chứng đốm trắng (WSSV).
Thí nghiệm được thực hiện để khảo sát tác dụng trực tiếp của thuốc đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV).
Sơ đồ 3.1: Bố trí thí nghiệm sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV).
Các hợp chất thử được hòa tan trong dung môi DMSO ở các nồng độ khác nhau.
Dịch chiết virus WSSV.
Trộn lẫn dịch chiết virus và mỗi loại hợp chất thử đã được pha ở các nồng độ khác nhau.
Ủ hỗn hợp dịch virus và hợp chất thử trong khoảng 2 giờ ở nhiệt độ 28 – 30oC.
Kiểm tra sự hiện diện của virus WSSV bằng PCR định tính nhưng không dùng NaOH-SDS trong quá trình ly trích DNA.
3.4.2 Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm ướt.
Mục đích của bố trí thí nghiệm để biết được khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau.
Sơ đồ 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau.
Các lô thí nghiệm tiêm hỗn hợp dịch chiết virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau sau khi ủ 2 giờ. Lô đối chứng âm không tiêm virus WSSV Lô đối chứng dương tiêm dịch chiết virus WSSV
Tôm sú khoẻ kích cỡ 8 – 12 g/con
Theo dõi và ghi nhận hàng ngày về tình trạng sức khoẻ của tôm. Tiến hành thu mẫu những con chết (nếu có).
Sau 14 ngày
Thu toàn bộ mẫu kiểm tra lại bằng kỹ thuật Realtime PCR và đánh giá kết quả .
PHẦN 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng.
Hiệu quả trực tiếp của các hợp chất B, M, D2 đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) được thử nghiệm bằng cách cho 250 µl dịch chiết WSSV và 250 µl với mỗi hợp chất B, M, D2 ở các nồng độ khác nhau vào các eppendorf (1 ml) và ủ hỗn hợp trong 2 giờ ở nhiệt độ (28 - 30oC), sau đó kiểm tra sự tồn tại của virus trong hỗn hợp bằng kỹ thuật PCR định tính nhưng không dùng NaOH - SDS trong quá trình tách chiết DNA virus.
Việc không sử dụng NaOH - SDS trong quá trình tách chiết DNA virus nhằm hạn chế hoá chất tác dụng lên virus, làm phơi trần DNA virus, như thế sẽ không đánh giá được tác dụng của các hợp chất lên virus WSSV.
Sản phẩm PCR sau đó được đem điện di và chụp hình kết quả.
4.1.1 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất D2.
Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất D2 trong thời gian 2 giờ ở 28 - 30oC
Ghi chú:
Giếng 1: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất D2 (2,5 mg/ml DMSO) Giếng 2: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất D2 (5 mg/ml DMSO) Giếng 3: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất D2 (7,5 mg/ml DMSO) Giếng 4: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất D2 (10 mg/ml DMSO)
Giếng 5: Mẫu đối chứng dương. Giếng 6: Mẫu dịch virus thử nghiệm. Giếng 7: Mẫu đối chứng âm.
Giếng M: Thang DNA chuẩn.
Kết quả điện di cho thấy:
Trên bản gel sau khi điện di ghi nhận có xuất hiện vạch sáng ở các giếng 1, 2, 3, 4. Điều này có nghĩa hợp chất D2 ở các nồng độ lần lượt là 2,5 mg/ml, 5 mg/ml, 7,5 mg/ml, 10 mg/ml DMSO có tác động lên lớp vỏ virus làm phá vỡ cấu trúc vỏ protein của virus để phơi trần DNA virus ra ngoài. Trong trường hợp này hợp chất D2 đã làm thay vai trò của NaOH – SDS trong việc ly trích DNA.
Nếu so mức độ sáng tối chụp được của hợp chất D2 ở các nồng độ này với dịch virus thử nghiệm thì ta thấy yếu hơn. Điều này cho thấy hiệu quả tác dụng của hợp chất D2 lên virus WSSV là khá tốt nhưng chưa cao.
