KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: KHẢO SÁT SINH TRƯỞNG NẤM LINH CHI ĐEN (Amauroderma subresinosum, Corner) PHÁT HIỆN TẠI VÙNG NÚI CHỨA CHAN - VIỆT NAM (Phần Chính)

Ngày nay xu hướng sử dụng các thảo dược thiên nhiên để trị bệnh đã trở nên phổ biến, việc tìm kiếm những khả năng chữa trị từ các loại thảo dược đã được tiến hành ở nhiều nơi trên thế giới: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan, ….Trong đó, nấm Linh chi là đối tượng nghiên cứu của nhiều quốc gia. Đặc biệt là các nước vùng Châu Á, vì nó có nhiều tiềm năng về nguồn dược liệu.

1 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Từ ngàn xưa đến nay, đời bình thường người phải trải qua bốn giai đoạn mặc định tạo hóa, chu trình sinh – lão – bệnh – tử Để khắc phục phần bệnh tật, bảo toàn mạng sống trước ngưỡng cửa chết kéo dài tuổi thọ, loài người khơng ngừng cố gắng tìm cách can thiệp vào chu trình sống mặc định Từ kinh nghiệm lưu truyền dân gian, loài người sử dụng nhiều loại thuốc, từ dạng sơ chế đến tinh chế, đặc, trích xuất từ loại thảo dược có sẳn tự nhiên để điều trị bệnh Ngày xu hướng sử dụng thảo dược thiên nhiên để trị bệnh trở nên phổ biến, việc tìm kiếm khả chữa trị từ loại thảo dược tiến hành nhiều nơi giới: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan, ….Trong đó, nấm Linh chi đối tượng nghiên cứu nhiều quốc gia Đặc biệt nước vùng Châu Á, có nhiều tiềm nguồn dược liệu Trung Quốc quốc gia có lịch sử phát triển lâu đời, đồng thời nôi thuốc cổ truyền tiếng giới Ở Trung Quốc, Ganoderma lucidum nghiên cứu nhiều sử dụng thảo dược quý để trị bệnh có tác dụng bổ dưỡng, điều hồ huyết áp, chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ,…Tác dụng Linh chi khẳng định xếp vào hàng “thượng dược” trị bách bệnh Những nghiên cứu gần cho thấy Linh chi có khả giải độc chì, điều hịa huyết áp, làm giảm hàm lượng cholesterol máu….[11, 14] Tại thị trường Việt Nam, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh nước xuất ngày tăng Nhiều sở tiến hành nghiên cứu ni trồng, chế biến thăm dị hoạt chất sinh học có nấm Linh chi Các thành phần hóa học có nấm Linh chi phong phú bao gồm nhóm: acid béo, steroid, alcaloid, protein, polysaccharide…[22] Trong thành phần có tác dụng dược lý quý báu, đặc trưng cho nấm Linh chi phần lớn thuộc nhóm triterpenoid [10] Sản lượng Linh chi Ganoderma vào năm 2003 Trung Quốc 50.000 Riêng sản lượng Linh chi Việt Nam Trung tâm nấm Dược sản suất khoảng 22 tấn/năm, chiếm tới 99% tổng sản lượng nước [12] Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa nguồn ngun liệu cellulose dồi dào, tạo điều kiện cho nghề trồng nấm không ngừng phát triển Hiện nước có 32/61 tỉnh thành có sở ni trồng nấm dược liệu (tháng 12/2001) [2] Xuất phát từ tình hình thực tế trên, đồng ý Bộ môn Công Nghệ Sinh học trường Đại học Nông Lâm TP.HCM hướng dẫn ThS.Cổ Đức Trọng, bước đầu thực đề tài: ”Khảo sát sinh trƣởng nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum, Corner) phát vùng núi Chứa Chan - Việt Nam” Thực điều bảo tồn nguồn gen địa phục vụ nguồn gen cho nghiên cứu sâu sau 1.2 Mục đích Khảo sát sinh trưởng phát triển loài nấm môi trường dinh dưỡng khác 1.3 Yêu cầu Xác định mơi trường nhân giống cấp thích hợp cho sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen Nghiên cứu sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen môi trường lỏng PG Xác định môi trường nhân giống cấp thích hợp cho hệ sợi nấm Linh chi đen sinh trưởng Xác định môi trường sản xuất phù hợp cho sinh trưởng phát triển nấm Linh chi đen Xác định thành phần hóa học có sinh khối sợi nấm thể nấm Linh chi đen 1.4 Hạn chế đề tài Chưa khảo sát ảnh hưởng điều kiện ngoại cảnh lên trình sinh trưởng phát triển nấm Linh chi đen Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nấm trồng 2.1.1 Khái quát nấm hình thái học 2.1.1.1 Khái quát nấm [1] Nấm khác với thực vật xanh: khơng có lục lạp, khơng có phân hóa thành