Bệnh đốm trắng gây tác hại rất nghiêm trọng trên tôm sú. Đặc trưng của bệnh là gây nên tỷ lệ chết khá cao và có thể gây chết hàng loạt cho tôm sú nuôi trong thời gian ngắn trên các ao nuôi bị nhiễm bệnh
LỜI CẢM TẠ Xin tạc ghi lịng cơng lao biển trời cha mẹ sinh thành nuôi nấng tơi Tơi xin chân thành cảm tạ: • Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Cơng nghệ sinh học, tất quý Thầy Cô truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học trường • ThS Nguyễn Thái Thủy, ThS Phan Thị Ngọc Thủy hết lịng hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt thời gian thực tập tốt nghiệp • TS Phạm Hùng Vân, chị Phạm Thanh Thùy Trang, chị Võ Thị Thanh Thảo tạo điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ tơi q trình thực tập cơng ty Nam Khoa • TS Nguyễn Hữu Thịnh nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kiến thức quý báu • Ban Giám đốc cơng ty Nam Khoa quý Thầy Cô, cán công chức trẻ Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp • Các bạn bè thân u lớp Cơng nghệ sinh học khóa 27 chia sẻ tơi vui buồn thời gian học hết lịng hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tơi thời gian thực tập Tp Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 08 năm 2005 Phạm Thị Mỹ Hạnh iii TÓM TẮT PHẠM THỊ MỸ HẠNH, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 “PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT REAL – TIME PCR” Hội đồng hướng dẫn: ThS PHAN THỊ NGỌC THỦY ThS NGUYỄN THÁI THỦY Đề tài “Phát định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm sú (Penaeus monodon) kỹ thuật Real - time PCR” thực Công Ty Nam Khoa Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm, Trường Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh từ ngày 01/ 03/ 05 đến ngày 01/ 08/ 05 Đề tài thực đối tượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm sú Virus gây dịch bệnh ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng tôm sú nuôi (Penaeus monodon) giới nước ta Sử dụng kỹ thuật Real - time PCR phát định lượng WSSV tôm sú giai đoạn ni nhằm phát nhanh, xác; định lượng WSSV mẫu tơm sú; góp phần phòng ngừa lây lan bùng phát dịch bệnh đốm trắng Những kết đạt được: • Xác định quy trình ly trích ADN phù hợp cho phản ứng Real – time PCR Non Stop Nested PCR • Ứng dụng thành công phương pháp Real - time PCR để phát định lượng số virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm sú • Xác định khả định lượng xác phương pháp Real – time với độ lặp lại cao • Xác định độ nhạy phương pháp Real - time PCR so với Non Stop Nested PCR • Ứng dụng Real - time PCR để phát định lượng WSSV 30 mẫu tôm sú thu từ thực tiễn giai đoạn ni, có 22 mẫu bị nhiễm WSSV từ nhẹ đến nặng mẫu âm tính bệnh đốm trắng • Bước đầu đánh giá khả thành công ao thả nuôi tôm bị nhiễm WSSV iv SUMMARY PHAM THI MY HANH, Nong Lam University August, 2005 “DETECTION AND QUANTIFICATION OF WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) IN BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) BY USING REAL – TIME PCR” Guidance council: Ms PHAN THI NGOC THUY Ms NGUYEN THAI THUY Thesis “Detection and Quantification of White Spot Syndrome Virus (WSSV) in Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon) by Using Real - time PCR” was carried out in Nam Khoa company and at Chemical & Biological Analysis and Experiment Center of Nong Lam University from March 1st, 2005 to August 1st, 2005 The object of the thesis is White Spot Syndrome Virus (WSSV) in black tiger shrimp This virus has caused an epidermic viral disease outbreak occurred on cultured black tiger shrimp (Penaeus monodon) which had caused severe economic losses to the shrimp production