KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) pdf
Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 42 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
42
Dung lượng
1,34 MB
Nội dung
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
* * * * * * *
KHÓA LUẬNTỐTNGHIỆP
THỬ NGHIỆMMỘTSỐHỢPCHẤTCHIẾTXUẤTTỪTHẢO
DƯỢC TRONGPHÒNGTRỊBỆNHĐỐMTRẮNGDOVIRUS
GÂY HỘICHỨNGĐỐMTRẮNG(WSSV)TRÊNTÔMSÚ
(Penaeus monodon)
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỨC THÀNH
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2005
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
* * * * *
THỬ NGHIỆMMỘTSỐHỢPCHẤTCHIẾTXUẤTTỪTHẢO
DƯỢC TRONGPHÒNGTRỊBỆNHĐỐMTRẮNGDOVIRUS
GÂY HỘICHỨNGĐỐMTRẮNG(WSSV)TRÊNTÔMSÚ
(Penaeus monodon)
Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. Lý Thị Thanh Loan Nguyễn Đức Thành
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2005
iii
LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp, tôi đã gặp những khó khăn nhất định
nhưng nhờ sự hướng dẫn và giúp đỡ của mọi người khóaluận đã được hoàn thành. Tôi
xin chân thành cảm tạ:
Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt cho
tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại trường.
TS Lý Thị Thanh Loan, ThS Nguyễn Hoàng Phượng Uyên đã hết lòng hướng
dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp.
Các anh chị tại Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường thuộc Viện
Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản 2 và các anh chị tại Trại Thực nghiệm Thủy
sản Thủ Đức đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian
thực tập tốt nghiệp.
Ban Giám đốc và các anh chị công ty Nam Khoa.
Các bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ Sinh học 27 đã chia sẻ vui buồn trong
quá trình học tập và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.
iv
TÓM TẮT
NGUYỄN ĐỨC THÀNH, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005.
“THỬ NGHIỆMMỘTSỐHỢPCHẤTCHIẾTXUẤTTỪTHẢODƯỢCTRONG
PHÒNG TRỊBỆNHĐỐMTRẮNGDOVIRUSGÂYHỘICHỨNGĐỐMTRẮNG
(WSSV) TRÊNTÔMSÚ(Penaeus monodon)”.
Thời gian thực hiện từ tháng 03/2005 – 08/2005.
Địa điểm: Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa
Dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 (RIA 2).
Đề tài được thực hiện trên đối tượng là virusgâyhộichứngđốmtrắng(WSSV)
gây bệnhtrêntômsú(Penaeus monodon). Thí nghiệmđược bố trí bằng cách trộn
chung dịch chiếtvirus WSSV với các hợpchấtchiếtxuấttừthảodược ở các nồng độ
khác nhau, sau đó kiểm tra tác dụng của các hợpchất đối với virus WSSV. Sau khi
sàng lọc, tiến hành thửnghiệm hiệu quả tác dụng của các hợpchất này lên virus
WSSV bằng cách tiêm hỗn hợp dịch virus WSSV và hợpchất vào cơ thể tôm thí
nghiệm. Đánh giá tác dụng của các hợpchất dựa vào kết quả Reatime PCR và tỷ lệ
sống của tôm thí nghiệm.
Kết quả đạt được sau khi thí nghiệm với các hợpchất ký hiệu D
2
, B, M:
Ở các nồng độthửnghiệm là 2,5 (mg/ml), 5 (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml):
Hợp chất M chưa đủ liều lượng để có thể tác dụng lên lớp vỏ protein của virus
hoặc không có hiệu quả tác dụng đối với virus.
Hợpchất B và D
2
có tác dụng lên virus WSSV ở những nồng độ 2,5 (mg/ml),
5 (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml).