rễ, thân, lá, khơng có hoa, phần lớn không chứa cellulose thành tế bào, chu trình phát triển chung thực vật Nấm hấp thu chất dinh dưỡng cần thiết cho thể từ thể khác hay từ đất qua bề mặt tế bào hệ sợi nấm Chính thế, tất hệ thống phân loại sinh giới coi nấm giới riêng, tương đương với giới thực vật động vật Năm 1969 nhà khoa học người Mỹ R.H.Whitaker đưa hệ thống phân loại giới (Kingdom):  Giới khởi sinh (Monera): Gồm vi khuẩn tảo lam  Giới nguyên sinh (Protista): Gồm số tảo đơn bào, nấm đơn bào có khả di động nhờ lơng roi (tiên mao) động vật nguyên sinh  Giới nấm (Fungi hay Mycetalia, Mycota)  Giới thực vật (Plantae hay Vegetabilia)  Giới động vật (Animalia) Năm 1973 nhà khoa học A.L.Takhtadjan đưa hệ thống phân loại sau:  Giới Mycota: gồm vi khuẩn vi khuẩn lam  Giới nấm  Giới thực vật  Giới động vật Năm 1980, Woese vào trật tự nucleotid acid ribonucleid (ARN) ribosome 16S 5S để tách vi khuẩn làm hai giới:  Giới vi khuẩn thật (Eubacteria)  Giới vi khuẩn cổ (Archaebacteria) ông gộp nấm, thực vật, động vật thành giới chung gọi sinh vật có nhân thật (Eukaryota) Hiện nay, nghiên cứu nấm người ta thường dựa vào hệ thống phân loại R.H.Whitaker (1969) hệ thống phân loại A.L.Takhtadjan (1973) Khóa phân loại nấm đại bao gồm ngành ngành phụ sau: (Allexopolous, 1962) - Ngành nấm nhầy (Exomycotina): Lồi nấm có hai tính chất động vật thực vật, chúng sinh sản bào tử, tế bào lại khối sinh chất vách ngăn bao bọc, di chuyển nuốt thức ăn động vật (amib) - Ngành nấm thật (Eumycotina): Chiếm số lượng lớn, bao gồm tế bào với nhân tương đối hồn chỉnh Tế bào nấm có vách bao bọc tế bào thực vật, đa số cấu tạo chitin Nhiều tế bào nấm cịn tích trữ đường dạng glycogen, giống động vật Một số lồi sinh sản theo lối tạo giao tử có lông roi để di động (động bào tử), hợp tử lại phát triển theo kiểu chung nấm Dựa theo sinh sản hữu tính, nhà phân loại chia chúng thành ngành phụ sau:  Ngành phụ nấm tiên mao (Mastigomycotina)  Ngành phụ nấm tiếp hợp (Zygomycotina)  Ngành phụ nấm túi (Ascomycotina)  Ngành phụ nấm đảm (Basidiomycotina)  Ngành phụ nấm bất tồn (Deuteromycotina) 2.1.1.2 Hình thái học sợi nấm [1] Các nấm ăn thuộc ngành phụ nấm túi (Ascomycotina) ngành phụ nấm đảm (Basidiomycotina) có thành tế bào cấu tạo chủ yếu kitin – glucan Đối với nấm đảm có tới cấp sợi nấm:  Sợi nấm cấp (sơ sinh): Lúc đầu khơng có vách ngăn có nhiều nhân, tạo vách ngăn phân thành tế bào đơn nhân sợi nấm  Sợi Nấm cấp hai (thứ sinh): Tạo thành phối trộn hai sợi nấm cấp Khi nguyên sinh chất hai sợi nấm khác dấu trộn với Hai nhân đứng riêng rẽ làm cho tế bào có hai nhân, gọi sợi nấm song nhân (dicaryolic hyphae)  Sợi nấm cấp ba (tam sinh): Do sợi nấm cấp hai phát triển thành Các sợi nấm liên kết lại chặt chẽ với tạo thành thể nấm Đối với nấm túi: Sợi nấm song nhân sinh trước hình thành túi Sự hình thành thể nấm túi phối hợp sợi nấm cấp sợi nấm song nhân Một số loại nấm có hình thái liên hợp dạng móc (clamp connection), tế bào đỉnh sợi nấm (2 nhân) mọc mấu nhỏ, hai nhân chui vào mấu Mỗi nhân phân cắt thành hai, hai thành bốn nhân, hai nhân giữ lại đỉnh tế bào, nhân chui vào mấu, nhân nằm gốc tế bào Tế bào đỉnh ban đầu xuất hai vách ngăn, chia thành ba tế bào Sau vách ngăn mấu tế bào gốc bị khai thông, tế bào gốc tiếp nhận nhân từ mấu chuyển xuống trở thành tế bào song nhân Như từ tế bào song nhân trở thành hai tế bào song nhân hai tế bào lưu lại móc 2.1.1.3 Hình thái học thể nấm Tản hay thể nấm tế bào đơn hay dạng sợi kéo dài Phần lớn sợi phân nhánh Khi sợi nấm bện lại với tạo thành thể sinh bào tử, gọi thể hay tai nấm Đặc trưng nấm lớn có quan sinh sản bào tử kích thước lớn, nhìn thấy mắt thường, kết bện sợi nấm gặp điều kiện thuận lợi Thường có hai kiểu thể nhóm nấm lớn: [13] - Kiểu 1: Bào tử thường sinh thể hình cầu, nấm thuộc Gasteromycetes - Kiểu 2: Bào tử sinh phần thể nấm Những nấm thuộc Basidiomycetes Có thể bào tử phần phiến hay không thuộc phiến (Aphyllophorales) Ở nhóm ta