in Vietnam and around the world Using Real – time PCR for detection and quantification WSSV in cultured black tiger shrimp at all stages aims to rapidly, precisely detect and quantify WSSV in cultured black tiger shrimp in order to prevent the occurrence and outspread of the disease outbreak My obtained results include: • An appropriate DNA extraction protocol for Real - time PCR and Non Stop Nested PCR reactions • Successful application of Real - time PCR to detect and quantify WSSV in black tiger shrimp • Capacity of precise WSSV quantification of Real - time PCR with highly repeated results • Comparision the sensitivity of Real - time PCR with Non Stop Nested PCR • Application of Real - time PCR to detect and quantify WSSV in 30 collected samples of cultured black tiger shrimp at all stages The result indicated that there are 22 samples infected with WSSV from very light to severe infection and samples uninfected with WSSV • Preliminary evaluation of the success of cultured ponds stocked with WSSV infected shrimp seeds or cultured shrimp infected with WSSV v MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt .iv Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt x Danh sách hình xii Danh sách bảng xv MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Giới thiệu khái quát tôm sú (Penaeus monodon) .3 2.1.1 Phân loại 2.1.2.Vùng phân bố 2.1.3 Chu kỳ sống 2.2 Tình hình dịch bệnh WSSV giới Việt Nam 2.2.1 Trên giới 2.2.2 Ở Việt Nam 2.3 Bệnh đốm trắng tôm 2.3.1 Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) .7 2.3.1.1 Định danh phân loại 2.3.1.2 Đặc điểm hình thái 2.3.1.3 Đặc tính sinh học 2.3.2 Vật chủ mang mầm bệnh WSSV 2.3.3 Các đường lây truyền WSSV 2.3.4 Cơ chế xâm nhập 10 2.3.5 Triệu chứng bệnh 10 vi 2.3.6 Phương pháp chẩn đoán 11 2.4 Phương pháp PCR cải tiến 12 2.4.1 Phương pháp PCR 12 2.4.1.1 Nguyên tắc 12 2.4.1.2 Các thành phần phản ứng PCR 13 2.4.1.3 Các bước phản ứng .13 2.4.1.4 Ứng dụng 14 2.4.1.5 Ưu nhược điểm 14 2.4.2 Kỹ thuật Nested PCR .15 2.4.2.1 Nguyên tắc 15 2.4.2.2 Ưu nhược điểm 16 2.4.3 Kỹ thuật Real - time PCR 16 2.4.3.1 Lịch sử phát triển 16 2.4.3.2 Khái niệm 17 2.4.3.3 Nguyên tắc 17 2.4.3.4 Hệ thống Real - time PCR 17 2.4.3.5 Phương pháp phát tín hiệu Real - time PCR .18 2.4.3.6 Nguyên lý định lượng kỹ thuật Real - time PCR 22 2.4.3.7 Ưu nhược điểm 23 2.4.3.8 Ứng dụng 23 3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 25 3.1.1 Thời gian thực 25 3.1.2 Địa điểm thu mẫu 25 3.1.3 Địa điểm phân tích mẫu 25 3.2 Nội dung nghiên cứu 25 3.3 Nguyên vật liệu 25 3.3.1 Mẫu xét nghiệm .25 3.3.2 Trang thiết bị, dụng cụ hoá chất 26 3.3.2.1 Trang thiết bị dụng cụ 26 3.3.2.2 Hoá chất 27 vii 3.4 Phương pháp nghiên cứu 28 3.4.1 Thu mẫu bảo quản mẫu .28 3.4.2 Ly trích mẫu 28 3.4.2.1 Pha dung dịch tách chiết .28 3.4.2.2 Tiến hành ly trích .29 3.4.3 Tiến hành thực Real - time PCR 30 3.4.3.1 Chuẩn bị hỗn hợp để thực phản ứng Real - time PCR 30 3.4.3.2 Thiết lập chương trình thực Real - time PCR phần mềm máy iCycler iQ 30 3.4.3.3 Chạy Real - time PCR 31 3.4.3.4 Phân tích kết hình máy vi tính 31 3.4.4 Thực Non Stop Nested PCR 33 3.4.4.1 Chuẩn bị hỗn hợp để thực phản ứng Non Stop Nested PCR 33 3.4.4.2 Thiết lập chương trình thực Non Stop Nested PCR phần mềm máy iCycler 33 3.4.4.3 Chạy Non Stop Nested PCR .33 3.4.4.4 Điện di phân tích kết .34 3.4.5 Cách đọc kết 36 3.4.5.1 Real - time PCR 36 3.4.5.2 Non Stop Nested PCR 39 3.5 Bố trí thí nghiệm .40 3.5.1 Thí nghiệm 1: thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix 40 3.5.2 Thí nghiệm 2: sử dụng phương pháp Real - time PCR kiểm tra phát virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) 