyên tắc Màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA loại màu huỳnh quang có lực cao có diện sợi đơi DNA lực khả chèn màu vào sợi đôi DNA làm cho sợi đôi DNA phát đƣợc ánh sáng huỳnh quang nhận đƣợc nguồn sáng kích thích Nguyên tắc kỹ thuật khơng có diện sản phẩm khuếch đại PCR, chất huỳnh quang bị phân tán dung dịch PCR mix, mà tube phản ứng không bị phát huỳnh quang hay phát huỳnh quang không đáng kể bị chiếu nguồn sáng kích thích Nhƣng có diện sản phẩm khuếch đại PCR màu huỳnh quang bị chèn vào tập trung sợi đôi DNA sản phầm khuếch đại làm cho tube phản ứng bị phát huỳnh quan bị chiếu nguồn sáng kích thích Ethidium bromide đƣợc sử dụng cho nguyên tắc real-time PCR này, nhƣng sau này, hợp chất có nhiều tính ƣu việt thân thiện SYBR I đƣợc khám phá SYBR I mang nhiều ƣu điểm vƣợt trội nhƣ màu huỳnh quang thấp, khả chèn vào sợi đôi cao nhƣng không làm cho sợi đôi bị gắn chặt vào bị biến tính nhờ mà ảnh hƣởng lên hiệu PCR Phổ quang học SYBR có bƣớc sóng 488 nm cho nguồn sáng khích thích bƣớc sóng phát 522 nm Ƣu điểm:  Độ đặc hiệu độ nhạy cao  Nhanh  Phát đƣợc đột biến điểm 1.6.2.3 Chƣơng trình phân tích nhiệt độ chảy Vì SYBR I màu chèn cho sợi đôi DNA xuất ống phản ứng sau chu kỳ nhiệt kể sợi đôi DNA khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích, xuất đƣờng biểu diễn khuếch đại ống phản ứng khơng đặc hiệu 100% cho có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích Nhƣ ống phản ứng, sản phẩm khuếch đại thƣờng xuất mà khơng phải sản phẩm khuếch đại từ dimer primer, thƣờng xảy vào giai đoạn cuối chu kì nhiệt, mà enzyme Taq polymerase hoạt động khơng hiệu đặc hiệu Dimer primer bắt cặp lẫn mồi có vị trí trình tự mồi mang base bổ sung đƣợc với Tuy nhiên chu kỳ đầu mà enzyme polymerase cịn hoạt động hiệu khơng tạo đƣợc sản phẩm khuếch đại đặc hiệu kéo dài hai mồi chúng bắt cặp lẫn vài vị trí nucleotide mà không bắt cặp đƣợc đầu 3’ Tuy nhiên giai đoạn cuối PCR, enzyme polymerase trở nên hoạt động hữu hiệu nên kéo dài đƣợc mồi chúng bắt cặp lẫn dù đầu 3’ mồi khơng có bắt cặp đặc hiệu với nhau, nên tạo đƣợc sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu từ dimer primer Sản phẩm khuếch đại từ dimer primer khác biệt với sản phẩm khuếch đại từ DNA đích chiều dài, từ dimer primer chiều dài khơng vƣợt q 50-55 bps, cịn từ DNA đích chiều dài thƣờng q 100bp Nhƣ vậy, để phân biệt đƣợc đƣờng biểu diễn khuếch đại ống phản ứng sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích hay từ dimer primer, phải dựa vào tính chất đặc trƣng giúp phân biệt đƣợc chiều dài hai loại sản phẩm khuếch đại này, tính chất đặc trừng nhiệt độ nóng chảy (melting T, Tm) nhiệt độ làm cho sợ đồi DNA bị biến tính 50% tức có 50% số sợi đơi bị biến tính hồn tồn Nhiệt độ chảy sợi đôi DNA tuỳ thuộc vào thành phần GC chiều dài nó: Thành phần GC cao Tm cao, sợi đơi dài Tn cao Sản phẩm khuếch đại từ DNA đích dài nên có Tm cao Tm sản phẩm khuếch đại từ dimer primer Để biết đƣợc Tm sản