4.1.2 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất B.
Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại
DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với
hợp chất B trong thời gian 2 giờ ở 28 - 30oC
Ghi chú:
Giếng 1: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất B (2,5 mg/ml DMSO) Giếng 2: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất B (5 mg/ml DMSO) Giếng 3: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất B (7,5 mg/ml DMSO) Giếng 4: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất B (10 mg/ml DMSO)
Giếng 5: Mẫu đối chứng dương. Giếng 6: Mẫu dịch virus thử nghiệm. Giếng 7: Mẫu đối chứng âm.
Giếng M: Thang DNA chuẩn.
Kết quả điện di cho thấy trên bản gel sau khi điện di xuất hiện vạch sáng ở các giếng 1, 2, 3, 4 tương tự như trường hợp của hợp chất D2 ở trên. Nếu so sánh về mức độ sáng tối thì vạch sáng ở các giếng 1, 2, 3, 4 yếu hơn so với vạch sáng ở giếng đối chứng dương và dịch virus thử nghiệm. Tuy nhiên so với hợp chất D2 thì hợp chất B ở các nồng độ tương tự có độ sáng mạnh hơn. Điều này cho thấy hiệu quả tác dụng của hợp chất B lên virus WSSV là cao hơn so với hợp chất D2.
Mặt khác, độ sáng tăng dần từ nồng độ 2,5 mg/ml đến 7,5 mg/ml, độ sáng ở nồng độ 7,5 mg/ml và 10 mg/ ml là gần như nhau. Điều này cho thấy ở hợp chất B nồng độ đã có vai trò nhất định trong sự phá vỡ lớp vỏ protein virus. Nồng độ càng cao trong phạm vi nhất định thì hiệu quả tác dụng càng mạnh.
4.1.3 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất M.
Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại
DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với
hợp chất M trong thời gian 2 giờ ở 28 – 300C
Ghi chú:
Giếng 1: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất M (2,5 mg/ml) Giếng 2: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất M (5 mg/ml) Giếng 3: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất M (7,5 mg/ml)
Giếng 4: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất M (10 mg/ml) Giếng 5: Mẫu đối chứng dương.
Giếng 6: Mẫu dịch virus thử nghiệm. Giếng 7: Mẫu đối chứng âm.
Giếng M: Thang DNA chuẩn.
Kết quả điện di (Hình 4.3) cho thấy ở cả 4 nồng độ (2,5 mg/ml; 5,0 mg/ml; 7,5 mg/ml; 10,0 mg/ml) đối với hợp chất M đều không có xuất hiện vạch sáng nào, có thể là ở những nồng độ này hợp chất M chưa đủ liều lượng để có thể tác dụng lên lớp vỏ protein của virus WSSV hoặc hợp chất M không có hiệu quả tác dụng đối với virus WSSV.
Những kết quả này được đánh giá bằmg mắt thường và chỉ là những thí nghiệm In vitro, do đó để biết được hàm lượng DNA trong các mẫu thử trước và sau khi sử dụng các hợp chất có sai khác ý nghĩa hay không, các hỗn hợp này (D2 và B) được thực hiện với phản ứng Realtime PCR. Đồng thời để xác định được khả năng bất hoạt thật sự của các hợp chất lên virus WSSV, chúng ta cần phải cảm nhiễm hỗn hợp này vào cơ thể tôm.
Dựa vào kết quả sàng lọc 3 hợp chất như trên, chúng tôi chỉ tiến hành thử nghiệm đối với các hợp chất D2 và B.
4.2 Kết quả thử nghiệm sau khi tiêm trên tôm hỗn hợp virus WSSV và thuốc D2, B ở các nồng độ khác nhau.
Sau khi trộn chung dịch virus WSSV với mỗi hợp chất B và D2 ở các nồng độ khác nhau và ủ trong 2 giờ ở nhiệt độ 28 - 30oC, ta tiến hành cảm nhiễm trực tiếp trên tôm nuôi để đánh giá khả năng hoạt động của virus WSSV trong cơ thể tôm.