15 mẫu xác định dương tính, âm tính với WSSV 41 3.5.3 Thí nghiệm 3: khảo sát tính định lượng phương pháp Real - time PCR 42 3.5.4 Thí nghiệm 4: khảo sát độ nhạy phương pháp Real - time PCR viii Non Stop Nested PCR 43 3.5.5 Thí nghiệm 5: ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV 30 mẫu tôm thu từ thực tế 43 3.5.6 Thí nghiệm 6: theo dõi tình trạng thu hoạch ao ni tơm thu mẫu kiểm tra .44 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 4.1 Kết thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix 45 4.2 Kết sử dụng phương pháp Real - time PCR kiểm tra phát virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) 15 mẫu xác định dương tính, âm tính với WSSV 46 4.3 Kết khảo sát tính định lượng phương pháp Real - time PCR 53 4.4 Kết khảo sát độ nhạy phương pháp Real - time PCR Non Stop Nested PCR 57 4.5 Kết ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV 30 mẫu tôm thu từ thực tế 60 4.6 Kết theo dõi tình trạng thu hoạch ao nuôi tôm thu mẫu kiểm tra 67 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .70 5.1 Kết luận 70 5.2 Đề nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 75 Phụ lục A TRỌNG LƯỢNG MẪU LY TRÍCH 75 Phụ lục B HÌNH ẢNH VÀ SỐ LIỆU THƠ KẾT QUẢ CHẠY REAL – TIME PCR VÀ NON STOP NESTED PCR 76 Phụ lục C CÁC THUẬT TỪ THƯỜNG DÙNG TRONG REAL – TIME PCR .88 Phụ lục D CÁC BƯỚC VẬN HÀNH MÁY iCycler iQ 90 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TIẾNG VIỆT ADN: acid deoxyribonucleic KHCN: Khoa học Công nghệ NTTS: nuôi trồng Thủy sản Copy number: số Correlation coefficient: hệ số tương quan (r2) Ct: threshold cycle: chu kỳ ngưỡng - chu kỳ tín hiệu huỳnh quang vượt qua tín hiệu Cycle: chu kỳ Log starting quantity: log số lượng ban đầu MK: thang ADN chuẩn (ADN marker) N/A: not available: kết âm tính, khơng xác định PCR baseline subtracted CF RFU: nồng độ huỳnh quang đo suốt phản ứng PCR trừ tín hiệu PCR efficiency: hiệu phản ứng PCR PL: Postlarvae – hậu ấu trùng tôm SD: standard deviation: độ lệch chuẩn Slope: độ nghiêng Std: standard: chuẩn SQ: starting quantity: số lượng ban đầu Unknown: mẫu cần kiểm tra (các hiển thị tương ứng với chu kỳ ngưỡng log số ban đầu nằm đường chuẩn) DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TIẾNG ANH x bp: base pair CCD: charge coupled device dNTP: 2’ – deoxynucleoside – 5’ - triphosphate EDTA: ethylen diamine tetraacetic acid FAO: Food and Agriculture Organization FRET: fluorescence resonance energy transfer MBV: Monodon Baculovirus PCR: polymerase chain reaction RFU: relative fluorescence unit SDS: sodium dodecyl sulfate Taq: Thermus aquaticus TE: tris EDTA UNG: uracil N – glycosylase UV: ultraviolet WSSV: White Spot Syndrome Virus DANH SÁCH CÁC HÌNH xi HÌNH TRANG Hình 2.1 Vịng đời tơm sú Penaeus monodon Hình 2.2 Virus đốm trắng (WSSV) hình que kính hiển vi điện tử Hình 2.3 Virus nhuộm âm huyết tương tôm sú nhiễm bệnh WSSV, số thể virus có .8 Hình 2.4 Hai vịng lây nhiễm virus gây bệnh đốm trắng WSSV ao nuôi 10 Hình 2.5 Tơm sú bị bệnh đốm trắng dạt vào bờ chết 11 Hình 2.6 Vỏ đầu ngực tôm bị bệnh đốm trắng 11 Hình 2.7 Nguyên tắc Nested PCR 15 Hình 2.8 Hệ thống Real - time PCR 17 Hình 2.9 Nguyên tắc hoạt động hệ thống Real - time PCR 18 Hình 2.10 SYBR Green I chèn vào ADN sợi đôi 19 Hình 2.11 Nguyên tắc Molecular Beacons probe .20 Hình 2.12 Nguyên tắc FRET probe 21 Hình 2.13 Nguyên tắc TaqMan probe 22 Hình 3.1 Máy ly tâm vortex mixer .26 Hình 3.2 Máy nhiệt khô 26 Hình 3.3 Máy iCycler 26 Hình 3.4 Bộ kit Real - time PCR phát WSSV tơm 27 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ huỳnh quang số chu kỳ 36 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn 37 Hình 3.7 Kết điện di qua Non Stop Nested PCR .40 Hình 3.8 Cách pha lỗng mẫu theo hệ số pha loãng bậc 10 41 Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ huỳnh quang số chu kỳ mẫu ly trích theo quy trình 45 Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ huỳnh quang số chu kỳ 12 mẫu tôm sú 46 Hình 4.3 Kết kiểm tra WSSV qua Non Stop Nested PCR 12 mẫu xii tôm sú 47 Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ huỳnh quang số chu kỳ mẫu tôm sú 49 Hình 4.5 Kết Non Stop Nested PCR mẫu tôm sú .49 Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn 12 mẫu tôm sú .50 Hình 4.7 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn mẫu tơm sú .52 Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ huỳnh quang số chu kỳ nồng độ pha loãng lặp lại lần mẫu 53 Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn nồng độ pha loãng lặp lại lần mẫu 54 Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ huỳnh quang số chu kỳ nồng độ pha loãng lặp lại lần mẫu 55 Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn nồng độ pha loãng lặp lại lần mẫu 56 Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ huỳnh quang số chu kỳ mẫu nhiễm WSSV pha loãng từ 10-1 đến 10-8 58 Hình 4.13 Kết kiểm tra Non Stop Nested PCR nồng độ pha loãng mẫu nhiễm WSSV 59 Hình 4.14 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ huỳnh quang số chu kỳ 10 mẫu tôm thu thực tế 61 Hình 4.15 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn 10 mẫu tôm thu thực tế .62 Hình 4.16 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ huỳnh quang số chu kỳ 10 mẫu tôm thu thực tế 63 Hình 4.17 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn 10 mẫu tôm thu thực tế .64 Hình 4.18 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ huỳnh quang số chu kỳ 10 mẫu tôm thu thực tế lại .65 Hình 4.19 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn 10 mẫu tơm thu thực tế cịn lại 66 SƠ ĐỒ xiii Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bước phản ứng chuỗi polymerase 14 Sơ đồ 3.1 Quy trình thực Real - time PCR 32 Sơ đồ 3.2 Quy trình thực Non Stop Nested PCR 35 DANH SÁCH CÁC BẢNG xiv BẢNG TRANG Bảng 2.1 Các chủng virus gây bệnh đốm trắng .8 Bảng 3.1 Bảng kết kiểm tra mẫu qua Real - time PCR .39 Bảng 4.1 Kết kiểm tra WSSV 12 mẫu tôm sú 48 Bảng 4.2 Kết kiểm tra mẫu tôm sú 50 Bảng 4.3 Số ban đầu trung bình 12 mẫu tôm sú sau hai lần lặp lại 51 Bảng 4.4 Số ban đầu trung bình mẫu tơm sú sau hai lần lặp lại 52 Bảng 4.5 Độ lệch chuẩn số ban đầu trung bình nồng độ pha loãng mẫu sau lần lặp lại 54 Bảng 4.6 Độ lệch chuẩn số ban đầu trung bình nồng độ pha loãng mẫu sau lần lặp lại 57 Bảng 4.7 Kết chạy Real - time PCR Non Stop Nested PCR mẫu tôm nhiễm WSSV nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-8 60 Bảng 4.8 Độ lệch chuẩn số ban đầu trung bình 10 mẫu tơm thu thực tế 62 Bảng 4.9 Số ban đầu 10 mẫu tôm thu thực tế .64 Bảng 4.10 Số chu kỳ ngưỡng số ban đầu 10 mẫu tơm thu thực tế cịn lại 66 Bảng 4.11 Bảng kết theo dõi tình trạng thu hoạch ao ni tơm thu mẫu kiểm tra 68 xv ... “PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT REAL – TIME PCR? ?? Hội đồng hướng dẫn: ThS PHAN THỊ NGỌC THỦY ThS NGUYỄN THÁI THỦY Đề tài ? ?Phát. .. tượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) tôm sú Virus gây dịch bệnh ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng tôm sú nuôi (Penaeus monodon) giới nước ta Sử dụng kỹ thuật Real - time PCR phát định lượng. .. ứng Real – time PCR Non Stop Nested PCR • Ứng dụng thành cơng phương pháp Real - time PCR để phát định lượng số virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) tơm sú • Xác định khả định lượng xác phương pháp Real