phẩm khuếch đại có ống phản ứng, sau hoàn tất chu kỳ luân nhiệt realtime PCR, cần tiếp tục phân tíchcho máy chạy thêm chƣơng trình phân tích nhiệt độ chảy, gọi chƣơng trình melt-curve Tuỳ thuộc vào loại máy realtime PCR mà sử dụng chƣơng trình cài sẵn máy, tự tạo chƣơng trình melt curve mà thấy thích hợp Phân tích thay đổi biểu đồ chảy, cƣờng độ huỳnh quang ống phản ứng thay đổi với cƣờng độ huỳnh quang phát giảm dần theo bƣớc tăng nhiệt độ buồng ủ nhiệt, lý sản phẩm khuếch đại có ống phản ứng bị biến tính dần theo gia tăng nhiệt độ buồng ủ nhiệt đến bƣớc tăng nhiệt độ mà trùng khớp với Tm sản phẩm khuếch đại ống phản ứng cƣờng độ huỳnh quang giảm đột ngột có đến 50% sản phẩm khuếch đại bị biến tính thành sợi đơn lúc, bƣớc nhiệt độ thấy đƣờng biểu diễn cƣờng độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng khơng cịn đƣờng thẳng xuống nhƣ trƣớc mà bị lao dốc xuống thấp nhiều so với độ dốc Nhờ mà ngƣời làm thí nghiệm quan sát diễn tiến trình vẽ realtime biểu đồ chảy, hồn tồn xác định đƣợc Tm sản phẩm khuếch đại có ống phản ứng CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 2.1 Mẫu đàm thu nhận từ bệnh nhân đƣợc lƣu thông tin theo tên, tuổi, ngày nhận mẫu đƣợc mã hóa theo ký hiệu phịng thí nghiệm Phịng thí nghiệm khơng nắm giữ thơng tin khác liên quan đến bệnh nhân Mẫu bệnh nhân đƣợc chia thành hai nhóm, nhóm ngƣời: nhóm đối chứng (ngƣời khỏe mạnh) nhóm bệnh nhân COPD 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Thiết bị - Dụng cụ  Máy ly tâm thƣờng (Eppendorf, Đức)  Máy PCR (Mastercycler® vapo protect, Eppendorf, Đức)  Máy spin (Hanil, Đức)  Máy vortex (Heidolph, Đức)  Máy Real time AG 22331 Hamburg (Erpendorf, Đức)  Tủ ATSH cấp II (ESCO Labculture®, Hoa Kì)  Cân điện tử (Sartorius, Hoa Kì); lị vi sóng (SANYO, Nhật)  Máy điện di (ADVANCE, Mupid®-exU System, Đức)  Máy đọc gel UV (UVP, GelDoc-It® 310, Hoa Kì)  Tủ mát 4oC tủ đơng -30oC, -80oC (SANYO, Nhật)  Vật liệu tiêu hao 2.2.2 Hóa chất - Kit PCR TaKaRa®Taq HS (Takara, Nhật)  TaKaRa HS Taq (5 units/µl)  10X PCR buffer  100mM Tris-HCl (pH8.3)  500mM KCl  15mM MgCl2  Thành phần dNTP  2,5mM cho loại dNTP  Hịa tan nƣớc có pH 7-9 - Kit SYBR® Green Premix Ex Taq TM (Takara, Nhật) - Nƣớc PCR (MiliQ), dung dịch EDTA 0.5 pH = (Merck, Đức) Điện di 2.2.2.1 2.3  Dung dịch 5X TBE  Tris (Merck, USA): 54g  Acid boric (Merck, USA): 27.5g  0.5M EDTA pH8: 20ml  Nƣớc: thêm đủ 1000 ml (từ dung dịch 5X pha thành 0.5X)  Dung dịch nạp mẫu 6X (Thermo Scientific, Hoa Kì)  Agarose dạng bột (Promega, Hoa Kì)  GelRed Dye (Thẻmo Scientific, Hoa Kì)  Thang DNA 1kbplus (0.5 µg/µL) (Thermo Scientific, Hoa Kì) Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Thiết kế mồi Bộ mồi sử dụng tham khảo từ nghiên cứu Chaudhuri cộng để khuếch đại đoạn trình tự nucleotide gen mục tiêu MMP12 (NG_032936) gen chứng nội β-actin (NG_007992.1)(1) Bảng 2.1 Thông số mồi khuếch đại cDNA MMP12 β-actin Tên mồi Trình tự (5’ >3’) GC% Tm (oC) Kích thƣớc