thường gặp hai kiểu thể sau:  Quả thể lật ngược, phiến phía hay khơng có phiến, thường khơng có hình dạng định Chúng mỏng, dày đạt mm  Quả thể thẳng đứng, gặp nhóm Basibiomyceteses hay Discomycetes Các sợi nấm phủ lên mặt hay phần bên Những kiểu thể khác phần chân nấm, mũ nấm, phiến nấm 2.1.2 Sinh lý biến dƣỡng nấm 2.1.2.1 Biến dƣỡng nấm [1, 2, 6, 13] Nấm có khả sản xuất enzyme ngoại bào, enzym ngoại bào giúp cho nấm biến đổi chất hữu phức tạp thành dạng hịa tan dễ hấp thu Chính thế, nấm có đời sống dị dưỡng, lấy thức ăn từ nguồn hữu (động vật, thực vật) Thức ăn hấp thu qua màng tế bào hệ sợi nấm Dựa vào cách hấp thu dinh dưỡng nấm chia làm nhóm:  Hoại sinh: Thức ăn xác bã thực vật hay động vật Ở nhóm nấm này, chúng có khả biến đổi chất khó phân hủy thành chất đơn giản dễ hấp thu, nhờ hệ men ngoại bào  Ký sinh: Chủ yếu loài nấm gây bệnh, chúng sống bám vào thể sinh vật khác để hút thức ăn sinh vật chủ  Cộng sinh: Lấy thức ăn từ thể sinh vật chủ không làm tổn hại sinh vật chủ, ngược lại giúp cho chúng phát triển tốt (như nấm Tuber hay Boletus cộng sinh với thông sồi…) 2.1.2.2 Sự phát triển sợi nấm a Nhu cầu dinh dƣỡng cho phát triển hệ sợi nấm Nguồn cacbon: Nguồn cacbon cung cấp từ mơi trường ngồi để tổng hợp nên chất như: hydratcacbon, amino acid, acid nucleic, lipid… cần thiết cho phát triển nấm Trong sinh khối nấm, cacbon chiếm nửa trọng lượng khô, đồng thời nguồn cacbon cung cấp lượng cho trình trao đổi chất Đối với lồi nấm khác nhu cầu cacbon khác nhau, hầu hết chúng dùng nguồn đường đơn giản glucose, với nồng độ đường 2% [1] Trong tự nhiên, cacbon cung cấp chủ yếu từ nguồn polysaccharide như: cellulose, hemicellulose, lignin, pectin,… Các chất có kích thước lớn kích thước thành màng nguyên sinh chất Muốn tiêu hóa chất này, nấm tiết emzyme ngoại bào phân hủy chất thành chất có kích thước nhỏ hơn, đủ để xâm nhập vào thành màng tế bào [6, 13] Nguồn đạm (N): Đạm nguồn cần thiết cho tất môi trường nuôi cấy, cần cho phát triển hệ sợi nấm Hệ sợi nấm sử dụng nguồn đạm để tổng hợp chất hữu như: purin, pyrimidin, protein, tổng hợp chitin cho vách tế bào Nguồn đạm sử dụng môi trường dạng muối: muối nitrat, muối amon Trong tế bào, ion NH4+ thường gắn với cetoglutamic amin khác hình thành từ phản ứng chuyển hóa amin Sự diện NH4+ mơi trường ảnh hưởng đến tỷ số C/N , chúng đánh giá mức độ hoạt động vi sinh vật.[1, 13] Khoáng: Cần cho phát triển tăng trưởng nấm [13]  Nguồn sufur: Được cung cấp vào môi trường từ nguồn sulfat cần thiết để tổng hợp số loại acid amin  Nguồn phosphat: Tham gia tổng hợp ATP, acid nucleic, phospholipid màng Nguồn cung cấp phospho thường từ muối phosphat  Nguồn kali: Đóng vai trị làm đồng yếu tố (cofactor), cung cấp cho loại enzym hoạt động Đồng thời đóng vai trò cân khuynh độ (gradient) bên tế bào  Magiê: Cần thiết cho hoạt động số loại enzym, nguồn magiê cung cấp từ sulfat magiê Vitamin: Những phân tử hữu dùng với lượng ít, chúng khơng phải nguồn cung cấp lượng cho tế bào Vitamin cần thiết giữ chức đặc biệt hoạt động enzym Hầu hết nấm hấp thụ nguồn vitamin từ bên ngồi cần lượng thiếu Hai nguồn vitamin cần thiết cho nấm biotin (vitamin H) thiamin (vitamin B1) Bảng 2.1: Nồng độ số dạng muối khoáng cần cho nấm trồng [13] Tên muối Nồng độ cần thiết (o/oo) - Phophat kali monobasic 1–2 - Phosphat kali dibasic 1–2 - Sulfat Magnê 0,2 – 0,5 - Sulfat Mangan 0,02 – 0,1 - Sulfat Calxi 0,001 – 0,05 - Clorua kali 2–3 - Peroxi phosphat 2–3 b Ảnh hƣởng yếu tố vật lý lên sinh trƣởng hệ sợi nấm Các yếu tố vật lý tác động lên sợi nấm khác với tác động lên hình thành thể nấm Tác nhân vật lý ảnh hưởng trực tiếp lên sợi nấm với mức độ khác nhau: mức độ tác động thấp nhất, mức độ tác động tối ưu, mức độ tác động lớn Những yếu tố tác động trực tiếp lên sinh trưởng sợi nấm nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm độ thơng khí:[13] Nhiệt độ: Ảnh hưởng trực tiếp đến phản ứng sinh hóa bên tế bào, kích thích hoạt