v
MỤC LỤC
CHƯƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt vi
Mục lục v
Danh sách các hình viii
Danh sách các bảng và sơđồ ix
PHẤN 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích, yêu cầu 2
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Tình hình dịch bệnhtômtrên thế giới 3
2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnhtôm ở Việt Nam. 4
2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch của tômsú 6
2.4 Khái quát về bệnhđốmtrắng và virusgây
hội chứngđốmtrắngtrêntômsú 7
2.4.1 Tác nhân gâybệnh 7
2.4.2 Khu vực phân bố 7
2.4.3 Ký chủ 8
2.4.4 Điều kiện phát sinh và đường lây truyền 8
2.4.5 Cơ chế xâm nhập 9
2.4.6 Bệnh lý 9
2.5 Mộtsố phương pháp dùng chẩn đoán bệnhđốmtrắng hiện nay 10
2.5.1 Mộtsố phương pháp phổ biến 10
2.5.2 Sơ lược về phương pháp PCR và Realtime PCR 10
2.6 Mộtsố dạng hợpchất ở thực vật 11
2.6.1 Alkaloid 11
vi
2.6.2 Flavonoid 12
2.7 Mộtsố công trình nghiên cứu và sử dụng thực vật
trong phòngtrịbệnh cho các đối tượng thuỷ sản 12
PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 15
3.2 Vật liệu nghiên cứu 15
3.2.1 Vật liệu sinh học 15
3.2.2 Dụng cụ và hoá chất 15
3.2.2.1 Dụng cụ và hóa chấttrongphòng thí nghiệm 15
3.2.2.2 Dụng cụ và hóa chấttrongphòng thí nghiệm ướt 16
3.3 Phương pháp nghiên cứu 16
3.3.1 Phương pháp ly trích và thu dịch chiếtvirus 16
3.3.2 Phương pháp cảm nhiễm virustrêntôm 16
3.3.3 Phương pháp thu mẫu 16
3.3.4 Phương pháp PCR 16
3.3.4.1 Phương pháp PCR định tính 16
3.3.4.2 Phương pháp PCR định lượng 17
3.3.5 Phương pháp xác định mộtsố yếu tố môi trường 17
3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 18
3.4.1 Sàng lọc các hợpchấtchiếtxuấttừthảodược
đối với virusgâyhộichứngđốmtrắng 18
3.4.2 Thửnghiệm các hợpchất sàng lọc khi tiêm trực tiếp
hỗn hợp dich virus và hợpchất vào tôm 19
PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢOLUẬN 20
4.1 Sàng lọc các hợpchấtchiếtxuấttừthảodược
đối với virusgâyhộichứngđốmtrắng 20
4.1.1 Kết quả sàng lọc đối với hợpchất D
2
20
4.1.2 Kết quả sàng lọc đối với hợpchất B 21
4.1.3 Kết quả sàng lọc đối với hợpchất M 23
vii
4.2 Kết quả thửnghiệm sau khi tiêm trêntôm hỗn hợpvirus WSSV
và hợpchất D
2
, B ở các nồng độ khác nhau 23
4.2.1 Kết quả thửnghiệmhợpchất D
2
27
4.2.2 Kết quả thửnghiệmhợpchất B 29
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNA
WSSV
từ hỗn hợp
dịch chiếtvirusđược ủ với hợpchất D
2
trong thời gian 2 giờ 20
Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNA
WSSV
từ hỗn hợp
dịch chiếtvirusđược ủ với hợpchất B trong thời gian 2 giờ 21
Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNA
WSSV
từ hỗn hợp
dịch chiếtvirusđược ủ với hợpchất M trong thời gian 2 giờ 22
H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của
hỗn hợp dịch virus WSSV và hợpchất D
2
trước thí nghiệm 28
H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của
hỗn hợp dịch virus WSSV và hợpchất D
2
sau thí nghiệm 28
H ình 4.5 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của
hỗn hợp dịch virus WSSV và hợpchất B trước thí nghiệm 30
H ình 4.6 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của
hỗn hợp dịch virus WSSV và hợpchất B sau thí nghiệm 30
ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠĐỒ
BẢNG TRANG
Bảng 2.1 Tên mộtsố quốc gia và năm xuất hiện bệnhđốmtrắng 3
Bảng 2.2 Đánh giá khả năng phát hiện bệnhđốmtrắng bằng các phương pháp
khác nhau 10
Bảng 4.1 Các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm 24
Bảng 4.2 Kết quả ghi nhận tỷ lệ tôm chết ở các lô trong quá trình
thí nghiệm 25
Bảng 4.3 Kết quả Realtime PCR so sánh chu kỳ ngưỡng và hàm lượng DNA
của mẫu hỗn hợp dịch virus và hợpchất trước thí nghiệm và sau thí nghiệm 26
SƠĐỒTRANGSơđồ 3.1 Bố trí thí nghiệm sàng lọc các hợpchấtchiếtxuấttừthảodược đối với virusgâyhộichứngđốmtrắng (WSSV). 18
Sơđồ 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng tác dụng của virus WSSV
trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợpvirus và thuốc thử ở các
nồng độ khác nhau. 19
1
PHẦN 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề.
