THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon

MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ......................................................................................................... iii Tóm tắt ..............................................................................................................vi Mục lục ................................................................ ................................ .............. v Danh sách các hình ......................................................................................... viii Danh sách các bảng và sơ đồ ................................ ............................................ix PHẤN 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................... 1 1.2 Mục đích, yêu cầu ................................ ............................................. 2 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 2.1 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới ................................................ 3 2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh tôm ở Việt Nam. ................................... 4 2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch của tôm sú .......................................... 6 2.4 Khái quát về bệnh đốm trắng và virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú ....................................................... 7 2.4.1 Tác nhân gây bệnh ................................................................ 7 2.4.2 Khu vực phân bố................................................................... 7 2.4.3 Ký chủ .................................................................................. 8 2.4.4 Điều kiện phát sinh và đường lây truyền ............................... 8 2.4.5 Cơ chế xâm nhập ................................................................ .. 9 2.4.6 Bệnh lý ................................................................................. 9 2.5 Một số phương pháp dùng chẩn đoán bệnh đốm trắng hiện nay ....... 10 2.5.1 Một số phương pháp phổ biến ............................................. 10 2.5.2 Sơ lược về phương pháp PCR và Realtime PCR ................. 10 2.6 Một số dạng hợp chất ở thực vật ...................................................... 11 2.6.1 Alkaloid .............................................................................. 11 vi 2.6.2 Flavonoid................................ ................................ ............ 12 2.7 Một số công trình nghiên cứu và sử dụng thực vật trong phòng trị bệnh cho các đối tượng thuỷ sản.............................. 12 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 15 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ...................................................... 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu ......................................................................... 15 3.2.1 Vật liệu sinh học ................................................................. 15 3.2.2 Dụng cụ và hoá chất ........................................................... 15 3.2.2.1 Dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm.......... 15 3.2.2.2 Dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm ướt ... 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................. 16 3.3.1 Phương pháp ly trích và thu dịch chiết virus ...................... 16 3.3.2 Phương pháp cảm nhiễm virus trên tôm .............................. 16 3.3.3 Phương pháp thu mẫu ................................ ......................... 16 3.3.4 Phương pháp PCR .............................................................. 16 3.3.4.1 Phương pháp PCR định tính ................................... 16 3.3.4.2 Phương pháp PCR định lượng ................................ 17 3.3.5 Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường ................ 17 3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm ........................................................ 18 3.4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng ............................... 18 3.4.2 Thử nghiệm các hợp chất sàng lọc khi tiêm trực tiếp hỗn hợp dich virus và hợp chất vào tôm ............................ 19 PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................... 20 4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng ................................ .................. 20 4.1.1 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất D 2 .................................. 20 4.1.2 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất B .................................... 21 4.1.3 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất M ................................... 23 vii 4.2 Kết quả thử nghiệm sau khi tiêm trên tôm hỗn hợp virus WSSV và hợp chất D 2, B ở các nồng độ khác nhau ................................. 23 4.2.1 Kết quả thử nghiệm hợp chất D 2 ......................................... 27 4.2.2 Kết quả thử nghiệm hợp chất B ........................................... 29 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 32