động chất sinh trưởng, enzym chi phối toàn hoạt động sống nấm Mỗi loài nấm có nhu cầu nhiệt độ cho sinh trưởng phát triển khác Nhiệt độ nuôi ủ hệ sợi cao so với nấm thể vài độ Nhiệt độ cao thấp nhiệt độ thích hợp làm cho hệ sợi nấm sinh trưởng chậm lại chết hẳn [2, 13] Ánh sáng: Khơng cần cho q trình sinh trưởng nấm Cường độ ánh sáng mạnh kiềm chế sinh trưởng sợi nấm, có trường hợp giết chết sợi nấm Ánh sáng phá vỡ số vitamin enzym cần thiết, ảnh hưởng đến sinh trưởng bình thường sợi nấm Phịng ủ nấm khơng nên q tối, gây trở ngại cho việc phát bệnh tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc, côn trùng phát triển Trong giai đoạn nuôi hệ sợi tạo thể, ánh sáng có tác dụng kích thích hệ sợi nấm kết hạch (nụ nấm) [2, 13] Độ ẩm: Hầu hết loài nấm cần độ ẩm cao Một số loài thuộc nấm đảm cần độ ẩm thích hợp cho sinh trưởng tối ưu sợi nấm (80 – 90%) Nhưng hầu hết loài nấm cần độ ẩm để sinh trưởng hệ sợi 50 – 60% (Flegg, 1962) Độ thơng khí: Hàm lượng O2 CO2 ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng sợi nấm Oxy cần thiết cho việc hô hấp hệ sợi nấm Còn nồng độ CO2 tăng cao khơng khí ức chế q trình hình thành thể nấm.[13] Ảnh hƣởng pH: Hầu hết nhóm nấm mọc thực vật hay ký sinh thích hợp mơi trường pH thấp Các lồi nấm mọc mùn bã hay đất thích hợp với mơi trường pH trung tính hay mơi trường kiềm Nhưng số loại nấm có khả mọc biên độ pH rộng Một số loài nấm có khả tự điều chỉnh pH mơi trường pH thích hợp cho sinh trưởng chúng.[1, 13] 2.1.3 Các giai đoạn phát triển sợi nấm [3, 13] 2.1.3.1 Giai đoạn sinh trƣởng Giai đoạn thường dài, nấm giai đoạn chủ yếu dạng sợi Sợi nấm (hypha) mỏng manh gồm nhân, có nguồn gốc từ bào tử khác nẩy mầm phối hợp lại Hệ sợi nấm (mycelium), gọi hệ sợi dinh dưỡng (vegetative mycelium), len lỏi chất để rút lấy thức ăn Thức ăn muốn vào tế bào sợi nấm phải thông qua màng tế bào Khi khối sợi đạt đến mức độ định số lượng, gặp điều kiện thích hợp, bện kết lại tạo thành thể nấm Trong trường hợp bất lợi, hình thành bào tử tiềm sinh hay hậu bào tử (chlamydospore) 2.1.3.2 Giai đoạn phát triển Giai đoạn thường ngắn, lúc sợi nấm đan vào nhau, hình thành dạng đặc biệt, gọi thể nấm hay tai nấm (fruit body) Quả thể thường có kích thước lớn quan sinh sản nấm Trên thể có cấu trúc, nơi tập trung đầu sợi nấm, thụ tầng (hymenium) Chính nhân tế bào nhập lại thành Sau chia thành nhân hình thành bào tử hữu tính (sexual spore), đảm bào tử (basidiospore) nang bào tử (ascospore) Khi tai nấm trưởng thành, bào tử phóng thích, chúng nẩy mầm chu trình lại tiếp tục 2.2 Nấm Linh chi 2.2.1 Khái quát chung [1, 2, 8, 10] Nấm Linh chi xếp vào “Thượng Dược“, sách “Thần nông thảo“ cách khoảng 2000 năm thời nhà Châu sau nhà dược học tiếng Trung Quốc Lý Thời Trân phân thành “Lục Bảo Linh Chi“ thời nhà Minh với khái quát công dụng dược lý khác nhau, ứng theo màu (Lý Thời Trân, 1590) Theo Lý Thời Trân nấm Linh chi có màu khác nhau:  Xích chi (Linh chi đỏ gọi Hồng chi)  Hắc chi (Linh chi đen gọi Huyền chi)  Thanh chi (Linh chi xanh gọi Long chi)  Bạch chi (Linh chi trắng cịn gọi Ngọc chi)  Hồng chi (Linh chi vàng gọi Kim chi)  Tử chi (Linh chi tím) Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) có nhiều tên gọi khác Bất lão thảo, Vạn niên thảo, Thần tiên thảo, Chi linh, Đoạn thảo, Nấm lim,…Mỗi tên gọi Linh chi gắn liền với giá trị dược liệu Tên gọi Linh chi bắt nguồn từ Trung Quốc, hay theo tiếng Nhật gọi Reishi Mannentake Ở nước Châu Á, đặc biệt Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…, việc nghiên cứu phát triển sử dụng Linh chi công nghiệp hóa với quy mơ lớn phân loại, ni trồng chủ động, chế biến bào chế dược phẩm Đồng thời nghiên cứu hóa dược hoạt chất có tác dụng dược lý phương pháp điều trị lâm sàng 10 Trong số lồi Linh chi tìm thấy xích chi (Ganoderma lucidum) nghiên cứu y dược chi tiết Loài chuẩn Ganoderma lucidum có thành phần hoạt chất sinh học phong phú hàm lượng nhiều nhất.