MMP12-F MMP12-R β-actin F β-actin R AGGAATCGGGCCTAAAA TTG TGCTTTTCAGTGTTTTGG TGA ACAGAGCCTCGCCTTTG CCG TTGCACATGCCGGAGCC GTT 45 55,77 38 56,77 65 65,51 60 65,76 sản phẩm (bp) 125 108 2.3.2 Tách chiết tế bào từ mẫu đàm Mẫu đàm sau thu nhận đƣợc tách chiết tế bào ngày thu mẫu Huyền phù mẫu đàm với 10ml dung dịch DTT 0,5% xylanh có đầu kim 16G trở thành dung dịch đồng nhất, sau ủ 10 phút nhiệt độ phịng Lọc tồn dung dịch qua màng lọc có kích thƣớc lỗ 40µm (Corning, Mỹ) Đem tồn dịch lọc chuyển vào falcon tube 15ml (Axygen scientific, Mỹ), ly tâm tốc độ 3500 vòng/phút phút Hút bỏ dịch sau ly tâm thực bƣớc rửa mẫu PBS lặp lại hai lần: hòa tan phần lắng với 1ml dung dịch PBS (Sigma, Mỹ), chuyển vào tube 1,5ml, sau đem mẫu ly tâm 10000 vòng/phút 30 giây, hút bỏ dịch Phần lắng sau hai lần rửa đƣợc hịa tan với 125µl PBS cho đạt nồng độ 107 tế bào/µl Trộn mẫu với 375µl Trizol (Life technologies, Mỹ) xylanh với đầu kim 20G Trữ mẫu -80oC thực thí nghiệm 2.3.3 Tách chiết RNA từ tế bào trữ Trizol Rã đông mẫu tế bào trữ Trizol bổ sung 100µl chloroform (Merk, Đức), lắc ủ nhiệt độ phòng 10 phút, sau ly tâm 13000 vịng/phút 15 phút Dung dịch mẫu phân tách thành ba lớp, chuyển 300 µl lớp dung dịch phía (lớp khơng màu, tránh hút lớp protein trắng nằm giữa) vào ống tube 1,5ml đƣợc ký hiệu Bổ sung 300µl isopropanol (Merk, Đức), lắc ủ nhiệt độ phòng phút, sau ủ lạnh 4oC phút Mẫu sau ủ đƣợc ly tâm 4oC với tốc độ 13000 vòng/phút 25 phút, hút bỏ dịch sau ly tâm Bổ sung 800µl Ethanol 70% (Merk, Đức), đƣợc pha nƣớc cất xử lý DEPC, ủ mẫu đá lạnh 10 phút, sau đem ly tâm 4oC với tốc độ 13000 vòng/phút 25 phút Hút bỏ dịch sau ly tâm, phơi khơ tube có chứa mẫu 56oC (mở nắp tube) tube khơ hồn tồn Cho 10µl nƣớc cất lần khử ion xử lý DEPC vào hịa tan mẫu tube Lấy 1µl mẫu đem đo OD máy Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Mỹ) để xác định nồng độ RNA thu đƣợc sau tách chiết Mẫu đƣợc đo bƣớc sóng 260nm, kiểm tra độ tinh RNA theo tỷ lệ OD260nm/ OD280nm , tỷ lệ khoảng 1.8-2.0 mẫu đạt chất lƣợng tốt 2.3.4 Tổng hợp cDNA từ RNA mẫu Pha lỗng RNA mẫu để đạt nồng độ 275ng/µl, sau sử dụng 2µl dung dịch cho phản ứng tổng hợp cDNA Phản ứng tổng hợp cDNA đƣợc thực kit PrimeScriptTM 1st strand cDNA (Takara, Nhật Bản), tất thành phần phản ứng trừ RNA mẫu đƣợc cung cấp kit Pha hỗn hợp A ban đầu vào tube 0,2ml gồm có: 0,5µl Random mers (50µM), 0,5µl dNTP Mixture (10mM), 2µl RNA mẫu (550ng), 2,5 nƣớc khử RNAse Ủ hỗn hợp A 60oC phút, sau chuyển vào đá lạnh ủ phút Pha hỗn hợp B tube 0,2ml đƣợc ký hiệu, gồm có: 5µl hỗn hợp A, 2µl 5X PrimeScript Buffer, 0,3µl RNAse inhibitor (40U/µl), 0,5µl PrimeScript RTase (200 U/µl), 2,2 nƣớc khử RNAse Hỗn hợp B đƣợc ủ theo chu trình nhiệt độ: 30oC 10 phút, 50oC 30 phút, 70oC 15 phút Sau phản ứng thực xong, cDNA đƣợc bảo quản 20oC 2.3.5 Thực phản ứng PCR Mỗi tube PCR tích 15 l chứa thành phần: 1,5μl PCR buffer 10X; 1,5μl dNTP 2,5mM; 0,75μl mồi xuôi ngƣợc (10nM/μl), 0,1μl TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản), 2μl genomic DNA (20-50ng/μl) 8,4μl nƣớc cất lần khử ion Các phản ứng kèm theo chứng âm không chứa DNA để kiểm sốt ngoại nhiễm Chu trình ln nhiệt cho PCR đƣợc thực máy Mastercycler@Pro S (eppendorf, Đức) Chu kỳ nhiệt: khởi đầu 98oC phút, với 40 chu kỳ lặp lại bƣớc 98oC: 15 giây, 58oC: 30 giây; với bƣớc 72oC: phút Trữ sản phẩm PCR 4oC Kiểm tra sản phẩm PCR điện di thạch agarose: Sử dụng thạch agarose 2% cho sản phẩm PCR kích thƣớc ngắn (≤ 2000bp), thạch agarose nhuộm với Gel Red quan sát hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc-ItTM (UVP, Mỹ) Tinh sản phẩm PCR: Tinh trực tiếp sản phẩm PCR ExoSAPIT PCRproduct Cleanup (Life technologies, Mỹ) 2.3.6 Giải trình tự phương pháp Sanger Sản phẩm PCR đƣợc tinh đƣợc thực phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hai chiều mồi xuôi ngƣợc Sản phẩm sau đƣợc kết tủa ethanol tuyệt đối, lạnh, với hỗ trợ tủa muối NH4OAC, hịa tan Hi-Di formaldehyde, biến tính 96C trƣớc làm lạnh đột ngột 4oC Trình tự DNA đƣợc đọc máy ABI 3500 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ) Phân tích kết giải trình tự: Kết giải trình tự đƣợc phân tích phần mềm CLC Main Workbench, so sánh với trình tự chuẩn MMP12 βactin tham khảo từ ngân hàng trình tự gene website NCBI 2.3.7 Qui trình multiplex realtime SYBR Green PCR Xây dựng đƣờng chuẩn với gen mục tiêu MMP12 (NG_032936) gen chứng nội β-actin (NG_007992.1) mẫu cDNA: Xây đựng đƣờng chuẩn với gen mục tiêu MMP12 gen chứng nội β-actin từ mẫu amplicon có nồng độ 1011 Từ nồng độ 1011 amplicon pha loãng thành nồng độ 108, 106, 104, 102 Mỗi nồng độ đƣợc thực với cặp mồi cho gen MMP12 β-actin Phản ứng đƣợc thực loại eppendorf sử dụng cho realtime PCR (Bioplastic, Hà Lan) sử dụng hệ thống máy real-time PCR MasterCycler RealPlex (Eppendorf, Đức) Chu trình nhiệt sử dụng: bƣớc – 95oC: phút, bƣớc 2: lặp lại 40 chu kỳ – 95oC: 15 giây 58oC: 30 giây, bƣớc thực chu trình đo đƣờng cong nóng chảy (95oC: phút, tăng dần nhiệt độ từ 60oC đến 95oC 20 phút) Kết thúc trình chạy real-time, số chu kỳ ngƣỡng (Ct) mẫu đƣợc lƣu trữ sử dụng để xây dựng đƣờng chuẩn Thực Realtime PCR với gen mục tiêu MMP12 gen chứng nội β-actin mẫu cDNA: Phản ứng đƣợc thực kit SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNAseH Plus, Takara, Nhật Bản) theo hƣớng dẫn nhà sản xuất với thành phần phản ứng nhƣ sau: 5µl Master mix, 0,4µl mồi xi, 0,4µl mồi ngƣợc, 1µl cDNA mẫu (25ng), 3,2µl nƣớc cất lần khử ion Mỗi mẫu đƣợc thực với cặp mồi cho gen MMP12 β-actin, tƣơng ứng với cặp mồi mẫu đƣợc lặp lại lần Phản ứng đƣợc thực loại tube eppendorf sử dụng cho realtime PCR (Bioplastic, Hà Lan) sử dụng hệ thống máy real-time PCR MasterCycler RealPlex (Eppendorf, Đức) Chu trình nhiệt sử dụng: bƣớc – 95oC: phút, bƣớc 2: lặp lại 40 chu kỳ – 95oC: 15 giây 58oC: 30 giây Kết thúc trình chạy real-time, số chu kỳ ngƣỡng (Ct) mẫu đƣợc lƣu trữ thực phân tích thống kê 2.4 Thời gian địa điểm thực