Tôm sú thí nghiệm có khối lượng trung bình 8 - 12 gam/con. Tôm khi thu về ở trong tình trạng khoẻ và sạch bệnh. Trước khi bố trí thí nghiệm, tôm được nuôi thuần trong thời gian 7 ngày để tôm thích nghi với môi trường và tôm được kiểm tra các mầm bệnh virus (WSSV, Taura Syndrome virus, MBV, YHCV) và nhóm Vibrio (Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi, V. alginolyticus) .
Bảng 4.1 Các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm
Nhiệt độ môi trường nước 27 - 28oC pH trung bình 7,78 – 7,87
Độ mặn (‰) 15
COD (mg/l) 11,32
OD (mg/l) 4,1
Sau khi nuôi thuần trong 7 ngày thì bắt đầu cảm nhiễm cho tôm bằng cách tiêm 0,1 ml hỗn hợp dịch virus và các hợp chất D2, B được pha theo các nồng độ khác nhau trong dung môi DMSO (ủ trong 2 giờ ở 28 - 30oC) vào đốt cơ bụng thứ 2 của tôm. Các hỗn hợp này đã được kiểm tra bằng phương pháp Realtime PCR trước khi cảm nhiễm trên tôm.
Thí nghiệm được bố trí như sau:
Lô 1: Đối chứng âm tiêm dung dịch TN 1X
Lô 2: Đối chứng dương tiêm dịch chiết virus WSSV
Lô 3, Lô 4, Lô 5, Lô 6: Tiêm hỗn hợp dịch chiết virus WSSV và hợp chất D2 ở các nồng độ (2,5 mg/ml; 5 mg/ml; 7,5 mg/ml và 10,0 mg/ml)
Lô 7, Lô 8, Lô 9, Lô 10: Tiêm hỗn hợp dịch chiết virus WSSV và hợp chất B ở các nồng độ (2,5 mg/ml; 5 mg/ml; 7,5 mg/ml và 10,0 mg/ml)
Sau khi tiêm, hầu hết các lô thí nghiệm đều có tôm chết. Số tôm chết này là do bị sốc sau khi tiêm.
Trong 2 ngày đầu, tôm có hiện tượng bỏ ăn hoặc ăn rất ít. Nhưng sang những ngày tiếp theo thì tôm ở các lô thí nghiệm có dấu hiệu bắt mồi tốt. Từ ngày thứ 5 trở đi, tôm ở các lô đối chứng âm, và các lô tiêm hỗn hợp dịch virus và hợp chất đều khoẻ mạnh, khả năng hoạt động linh hoạt. Tuy nhiên, đến ngày thứ 7, ở lô đối chứng dương cho tiêm dịch virus, một số con bắt đầu có dấu hiệu bỏ ăn. Sang ngày thứ 9, ở lô đối chứng dương đã có chết, quan sát thấy những con chết thân bị đỏ, vỏ mềm và có xuất hiện đốm trắng ở đầu ngực. Ở các lô khác tôm vẫn hoạt động tốt và không có hiện tượng bị chết. Tỷ lệ tôm chết trong quá trình thí nghiệm được trình bày ở Bảng 4.2.