[12] 2.2.2 Vị trí phân loại [1, 3] Nấm Linh chi có vị trí phân loại thừa nhận rộng rãi nay: Ngành: Eumycota Ngành phụ: Basidiomycotina Lớp: Hymenomycetes Lớp phụ: Hymenomycetidae Bộ: Aphyllophorales Họ: Ganodermataceae Họ phụ: Ganodermoidae Chi: Amauroderma 2.2.3 Đặc điểm hình thái chu trình sống nấm Linh chi 2.2.3.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) Các nhóm nấm dược quý cổ truyền ngày xác định thuộc họ Ganodermataceace, bao gồm 150 – 200 lồi: bật Ganoderma (trên 100 lồi) chi Amauroderma (trên 30 loài) [11] Nấm Linh chi xem nấm nhiều lỗ (polypore) sống bám thân gỗ Chúng thường sống đa niên, hoá gỗ cứng, phân tầng, có cuống khơng Khi theo dõi q trình phát sinh hình thái lồi Amauroderma, tán nấm hình thành, liền tán tạo kiểu đính tâm tương đồng với loài Ganoderma mọc tự đất Cho nên xem chi Amauroderma phát sinh trực tiếp từ Ganoderma nhánh phân hoá lớn họ Ganodermataceae (Lê Xuân Thám, 1996) Mặt thể nấm Amauroderma subresinosum có màu đen bóng, nhiều nếp gấp đồng tâm, mép mũ nấm dày uốn lượng nhấp nhô Mô nấm chất gỗ cứng màu nâu quế, mẫu già mơ có đốm chất màu đen, dày – 15 mm Bào tầng gồm ống nấm trịn, có màu trắng đục, dày cỡ – 6(- 10) ống/mm Phần thịt mô nấm (context) cấu tạo loại sợi: sợi dinh dưỡng suốt, có vách mỏng, đường kính cỡ – µm; sợi bện khơng màu, vách mỏng, đường kính cỡ 1,5 – µm sợi cứng màu nâu nhạt, vách dày hóa cứng, đường kính cỡ – µm [20] 42 cấy Những dẫn liệu bảng 4.3 cho thấy: Từ lúc cấy giống thời điểm 10 ngày sợi nấm tăng trưởng nhanh, từ 10 – 20 ngày sợi nấm tăng trưởng chậm dần Hình 4.6: Sinh khối sợi nấm Amauroderma subresinosum Môi trƣờng lỏng sau 10 ngày 4.2.4 Sinh trƣởng phát triển nấm Linh chi đen môi trƣờng giá thể mạt cƣa cao su Tại Việt nam có nhiều triển vọng cho việc ni trồng nấm Linh chi có nguồn nhân lực dồi dào, phế thải nông, lâm, công nghiệp cịn tồn đọng gây nhiễm mơi trường Như phát triển nghề trồng nấm nói chung nấm Linh chi nói riêng, khơng cung cấp nguồn dược liệu q mà cịn góp phần làm môi trường sống, bảo vệ sức khoẻ cho Mạt cưa sử dụng làm môi trường giá thể chúng có hàm luợng cacbon cao Tuy nhiên, mạt cưa nguyên liệu nghèo chất dinh dưỡng Do để nâng cao hiệu suất ni trồng nấm rút ngắn thời gian ni trồng cần thiết phải trộn thêm nhiều chất bổ sung Chất bổ sung chủ yếu thường cám gạo, cám bắp, bột khoai,… Các nguyên liệu cung cấp vitamin hay acid amin cho hệ sợi nấm sinh trưởng nhanh Ngoài ra, loại phân hóa học như: Urê, DAP, NPK,… sử dụng nhiều nuôi trồng Thực tế cho thấy bổ sung nguồn nitơ với hàm lượng thấp lại có tác dụng tốt rõ rệt phát triển nấm Chúng tiến hành khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) giá thể mạt cưa cao su, sử dụng bịch PP kích thước 15 x 25 cm chứa 180 gam chất khơ/bịch với qui trình sau: 43 Mạt cưa cao su Ống thạch giống - Rây (sàng) bỏ dăm bào - Trộn nước vôi 0,25% - Ủ đống qua đêm - Thêm dinh dưỡng - Bảo quản giống: Khi hệ sợi nấm đầy ống nghiệm, tiến hành cấy chuyền giống qua ống thạch - Cấy hệ sợi nấm sang mơi trường lúa để tạo lượng giống lớn cho giai đoạn trồng chất mạt cưa Cơ chất trồng nấm - Vào túi màng mỏng PP - Thanh trùng 100oC Bịch mạt cưa khử trùng Cấy giống Chai lúa giống (meo hạt) -Nuôi ủ cho hệ sợi nấm đầy bịch Bịch phôi - Tháo nút bơng - Chuyển sang nhà tưới, trì độ ẩm 85 – 95% - Nhiệt độ 26 – 35oC - Ánh sáng tán xạ (700 – 800 lux) Quả thể nấm -Cắt gốc thu tai nấm -Sấy khô nhiệt độ 50oC Nấm khơ Hình 4.7:Qui trình ni trồng nấm Linh chi đen Qua q trình khảo sát nhận thấy pha ủ sợi kéo dài khoảng 25 – 27 ngày, hệ sợi bắt đầu bện kết, đưa bịch nấm mọc trắng lên phịng ni, tiến hành tưới phun sương để trì độ ẩm 80 – 95%, ánh sáng nhẹ (700 – 800 lux), độ thơng khí cao Pha phát triển thể quả: ngày thứ 38 – 40 mầm thể bắt đầu 44 hình thành, ngày thứ 50 – 80 mầm nấm giai đoạn tăng trưởng từ ngày 120 – 150 thể nấm bắt đầu già, thu hái thể Trong trình chăm sóc cần tưới nước dạng phun sương đặn, đảm bảo độ ẩm, nhiệt độ, khống chế