nghiên cứu Thời gian thực nghiên cứu từ tháng 6/2016 đến tháng 6/2017 Địa điểm thực nghiên cứu: Trung tâm Y Sinh học Phân tử - ĐH Y Dƣợc Tp Hồ Chí Minh, 217 Hồng Bàng, P11, Q5, Tp Hồ Chí Minh CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết giải trình tự gen MMP12 Kết giải trình tự gen MMP12 Hình 3.1 Kết giải trình tự sản phẩm khuếch đại từ cặp mồi MMP12F/MMP12R 3.2 Kết xây dựng đƣờng chuẩn kiểm tra đƣờng cong nóng chảy sản phẩm realtime PCR Bảng 3.1 Kết realtime PCR với nồng độ amplicon MMP12 β-actin pha loãng bậc 100 Nồng độ amplicon Chu kỳ cho qPCR với mồi ngƣỡng Độ lệch chuẩn MMP12 (bản sao) (Ct) 108 8,29 10 7,43 0,49 10 7,47 10 15.4 106 15,49 0,44 10 16,21 10 23,59 104 23,62 0,45 10 24,38 10 30,18 102 29,27 1,25 10 31,7 Nồng độ amplicon Chu kỳ Độ lệch cho qPCR với mồi ngƣỡng (Ct) chuẩn β-actin (bản sao) 108 7,59 10 7,53 0,18 10 7,87 10 15,33 106 15,42 0,08 10 15,48 10 24,03 104 24,03 0,1 10 23,85 10 29,51 102 30,45 0,76 10 31,01 3.3 Kết realtime PCR Bảng 3.2 Kết tách chiết RNA realtime-PCR nhóm mẫu Ct Mã bệnh Nồng độ Ct MMP12 Ct MMP12 Ct MMP12 nhân RNA (ng/ β-actin (lần 1) (lần 2) (lần 3) COPD µl) (lần 1) Ct COPD-144 COPD-145 COPD-146 COPD-147 COPD-148 21,44 22,54 21,89 20,68 19,74 Ct βactin (lần 2) 23,23 24,21 24,15 23,03 21,46 Mã nhóm đối chứng COPD-166 COPD-172 COPD-173 COPD-175 COPD-178 48 185 40 424 397 Nồng độ RNA (ng/ µl) 332 33 129 469 235 28,52 27,87 28,04 29,15 31,05 Ct MMP12 (lần 1) 29,81 31,82 32,11 31,68 29,47 29,38 27,71 29,57 28,47 30,42 Ct MMP12 (lần 2) 29,4 32,2 32,77 36,17 30,38 29,58 29,07 29,21 28,26 32,78 Ct MMP12 (lần 3) 29,47 33,16 33,52 32,22 31,75 21,54 22,81 21,63 20,24 19,66 Ct β-actin (lần 1) 23,24 24,13 24,3 23,34 21,59 β-actin (lần 2) Ct βactin (lần 3) 21,46 24,01 21,81 20,48 20,03 Ct βactin (lần 3) 22,95 24,4 24,45 23,53 21,88 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN Mồi xuôi mồi ngƣợc cho cDNA MMP12 β-actin đƣợc thiết kế dựa trình tự mạch khuôn mRNA MMP12 (NM_002426.5 ) β-actin (NM_001101.4 ) Các mồi đƣợc thiết kế cho vị trí bắt cặp mồi xi mồi ngƣợc nằm exon khác vị trí nối exon để tránh tình trạng mồi bắt cặp lên mạch khuôn DNA gen quan tâm Cặp mồi cho MMP12 (nằm exon 10) khuếch đại đoạn sản phẩm dài 125bp mạch khuôn cDNA nhƣng tạo sản phẩm dài 1070bp mạch khuôn DNA, đo giảm thời gian bắt cặp mồi quy trình ln nhiệt ( 1.8 and A260/A230 > 2.0) đủ số lƣợng (>28 ng/µl) đáp ứng cho quy trình thí nghiệm (5) Từ kết đƣờng cong nóng chảy sản phẩm khuếch đại từ cặp mồi khác (MMP12 β-actin) cho thấy sản phẩm cặp mồi MMP12 khuếch đại có đỉnh nóng chảy 78.4OC sản phẩm cặp mồi β-actin khuếch đại có đỉnh nóng chảy 89.8OC Mỗi sản phẩm tạo đỉnh nóng chảy cho thấy phản ứng real-time PCR xảy đặc hiệu, không khuếch đại sản phẩm phụ tạo primer dimer, tín hiệu huỳnh quang tốt, rõ ràng Kết xây dựng đƣờng chuẩn cho cặp mồi khuếch đại MMP12 β-actin cho thấy hệ số tƣơng quan (correlation coefficient) R2>0.99, điều có nghĩa việc dự đoán giá trị