Trong những thập kỷ qua, nhu cầu sử dụng thực phẩm có nguồn gốc động vật,
đặc biệt là các sản phẩm thủy sản ngày càng tăng cao. Vì thế, sản lượng thủy sản
không thể đáp ứng được nhu cầu thị trường, trong khi nguồn lợi thủy sản ngày càng
giảm do khai thác quá mức. Trước tình hình đó việc phát triển tự phát nghề nuôi trồng
thủy sản, đặc biệt là sự bùng phát nghề nuôi tôm biển là một thực tế khách quan và là
một nhu cầu cần thiết.
Nghề nuôi trồng thủy sản nước ta cũng phát triển mạnh trong vài thập kỷ gần
đây, đặc biệt là nghề nuôi tôm ở các tỉnh ven biển. Nghề nuôi tôm nước ta phát triển
chủ yếu mang tính tự phát, nguồn vốn và kỹ thuật nuôi còn hạn chế. Điều đó dẫn đến
sự suy thoái môi trường nuôi cùng sự bùng phát và lây lan của dịch bệnh. Khoảng 20
năm gần đây, dịch bệnhtôm xảy ra ở khắp nơi gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm.
Một trong những bệnhgây thiệt hại nghiêmtrọng nhất đó là bệnhđốmtrắng ( White
Spot Desease ) dovirusgâyhộichứngđốmtrắng (WSSV). Thiệt hại có thể lên đến
100 % quần đàn từ 3 - 7 ngày kể từ khi phát hiện tôm bệnh. Có nhiều phương pháp
phòng trịbệnhđốmtrắng như dùng chế phẩm sinh học, hoá chất, thuốc… nhưng còn
tồn tại nhiều mặt hạn chế và mức độ thành công chưa cao.
Việt Nam là nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nên khu hệ thực vật rất
phong phú. Thảodượctừ xưa đã được ứng dụng phòngtrịbệnh có hiệu quả trong y
học và thú y. Tuy nhiên trong lĩnh vực thuỷ sản thì chưa được ứng dụng rộng rãi. Thử
nghiệm mộtsốhợpchấtthảodượctrongphòngtrịbệnh ở các đối tượng nuôi thuỷ sản
là hướng nghiên cứu mới và cần khai thác. Đượcsự đồng ý của Trung tâm Quốc gia
Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thuỷ sản khu vực Nam Bộ
(MCE) thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II (RIA 2) và Bộ môn Công nghệ
Sinh học Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh cùng các thầy cô hướng
dẫn, chúng tôi thực hiện khoáluậntốt nghiệp: “Thử nghiêmmộtsốhợpchấtchiếtxuất
từ thảodượctrongphòngtrịbệnhđốmtrắngdovirusgâyhộichứngđốmtrắng
(WSSV) trêntômsú(Penaeus monodon)”
[...]... lọc mộtsốhợpchấtchiếtxuấttừthảodược có tác dụng lên virusgâyhộichứngđốmtrắng(WSSV) - Thửnghiệm tác dụng của các hợpchất sàng lọc lên virusgâyhộichứngđốmtrắng(WSSV)trong điều kiện thí nghiệm 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình dịch bệnhtômtrên thế giới Nuôi trồng thủy sản là ngành kinh tế quan trọng đóng góp một phần đáng kể trong thị phần xuất khẩu của mộtsố nước trên. .. thí nghiệm 18 3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 3.4.1 Sàng lọc các hợpchấtchiếtxuấttừthảodược đối với virusgâyhộichứngđốmtrắng(WSSV) Thí nghiệmđược thực hiện để khảo sát tác dụng trực tiếp của thuốc đối với virusgâyhộichứngđốmtrắng(WSSV) Các hợpchất thử được hòa tan trong dung môi DMSO ở các nồng độ khác nhau Dịch chiếtvirus WSSV Trộn lẫn dịch chiếtvirus và mỗi loại hợpchất thử. .. thí nghiệm khảo sát khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợpvirus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau 20 PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢOLUẬN 4.1 Sàng lọc các hợpchất chiết xuấttừthảodược đối với virusgâyhộichứngđốmtrắng Hiệu quả trực tiếp của các hợpchất B, M, D2 đối với virusgâyhộichứngđốmtrắng(WSSV)đượcthửnghiệm bằng cách cho 250 µl dịch chiết. .. (1998), dịch