ánh sáng tránh gây tổn thương học ruồi, muỗi, chích hút… Đặc biệt giai đoạn phát triển thể nhiệt độ cao, cường độ ánh sáng mạnh, phịng ni có độ thống khí gây ức chế hình thành phát triển thể Vì q trình ni trồng nên giữ nhiệt độ thích hợp, tưới nước thường xuyên để tạo độ ẩm cao, thiết kế trại nuôi trồng nơi mát mẻ có độ thơng khí cao, nên cho nấm tiếp xúc với nguồn sáng khuyếch tán có cường độ khoảng 700 – 800 lux, tránh xâm nhập côn trùng hay tác nhân gây tổn thương cho thể nấm Sau thu hái cần có phương pháp bảo quản tốt hay chế biến để bảo đảm chất lượng độ cảm quan nấm Hình 4.8: Bố trí thí nghiệm 4.2.4.1 Giai đoạn sinh trƣởng sợi nấm Linh chi đen Sau sợi nấm mọc trắng túi, mặt môi trường có khối nhỏ trắng mầm thể, lấy nút tăng cường tưới nước giữ độ ẩm 85 – 95%, nhiệt độ 26 – 28oC, để điều kiện ánh sáng tán xạ, thơng thống gió Khi thu hái ta nhổ cuống lẫn tán, hong khô sấy nhiệt độ thấp 45 120 Tỷ lệ sinh trưởng (%) 100 98 92.31 90.39 80.13 80.77 80 73.08 69.23 59.61 60 40 30.77 25 20 MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 MT9 MT10 Biểu đồ 4: Tỷ lệ sinh trƣởng hệ sợi nấm Linh chi đen môi trƣờng mạt cƣa Nhận xét: Tỷ lệ sinh trưởng hệ sợi nấm môi trường 3, nhanh mơi trường cịn lại Điều chứng tỏ nguồn đạm SA, N-P-K202015, cám bắp sợi nấm hấp thu dễ dàng so với nguồn dinh dưỡng khác Trái lại tỷ lệ sinh trưởng sợi nấm môi trường và10 chậm, nguyên nhân nguồn cám gạo urê nấm hấp thu chậm Như ta nên lựa chọn môi trường giá thể giúp cho sợi nấm sinh trưởng nhanh hạn chế phát sinh loài nấm gây bệnh Đồng thời, thời gian xuất thể mơi trường phải sớm Trong q trình khảo sát, nhận thấy hệ sợi nấm môi trường sinh trưởng tốt, 98% bịch có hệ sợi phủ kín bịch sau 20 ngày 4.2.4.2 Giai đoạn phát triển thể nấm Linh chi đen Sau hệ sợi nấm phủ đầy bịch (giai đoạn sinh trưởng), chúng bắt đầu chuyển sang giai đoạn phát triển Trong giai đoạn mới, hệ sợi nấm đan vào bắt đầu kết mầm nấm Chúng nhận thấy, thời gian kết mầm môi trường 3, vào khoảng 40 – 45 ngày, riêng môi cịn lại thời gian kết mầm tương đối lâu 45 – 55 ngày Nhìn chung bịch mơi trường sau cấy giống vào xuất mầm thể thời gian xuất mầm môi trường chênh lệch 10 – 15 ngày 46 Khi hệ sợi không bện kết đầu cổ bịch phôi, phải dùng dao tạo vết rạch đáy gốc bịch giúp cho mầm nấm xuất Vết rạch sâu miệng rạch hở thành bịch dẫn đến nhiễm mốc làm vị trí rạch bị khơ Trong q trình ni trồng, hầu hết mơi trường có tượng sợi nấm khơng bện kết đầu cổ bịch phơi Ngun nhân điều kiện ngoại cảnh chưa phù hợp cho sinh trưởng phát triển loài Linh chi Như vậy, sau khoảng – ngày tạo vết rạch bịch phôi xuất mầm nấm Hệ sợi bện kết Mầm nấm (Sau 50 – 55 ngày) (Sau 60 – 70 ngày) Mầm nấm tăng trƣởng Quả thể nấm ( Sau 80 – 85 ngày) (Sau 95 -100 ngày) Hình 4.9: Quá trình hình thành tăng trƣởng thể nấm Amauroderma subresinosum Theo dõi trình tạo thể nấm Linh chi đen, nhận thấy hình dạng thể mơi trường đồng nhất: thể nấm hình quạt, cuống ngắn Riêng thể môi trường không đồng kích thước, số dị dạng 4.2.4.3 Đánh giá hiệu suất sinh học môi trƣờng giá thể mạt cƣa cao su Bảng 4.4: Hiệu suất sinh học đạt đƣợc môi trƣờng giá thể mạt cƣa Môi trường giá thể Trọng lượng khô (gam) Hiệu suất sinh học (%) 11,31 ± 1,32 12,44 ± 1,48 10,5 ± 0,78 11,54 ± 0,85 13,04 ± 1,66 14,36 ± 1,82 10,21± 1,0 11,22 ± 1,13 47 10,6 ± 0,26 11,66 ± 0,297 10,36 ± 0,83 11,38 ± 0,912 11,98 ± 1,15 13,2 ± 1,26 11,58 ± 0,81 12,46 ± 1,18 10,34 ± 0,59 11,38 ± 0,634 10 10,94 ± 0,76 12,04 ± 0,856 16 14 Hiệu suất sinh học (%) 12 10 MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 MT8 MT9 MT10 Biểu đồ 5: Hiệu suất sinh học nuôi trồng nấm Linh chi đen Như hiệu suất sinh học thu môi trường cao (14,36%), môi trường thấp (11,22%) hiệu suất sinh học đạt mơi trường thí nghiệm cao 11% MT- MT - MT - Hình 4.10: Quả thể nấm Amauroderma subresinosum sau 120 ngày 48 Hình 4.11: Kết nuôi trồng nấm Amauroderma subresinosum 4.3 Xác định dƣợc chất có hệ sợi nấm thể