cho mẫu liên quan dựa đồ thị đƣờng chuẩn có giá trị tin cậy cao khẳng định thao tác kỹ thuật có tính đồng lần thí nghiệm lặp lại (4) Chỉ số hiệu suất phản ứng (efficiency) nằm khoảng 90-110% độ dốc (slope) ~ –3.3, cho thấy phản ứng real-time xảy hiệu quả, hóa chất thí nghiệm chất lƣợng cDNA tổng hợp tốt theo số khuyến cáo tiêu chuẩn đánh giá phản ứng real-time PCR hãng hóa chất ThermoFisher Scientific, BioRad, Life Technologies số nghiên cứu khác (4, 6) Độ lệch chuẩn số Ct mẫu sau lần lặp lại nhỏ 0.167 cho thấy tƣơng đối đồng lần thí nghiệm lặp lại, mẫu có độ lệch chuẩn lớn 0.167 bị loại bỏ Theo đồ thị đƣờng chuẩn, hệ số chắn (Y-intercept) ~ 35 cho thấy khả chu kỳ ngƣỡng (Ct) lớn đạt đƣợc 35 mặt lý thuyết, mẫu có giá trị Ct >35 đƣợc cho khơng có biểu gen quan tâm CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Chúng xây dựng thành cơng quy trình phát định lƣợng tƣơng đối biểu gen MMP12 cặp mồi gen chứng nội actin mẫu bệnh phẩm đàm thu nhận từ bệnh nhân Tuy nhiên, cỡ mẫu sử dụng cho nghiên cứu hạn chế, khiến kết nghiên cứu nhiều hạn chế độ nhạy độ lặp lại Cần có nhiều nghiên cứu mở rộng nhằm tăng độ tinh cậy độ ổn định xét nghiệm cách tăng cỡ mẫu nghiên cứu Ngồi ra, nghiên cứu cần phải chuẩn hố số điều kiện ngƣỡng (cut off) có xét nghiệm để phù hợp với quần thể ngƣời Việt Nam chung TÀI LIỆU THAM KHẢO Chaudhuri R, et al (2012) Sputum matrix metalloproteinase-12 in patients with chronic obstructive pulmonary disease and asthma: relationship to disease severity The Journal of allergy and clinical immunology, 129(3):655-663 e658 Chaudhuri R, et al (2013) Sputum matrix metalloproteinase-9 is associated with the degree of emphysema on computed tomography in COPD Translational respiratory medicine, 1(1):11 Churg A, et al (2012) Series "matrix metalloproteinases in lung health and disease": Matrix metalloproteinases in COPD The European respiratory journal, 39(1):197-209 Larionov A, et al (2005) A standard curve based method for relative real time PCR data processing BMC bioinformatics, 6:62 Udvardi MK, et al (2008) Eleven golden rules of quantitative RT-PCR The Plant cell, 20(7):1736-1737 Wong ML, et al (2005) Real-time PCR for mRNA quantitation BioTechniques, 39(1):75-85 ... VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THU? ??T REAL- TIME PCR ĐỂ KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN GEN MMP12 TRONG TẾ BÀO THU TỪ MẪU ĐÀM CỦA BỆNH NHÂN BỊ BỆNH PHỔI TẮC NGHẼN MẠN TÍNH Mã số: Chủ nhiệm đề... tin chung: - Tên đề tài: XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THU? ??T REAL- TIME PCR ĐỂ KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN GEN MMP12 TRONG TẾ BÀO THU TỪ MẪU ĐÀM CỦA BỆNH NHÂN BỊ BỆNH PHỔI TẮC NGHẼN MẠN TÍNH - Mã số: - Chủ nhiệm... Phân tử - Thời gian thực hiện: Tháng 6-2016 đến tháng 6-2017 Mục tiêu: Xây dựng đƣợc quy trình ứng dụng kỹ thu? ??t real- time PCR định lƣợng tƣơng đối biểu gen MMP12 mẫu đàm Nội dung chính: - Thiết