Bảng 4.2 Kết quả ghi nhận tỷ lệ tôm chết ở các lô trong quá trình thí nghiệm
Lô thí nghiệm Ngày
theo dõi
Tỷ lệ tôm chết ở các lô trong quá trình thí nghiệm (%)
Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4 Lô 5 Lô 6 Lô 7 Lô 8 Lô 9 Lô 10
1 20 22 9 11 30 22 0 0 25 10 2 20 22 18 11 30 22 9 0 25 10 3 20 22 18 11 30 22 9 0 25 20 4 30 22 18 22 30 22 9 0 25 20 5 30 22 18 22 30 22 9 0 25 20 6 30 22 18 22 30 22 9 0 25 20 7 30 22 18 22 30 22 9 0 25 20 8 30 33 18 22 30 22 9 0 25 20 9 30 33 18 22 30 22 9 0 25 20 10 30 55 18 22 30 22 9 0 25 20 11 30 55 18 22 30 22 9 0 25 20 12 30 78 18 22 30 22 9 0 25 20 13 30 78 18 22 30 22 9 0 25 20 14 30 78 18 22 30 22 9 0 25 20
Sau 14 ngày thu toàn bộ mẫu tôm để xét nghiệm Realtime PCR. Các kết quả Realtime PCR thu được như sau:
Bảng 4.3: Kết quả Realtime PCR so sánh chu kỳ ngưỡng và hàm lượng DNA của mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất thí nghiệm trước thí nghiệm và sau thí nghiệm
Chu kỳ ngưỡng (Ct) Hàm lượng DNA/2µl mẫu Tỷ lệ tôm chết (%) Tỷ lệ nhiễm (%) sau thí nghiệm Trước thí nghiệm. Sau thí nghiệm. Trước thí nghiệm. Sau thí nghiệm. Sau khi cảm nhiễm Sau thí nghiệm D2 (2,5mg/ml) 26,13 40,27 163.102 10,7.10o 9 18 33 D2 (5 mg/ml) 25,55 38,33 231.102 95,7.10o 11 22 43 D2 (7,5 mg/ml) 25,23 38,18 279.102 101.10o 30 30 40 D2 (10 mg/ml) 24,24 38,62 503.102 67.10o 22 22 28 B (2,5 mg/ml) 24,96 39,65 327.102 37,2.10o 0 9 30 B (5 mg/ml) 28,10 38,56 50,4.102 47.10o 0 0 27 B (7,5 mg/ml) 27,72 38,48 63,5.102 58.10o 25 25 40 B (10 mg/ml) 26,38 38,55 141.102 61,6.10o 10 20 40 Đối chứng dương 24,02 25,32 630.10 2 245.102 22 78 100
Đối chứng âm Không phát hiện Không phát hiện 0 0 20 30 0 Chỉ tiêu so sánh Liều lượng hợp chất
4.2.1 Kết quả thử nghiệm hợp chất D2.
Kết quả thu được ở bảng 4.3 cho thấy:
- Ở nồng độ D2 (2,5 mg/ml) chu kỳ ngưỡng là 26,13 trước thí nghiệm và 40,27 sau thí nghiệm tương ứng với hàm lượng DNA là 163.102 và 10,7.100. Tỷ lệ tôm chết là 9 % sau khi cảm nhiễm và 18 % sau 14 ngày.
- Ở nồng độ D2 (5 mg/ml) chu kỳ ngưỡng là 25,55 trước thí nghiệm và 38,33 sau thí nghiệm tương ứng với hàm lượng DNA là 231.102 và 95,7.100. Tỷ lệ tôm chết là 11 % sau khi cảm nhiễm và 22 % sau 14 ngày.
- Ở nồng độ D2 (7,5 mg/ml) chu kỳ ngưỡng là 25,23 trước thí nghiệm và 38,18 sau thí nghiệm tương ứng với hàm lượng DNA là 279.102 và 101.100. Tỷ lệ tôm chết là 20 % sau khi cảm nhiễm và 20 % sau 14 ngày.
- Ở nồng độ D2 (10 mg/ml) chu kỳ ngưỡng là 24,24 trước thí nghiệm và 38,62 sau thí nghiệm tương ứng với hàm lượng DNA là 503.102 và 67.100. Tỷ lệ tôm chết là 22 % sau khi cảm nhiễm và 22 % sau 14 ngày.