nấm Linh chi đen 4.3.1 Định tính alcaloid Cho dịch chiết bột nấm Linh chi đen tác dụng với thuốc thử Mayer nhận thấy xuất kết tủa vơ định hình màu trắng ngà Ống 1(đối chứng): Dịch chiết với nước acid Ống 2: Dịch chiết với nước acid + thuốc thử Mayer Ống 3: Nước cất + thuốc thử Mayer Hình 4.12: Định tính alcaloid với thuốc thử Mayer Cho dịch chiết bột nấm Linh chi đen tác dụng với thuốc Dragendorff nhận thấy có xuất kết tủa màu cam - nâu dạng tủa từ từ lắng xuống đáy ống nghiệm Ống (đối chứng): Dịch chiết với nước acid Ống 2: Dịch chiết với nước acid + thuốc thử Dragendorff Ống 3: Nước cất + thuốc thử Dragendorff Hình 4.13: Định tính alcaloid với thuốc thử Dragendorff 49 Nhận xét: Dịch chiết nấm Linh chi đen phần đem thử nghiệm với loại thuốc thử Mayer Dragendorff nhận thấy kết dương tính Đối với dịch chiết phần đem thử nghiệm kết âm tính: Bột dược liệu trích với nước – acid: trích hết tấc alcaloid dạng baz tự (N biến thành NH+ tan nước), alcaloid dạng thứ cấp N+, dạng N – oxid (N+ -> O), dạng glycosid, alcaloid loại có tính phân cực mạnh, trích ln hợp chất có chứa nitơ (protein, glycoprotein, nucleotide)… hợp chất alcaloid cho kết dương tính với thuốc thử Bột dược liệu trích với dung mơi hữu – kiềm khơng trích alcaloid dạng N – oxid, dạng N tứ cấp, dạng tan tốt nước Phương pháp trích tốt alcaloid dạng baz tự có tính phân cực tính baz yếu, alcaloid có cấu trúc đặc thù –C=C –N – Như hoạt chất alcaloid thể nấm Linh đen có với hàm lượng cực thấp mà phản ứng định tính khơng thể quan sát 4.3.2 Định tính saponin 4.3.2.1 Thử nghiệm tính chất tạo bọt Kết ghi nhận sau: Độ bền bọt Kết Sau 15 phút + Sau 30 phút ++ Sau 60 phút +++ Như dược liệu từ sinh khối thể nấm Linh chi đen có chứa hoạt chất saponin Ống 1: dịch chiết dược liệu sau lắc Ống (đối chứng): nước cất sau lắc Hình 4.14: thử nghiệm tính tạo bọt từ sinh khối nấm Linh chi đen 50 4.3.2.2 Thử nghiệm Fontan – Kaudel Kết ghi nhận: - Bọt ống nghiệm bền 15 phút - Cột bọt ống nghiệm cao lần cột bọt ống nghiệm Như vậy, môi trường kiềm bọt bền mơi trường acid Sơ kết luận có saponin steroid Ống 1(đối chứng) : nước cất Ống : dịch chiết bột nấm sau cho acid vào Ống : dịch chiết bột nấm sau thêm baz vào Hình 4.15: Thử nghiệm saponin tồn phần theo Fontan – Kaudel 4.3.3 Định tính triterpenoid Kết thí nghiệm nhận thấy sinh khối thể nấm Linh chi có chứa hoạt chất triterpenoid (mơi trường chuyển sang màu xanh lục sau cho acid H2SO4 đậm đặc vào từ từ) Ống 1(đối chứng): nước cất + acid Ống 2: Dịch chiết + acid đậm đặc Hình 4.16: Định tính triterpenoid phản ứng Liebermann – Burchard 4.3.4 Định tính acid hữu Sau cho dịch chiết nước bột nấm Linh chi đen tác dụng với tinh thể Na2CO3 hơ nóng nhận thấy có bọt khí xuất bay Như vậy, dịch chiết nước từ thể nấm Linh chi đen có chứa thành phần acids hữu 51 Ống : Dịch chiết nước + tinh thể Na2CO3 Ống (đối chứng) : Nước cất + tinh thể Na2CO3 Hình 4.17: Định tính acid hữu có thể Linh chi đen 4.3.5 Định lƣợng polysaccharide từ thể nấm Linh chi đen Tiến hành ly trích polysaccharides từ 15 gam nấm Linh chi sấy khơ theo qui trình thí nghiệm Sau q trình lọc sấy khơ thu nhận 0.15 gam polysaccharide thơ Như hàm lượng polysaccharide thơ có thể nấm Linh chi đen đạt khoảng 1% Hình 4.18: Sản phẩm bột polysaccharide thơ từ thể nấm Linh chi đen 52 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận  Môi trường nhân giống cấp thích hợp : PGA + 10% dịch chiết nước cà rốt  Trên môi trường lỏng PG hệ sợi nấm phát triển tốt  Môi trường nhân giống cấp thích hợp: Lúa 50% + 25% mạt cưa + 25% cám gạo  Môi trường sản xuất có hiệu suất cao: Mạt cưa cao su + 5o/oo SA + 2,5o/oo DAP  Sinh khối hệ sợi thể Linh chi đen (Amauroderma subresinosum)có chứa thành phần hóa học: Saponine, saponin triterpenoid, acid béo hàm lượng polysaccharide thơ ly trích thể nấm Linh chi đen khoảng 1% 5.2 Đề nghị Vì thời gian thực đề tài có hạn nên tơi chưa thể nghiên cứu đầy đủ nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum), đề nghị nghiên cứu thêm về: Khảo sát sâu trồng trọt thành phần hóa học, tác dụng dược lý, lâm sàng Nhằm hoàn thiện quy trình trồng ứng dụng ngành dược 53 Phần TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng, 2001 Công nghệ nuôi trồng nấm, tập Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Nguyễn Hữu Đống, 2003 Nuôi trồng chế biến nấm ăn nấm làm thuốc chữa bệnh Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Nguyễn Hữu Đống Đinh Xuân Linh, 2000 Nấm ăn nấm dược liệu - công dụng công nghệ nuôi trồng Nhà xuất Hà nội Nguyễn Hữu Đống, Nguyễn Thị Sơn Zani Federico, 2002 Cơ sở khoa học công nghệ nuôi trồng Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Trần Hùng, 2004 Phương pháp nghiên cứu dược liệu Đại học Y Dược TP.HCM Nguyễn Đức Lượng, 2003 Vi sinh học công nghiệp, tập Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP.HCM Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền Nuyễn Ánh Tuyết, 2003 Thí nghiệm cơng nghệ sinh học, tập 2, thí nghiệm vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Quốc Gia TPHCM Trần Văn Mão, 2004 Nuôi trồng chế biến nấm ăn nấm làm thuốc chữa bệnh Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Nguyễn Phước Nhuận, 2001 Giáo trình sinh hoá học, phần Nhà xuất Đại học Quốc Gia TPHCM 54 10 Lê Xuân Thám, 1996 Nghiên cứu đặc điểm sinh học đặc điển hấp thu khoáng nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr).Karst Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà nội, Việt nam 11 Lê Xuân Thám, 1996 Nấm Linh chi - dược liệu quí việt nam Nhà xuất mủi cà mau 12 Lê Xuân Thám, 2005 Nấm Linh chi vàng - nấm Hồng chi Báo khoa học phổ thơng, số 31/05 (1154) 13 Lê Duy Thắng, 2001 Kỹ thuật nuôi trồng nấm ăn, tập Nhà xuất Nông nghiệp 14 Arichi D.S and Hagashi D.T., 2003 Linh chi nguyên chất bệnh thời (Đoàn Sáng dịch) Nhà xuát Y học, Hà nội, Việt nam Tiếng Anh 15 Shufeng Zhou, A clinical Study of a Ganoderma lucidum extract in patients with type II diabetes mellitus Division of Pharmacology and Clinical Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Science, Auckland University, Auckland, New Zealand 16 Yihuai Gao, Guoliang Chen, Jin Lan, He Gao and Shufeng Zhou, 2001 Extractoin of Ganoderma polysaccharides at relatively low temperature Froc Int Symposium Ganoderma Sci, Auckland 17 Yihuai Gao, Jin Lan and Zhifang Liu, Extraction and determination of Ganoderma polysaccharides Int Med Complement Med Vol 1, Supplement 1,00-00 18 Shufeng Zhou, Yihuai Gao, Gouliang Chen, Xihu Dai and Jingxian Ye A phase I/II study of a Ganoderma lucidum extract in patients with coronary heart disease 19 Steyaert R.L, 1972 Species of Ganoderma and related genera mainly of the boyor and leiden herbaria National de Beigique, Burxelle 55 20 Zhaoji – Ding, 1980 The Ganodermataceae in chine Berlin Shiffigart Tài Liệu từ Internet 21 http://www.About Lingzhi.htm 22 http://www activeCompoundsReishi.html 23 http://www Alicechen.mht 24 http://www Biomed~1.htm 25 http://www Mushroom Information Center - waste G lucidum.mht 26 http://www Reishi - Ganoderma Lucidum.mht 27 http://www Mushroom Information Gano HIV.mht 28 http://www.bfa-ernaehrung.de/Deutsch/Information/pflanzenstoffe/artikel3.pdf 29 http://203.162.44.79/khcn/magazine/Tap7/So6/06.htmđnh5 56 ... Hắc chi (Linh chi đen gọi Huyền chi)  Thanh chi (Linh chi xanh gọi Long chi)  Bạch chi (Linh chi trắng cịn gọi Ngọc chi)  Hồng chi (Linh chi vàng gọi Kim chi)  Tử chi (Linh chi tím) Nấm Linh. .. sát sinh trƣởng nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum, Corner) phát vùng núi Chứa Chan - Việt Nam? ?? Thực điều bảo tồn nguồn gen địa phục vụ nguồn gen cho nghiên cứu sâu sau 1.2 Mục đích Khảo. .. Linh chi đen Xác định thành phần hóa học có sinh khối sợi nấm thể nấm Linh chi đen 1.4 Hạn chế đề tài Chưa khảo sát ảnh hưởng điều kiện ngoại cảnh lên trình sinh trưởng phát triển nấm Linh chi đen