chiếttừ lá cây Clinacanthus nutans trộn với thức ăn viên theo liều lượng 1 g/kg thức 14 ăn có khả năng ức chế hoạt động virusgây ra bệnh đầu vàng (Yellow - Head Rhabdovirus) trêntômsú (P monodon) Hiệu quả bảo vệ tômsú khỏi virus này trong điều kiện thí nghiệm là 57,6 % Đây là mộttrongsố rất nhiều công trình nghiên cứu dùng các hợpchất thảo dược để hạn chế mộtsốbệnhgây chết hàng... công nghiệp nuôi tôm Ước tính tổng thiệt hại dovirusgây ra trung bình hàng năm cho thế giới khoảng hơn 1 tỷ USD Bệnhdovirusgâyhộichứngđốmtrắngtrêntômsú đã gây tỷ lệ chết cao và gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm công nghiệp của các nước Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia và Ấn ĐộBệnhđốmtrắngxuất hiện đầu tiên vào năm 1992 – 1993 ở Bắc Á, sau đó là các khu vực khác trên thế giới Tên một số. .. hành bệnh WSSV theo tháng trêntômsú nuôi thương phẩm thì thấy tháng 7, 8, 9 có tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất (0,25 – 0,4); tháng 6 tỷ lệ thấp hơn (0,12) và tháng 5 chưa phát hiện thấy tôm nhiễm bệnh Các bệnhtrêntôm xảy ra chủ yếu là dovirusgâyhộichứngđốmtrắng (WSSV), ngoài ra còn xuất hiện bệnh MBV, bệnhdo vi khuẩn Vibrio, bệnhdo ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần đây còn xuất hiện bệnh phân trắng, ... nhau Ủ hỗn hợp dịch virus và hợpchấtthửtrong khoảng 2 giờ ở nhiệt độ 28 – 30 oC Kiểm tra sự hiện diện của virus WSSV bằng PCR định tính nhưng không dùng NaOH-SDS trong quá trình ly trích DNA Sơđồ 3.1: Bố trí thí nghiệm sàng lọc các hợpchấtchiếtxuấttừthảodược đối với virusgâyhộichứngđốmtrắng(WSSV) 19 3.4.2 Các nghiên cứu trongphòng thí nghiệm ướt Mục đích của bố trí thí nghiệm để biết... – pentadeca - trienylbenzoat để làm nguyên liệu sản xuất ra mộtsố loại thuốc phòngtrịbệnhdo vi khuẩn và vi nấm gây ra như bệnh phát sáng, bệnh đóng rong, bệnh mang đen, bệnh mang vàng, bệnhđốm đỏ, bệnh mòn đuôi và hoại tử phụ bộ trêntôm sú, … Liều dùng trongphòng bệnh, cứ 15 ngày xử lý thuốc 1 lần với nồng độ 0,5 – 1 ppm Liều dùng trongtrịbệnh ở nồng độ 1 – 3 ppm, sau 3 – 5 ngày lặp lại lần... với hợpchất B 1 2 3 4 5 6 7 M Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiếtvirusđược ủ với hợpchất B trong thời gian 2 giờ ở 28 - 30 oC Ghi chú: Giếng 1: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợpchất B (2,5 mg/ml DMSO) Giếng 2: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợpchất B (5 mg/ml DMSO) Giếng 3: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợpchất B (7,5 mg/ml DMSO) Giếng 4: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp. .. Hiện tượng tôm chết hàng loạt ở các tỉnh ven biển phía Nam từ năm 1993 – 1994 đã xác định tômsú có ba loại bệnh MBV, bệnhđốmtrắng và bệnh đầu vàng (Bùi Quang Tề, 1996, 1997; Nguyễn Việt Thắng và CTV, 1998) Trong những năm gần đây, bệnhđốmtrắng thường xuyên xuất hiện trong các khu vực nuôi tôm ven biển ở Việt Nam Hầu hết các tỉnh khi tôm bị nhiễm bệnhđốmtrắng đã làm tôm chết hàng loạt gây tổn thất .
THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO
DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS
GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ
(Penaeus monodon).
“THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG
PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG
(WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) .