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * * * KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỨC THÀNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. Lý Thị Thanh Loan Nguyễn Đức Thành Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 iii LỜI CẢM TẠ Trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp, tôi đã gặp những khó khăn nhất định nhưng nhờ sự hướng dẫn và giúp đỡ của mọi người khóa luận đã được hoàn thành. Tôi xin chân thành cảm tạ:  Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại trường.  TS Lý Thị Thanh Loan, ThS Nguyễn Hoàng Phượng Uyên đã hết lòng hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp.  Các anh chị tại Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản 2 và các anh chị tại Trại Thực nghiệm Thủy sản Thủ Đức đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.  Ban Giám đốc và các anh chị công ty Nam Khoa.  Các bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ Sinh học 27 đã chia sẻ vui buồn trong quá trình học tập và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iv TÓM TẮT NGUYỄN ĐỨC THÀNH, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)”. Thời gian thực hiện từ tháng 03/2005 – 08/2005. Địa điểm: Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 (RIA 2). Đề tài được thực hiện trên đối tượng là virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) gây bệnh trên tôm sú (Penaeus monodon). Thí nghiệm được bố trí bằng cách trộn chung dịch chiết virus WSSV với các hợp chất chiết xuất từ thảo dược ở các nồng độ khác nhau, sau đó kiểm tra tác dụng của các hợp chất đối với virus WSSV. Sau khi sàng lọc, tiến hành thử nghiệm hiệu quả tác dụng của các hợp chất này lên virus WSSV bằng cách tiêm hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất vào cơ thể tôm thí nghiệm. Đánh giá tác dụng của các hợp chất dựa vào kết quả Reatime PCR và tỷ lệ sống của tôm thí nghiệm. Kết quả đạt được sau khi thí nghiệm với các hợp chất ký hiệu D 2 , B, M: Ở các nồng độ thử nghiệm là 2,5 (mg/ml), 5 (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml): Hợp chất M chưa đủ liều lượng để có thể tác dụng lên lớp vỏ protein của virus hoặc không có hiệu quả tác dụng đối với virus. Hợp chất B và D 2 có tác dụng lên virus WSSV ở những nồng độ 2,5 (mg/ml), 5 (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml). v MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ . iii Tóm tắt vi Mục lục v Danh sách các hình . viii Danh sách các bảng và sơ đồ ix PHẤN 1 MỞ ĐẦU . 1 1.1 Đặt vấn đề . 1 1.2 Mục đích, yêu cầu . 2 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới 3 2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh tôm ở Việt Nam. . 4 2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch của tôm sú 6 2.4 Khái quát về bệnh đốm trắng và virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú . 7 2.4.1 Tác nhân gây bệnh 7 2.4.2 Khu vực phân bố . 7 2.4.3 Ký chủ 8 2.4.4 Điều kiện phát sinh và đường lây truyền . 8 2.4.5 Cơ chế xâm nhập 9 2.4.6 Bệnh lý . 9 2.5 Một số phương pháp dùng chẩn đoán bệnh đốm trắng hiện nay . 10 2.5.1 Một số phương pháp phổ biến . 10 2.5.2 Sơ lược về phương pháp PCR và Realtime PCR . 10 2.6 Một số dạng hợp chất ở thực vật 11 2.6.1 Alkaloid 11 vi 2.6.2 Flavonoid 12 2.7 Một số công trình nghiên cứu và sử dụng thực vật trong phòng trị bệnh cho các đối tượng thuỷ sản 12 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 15 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu . 15 3.2.1 Vật liệu sinh học . 15 3.2.2 Dụng cụ và hoá chất . 15 3.2.2.1 Dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm 15 3.2.2.2 Dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm ướt . 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu . 16 3.3.1 Phương pháp ly trích và thu dịch chiết virus 16 3.3.2 Phương pháp cảm nhiễm virus trên tôm 16 3.3.3 Phương pháp thu mẫu . 16 3.3.4 Phương pháp PCR 16 3.3.4.1 Phương pháp PCR định tính . 16 3.3.4.2 Phương pháp PCR định lượng 17 3.3.5 Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường 17 3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 18 3.4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng . 18 3.4.2 Thử nghiệm các hợp chất sàng lọc khi tiêm trực tiếp hỗn hợp dich virus và hợp chất vào tôm 19 PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . 20 4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng 20 4.1.1 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất D 2 20 4.1.2 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất B 21 4.1.3 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất M . 23 vii 4.2 Kết quả thử nghiệm sau khi tiêm trên tôm hỗn hợp virus WSSV và hợp chất D 2 , B ở các nồng độ khác nhau . 23 4.2.1 Kết quả thử nghiệm hợp chất D 2 . 27 4.2.2 Kết quả thử nghiệm hợp chất B . 29 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 32 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNA WSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất D 2 trong thời gian 2 giờ 20 Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNA WSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất B trong thời gian 2 giờ . 21 Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNA WSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất M trong thời gian 2 giờ 22 H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất D 2 trước thí nghiệm . 28 H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất D 2 sau thí nghiệm . 28 H ình 4.5 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất B trước thí nghiệm . 30 H ình 4.6 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất B sau thí nghiệm 30 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ BẢNG .TRANG Bảng 2.1 Tên một số quốc gia và năm xuất hiện bệnh đốm trắng 3 Bảng 2.2 Đánh giá khả năng phát hiện bệnh đốm trắng bằng các phương pháp khác nhau 10 Bảng 4.1 Các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm 24 Bảng 4.2 Kết quả ghi nhận tỷ lệ tôm chết ở các lô trong quá trình thí nghiệm . 25 Bảng 4.3 Kết quả Realtime PCR so sánh chu kỳ ngưỡng và hàm lượng DNA của mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất trước thí nghiệm và sau thí nghiệm 26 SƠ ĐỒ .TRANG Sơ đồ 3.1 Bố trí thí nghiệm sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). 18 Sơ đồ 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau. . 19 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề. Trong những thập kỷ qua, nhu cầu sử dụng thực phẩm có nguồn gốc động vật, đặc biệt là các sản phẩm thủy sản ngày càng tăng cao. Vì thế, sản lượng thủy sản không thể đáp ứng được nhu cầu thị trường, trong khi nguồn lợi thủy sản ngày càng giảm do khai thác quá mức. Trước tình hình đó việc phát triển tự phát nghề nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là sự bùng phát nghề nuôi tôm biển là một thực tế khách quan và là một nhu cầu cần thiết. Nghề nuôi trồng thủy sản nước ta cũng phát triển mạnh trong vài thập kỷ gần đây, đặc biệt là nghề nuôi tôm ở các tỉnh ven biển. Nghề nuôi tôm nước ta phát triển chủ yếu mang tính tự phát, nguồn vốn và kỹ thuật nuôi còn hạn chế. Điều đó dẫn đến sự suy thoái môi trường nuôi cùng sự bùng phát và lây lan của dịch bệnh. Khoảng 20 năm gần đây, dịch bệnh tôm xảy ra ở khắp nơi gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm. Một trong những bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đó là bệnh đốm trắng ( White Spot Desease ) do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). Thiệt hại có thể lên đến 100 % quần đàn từ 3 - 7 ngày kể từ khi phát hiện tôm bệnh. Có nhiều phương pháp phòng trị bệnh đốm trắng như dùng chế phẩm sinh học, hoá chất, thuốc… nhưng còn tồn tại nhiều mặt hạn chế và mức độ thành công chưa cao. Việt Nam là nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nên khu hệ thực vật rất phong phú. Thảo dược từ xưa đã được ứng dụng phòng trị bệnh có hiệu quả trong y học và thú y. Tuy nhiên trong lĩnh vực thuỷ sản thì chưa được ứng dụng rộng rãi. Thử nghiệm một số hợp chất thảo dược trong phòng trị bệnh ở các đối tượng nuôi thuỷ sản là hướng nghiên cứu mới và cần khai thác. Được sự đồng ý của Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thuỷ sản khu vực Nam Bộ (MCE) thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II (RIA 2) và Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh cùng các thầy cô hướng dẫn, chúng tôi thực hiện khoá luận tốt nghiệp: “Thử nghiêm một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong phòng trị bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)” . trường thu c Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thu sản 2 và các anh chị tại Trại Thực nghiệm Thủy sản Thủ Đức đã giúp đỡ và tạo điều kiện thu n lợi cho tôi trong su t. có hiệu quả trong y học và thú y. Tuy nhiên trong lĩnh vực thu sản thì chưa được ứng dụng rộng rãi. Thử nghiệm một số hợp chất thảo dược trong phòng trị