Theo Jim McMenamin (2004), mức khác biệt hàm lượng DNA có ý nghĩa trước và sau thí nghiệm là 102. Ở nồng độ 2,5 mg/ml hàm lượng DNA trước và sau thí nghiệm có sự khác biệt > 102, mặt khác tỷ lệ tôm chết sau 14 ngày so với sau khi cảm nhiễm không có khác biệt lớn, chứng tỏ ở nồng độ 2,5 mg/ml, hợp chất D2 có hiệu quả tác dụng lên virus WSSV.
Ở các nồng độ 5 mg/ml, 7,5 mg/ml, 10 mg/ml, mức khác biệt hàm lượng DNA cũng đều lớn hơn 102, Tỷ lệ tôm chết sau khi cảm nhiễm và sau 14 ngày không có khác biệt lớn hoặc không thay đổi. Như vậy hợp chất D2 ở các nồng độ 5 mg/ml, 7,5 mg/ml, 10 mg/ml cũng có tác dụng hiệu quả lên virus WSSV.
So sánh với lô đối chứng dương cho thấy hàm lượng DNA ở lô đối chứng dương sau thí nghiệm so với trước thí nghiệm không có sự khác biệt ý nghĩa (245.102 sau thí nghiệm và 630.102 trước thí nghiệm), tỷ lệ tôm chết sau 14 ngày là 78 % khác biệt rất lớn so với tỷ lệ chết 22 % sau cảm nhiễm, các mẫu tôm chết và các mẫu tôm thu sau 14 ngày của lô đối chứng âm đều hiện diện virus WSSV chứng tỏ virus vẫn hoạt động bình thường khi không sử dụng hợp chất D2.
Như vậy hợp chất D2 ở các nồng độ 2,5 mg/ml, 5 mg/ml, 7,5 mg/ml và 10 mg/ml khi trộn chung với dịch virus WSSV và cảm nhiễm trên tôm thí nghiệm ghi nhận có khả năng ức chế sự hoạt động của WSSV trong cơ thể tôm.
Hình 4.4: Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus và hợp chất D2
trước thí nghiệm.
Hình 4.5: Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus và hợp chất D2
sau thí nghiệm. Ghi chú: D2 (2,5 mg/ml) D2 (5 mg/ml) D2 (7,5 mg/ml) D2 (10 mg/ml)
4.2.2 Kết quả thử nghiệm hợp chất B.
Kết quả thu được ở bảng 4.3 cho thấy:
- Ở nồng độ B (2,5 mg/ml) chu kỳ ngưỡng là 24,96 trước thí nghiệm và 39,65 sau thí nghiệm tương ứng với hàm lượng DNA là 327.102 và 37,2.100. Tỷ lệ tôm chết là 0 % sau khi cảm nhiễm và 9 % sau 14 ngày.
- Ở nồng độ B (5 mg/ml) chu kỳ ngưỡng là 28,1 trước thí nghiệm và 38,56 sau thí nghiệm tương ứng với hàm lượng DNA là 50,4.102 và 47.100. Tỷ lệ tôm chết là 0 % sau khi cảm nhiễm và 0 % sau 14 ngày.
- Ở nồng độ B (7,5 mg/ml) chu kỳ ngưỡng là 27,72 trước thí nghiệm và 38,48 sau thí nghiệm tương ứng với hàm lượng DNA là 63,5.102 và 58.100. Tỷ lệ tôm chết là 25 % sau khi cảm nhiễm và 25 % sau 14 ngày.
- Ở nồng độ B (10 mg/ml) chu kỳ ngưỡng là 26,38 trước thí nghiệm và 38,55 sau thí nghiệm tương ứng với hàm lượng DNA là 141.102 và 61,6.100. Tỷ lệ tôm chết là 10 % sau khi cảm nhiễm và 20 % sau 14 ngày.
Theo Jim McMenamin (2004), mức khác biệt hàm lượng DNA có ý nghĩa trước