KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP - ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG AXIT PHYTIC Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỊA PHƯƠNG VÀ MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỘT BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA VÀ MICROSATELLITE (Nội dung chính)

Nghiên cứu ảnh hưởng của axit phytic đang được đánh giá toàn diện, nhằm giải quyết các vấn đề liên quan đến sức khỏe con người, dinh dưỡng động vật, quản lý dinh dưỡn sản phẩm nông nghiệp.

CHƯƠNG 1 LỜI MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những loại cây lương thực chính nuôi

sống hơn 50% dân số thế giới Trước đây, với điều kiện vật chất còn thiếu thốn, lương thực không đủ ăn người ta chỉ có nhu cầu được ăn no Nhưng ngày nay mức sống người dân ngày càng được nâng cao thì nhu cầu ăn no đã được thay đổi, việc

ăn ngon, có dinh dưỡng cao đã dần trở nên là nhu cầu quan trọng đối với mọi người Trong đó, sự cân bằng dinh dưỡng trong khẩu phần ăn là vấn đề lớn của dân số thế giới Ở các nước đang phát triển sự thiếu dinh dưỡng khoáng chưa được quan tâm như: Sắt (Fe), kẽm (Zn) Các chất này đóng vai trò quan trọng trong cơ thể con người, sắt là kim loại tham gia vào thành phần hóa học của hồng cầu Thiếu sắt sẽ dẫn đến tình trạng thiếu máu và ảnh hưởng phần lớn đến trẻ em và phụ nữ trong giai đoạn mang thai Trong khi đó, kẽm cũng rất cần thiết cho cơ thể, thiếu kẽm làm cho cơ thể suy yếu, bệnh tật, gây tử vong và gây ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cơ thể Ở trẻ em, phụ nữ mang thai và phụ nữ đang trong giai đoạn cho con bú sữa thì có nguy cơ thiếu kẽm cao vì lúc này cơ thể có nhu cầu kẽm cao hơn cho sự phát triển, sinh sản và đề kháng với những bệnh nhiễm trùng Brown và Wuehler (2000) đã ước tính là khoảng 95,4% (+/- 2,1) dân

số ở Nam Á và khoảng 71,2% (+/- 14,2) dân số ở Đông Nam Á đang đứng trước nguy cơ thiếu kẽm Trong khi đó tỷ lệ này ở Mỹ và Canada chỉ chiếm khoảng 0,9

% (+/- 0,2 )

Hạt ngũ cốc và cây họ đậu là nguồn thực phẩm tiêu thụ chính của dân số thế

giới Nguồn thực phẩm này rất giàu axit phytic

(myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphotphate), là thành phần dự trữ photpho trong hạt Axit phytic, phytate và photpho đã được tìm thấy một lượng đáng kể trong các loại quả và hạt của cây

trồng (John N.A Lott và ctv, 2000) Axit phytic tồn tại trong hạt thường ở dạng

phức hợp muối phytate hay phytin của kali , magie, canxi nên có thể chứa các ion kim loại khác như canxi (Ca), sắt (Fe) và kẽm (Zn) Ở pH sinh lý, axit phytic ở dạng đa ion tích điện âm gây ảnh hưởng đến các ion mang điện tích dương Khi thức ăn được hấp thu chúng sẽ kết hợp với các kim loại khoáng quan trọng, cạnh tranh với sự hấp thu trong thành ruột non tạo nên sự thiếu sắt và kẽm trong cơ thể con người

Vì vậy nghiên cứu ảnh hưởng của axit phytic đang được đánh giá toàn diện, nhằm giải quyết các vấn đề liên quan đến sức khỏe con người, dinh dưỡng động vật, quản lý dinh dưỡng sản phẩm nông nghiệp

1.2.Mục tiêu đề tài

Nghiên cứu và đánh giá hàm lượng axit phytic ở một số giống lúa địa phương

và giống lúa đột biến để tìm ra các dòng có hàm lượng axit phytic thấp phục vụ cho công tác chọn giống lúa giàu dinh dưỡng

1.3 yêu cầu

Pha được các dung dịch hóa chất cho phản ứng sinh hóa

Thành thạo ly trích DNA cây lúa

Nắm vững kỹ thuật PCR

Các thao tác nấu gel và đưa mẫu DNA vào các giếng

Nhuộm gel và đọc bản điện di

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Axit phytic

Axit phytic là este photphate của inositol, có công thức phân tử là inositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphotphat ( IP6 ) là thành phần chính của phopho ( P ) trong thực vật, được tích lũy trong hạt và túi phấn

myo-Hình 2.1.Cấu trúc của inositol D là ký hiệu vị trí của cacbon

Inositol hay còn gọi là hexahydroxyclohexan, có 9 dạng đồng phân lập thể giống với cấu trúc của glucose Inositol là thành phần của nhiều photphoglycerid

tế bào Vì inositol có mặt trong mô cơ nên còn được gọi là Meso- hay oinositol, là một đồng phân quan trọng Myo-inositol là tiền chất trong chu trình photphatidylinositol Inositol và dạng photphat của nó ổn định với những enzym phân hủy ở trong cơ thể

my-Hình 2.2 Cấu tạo lập thể của axit Phytic

Axit phytic tạo phức với những ion kim loại như : Canxi (Ca), Kẽm (Zn), Sắt (Fe), Magie (Mg) hay tạo phức với protein thành hợp chất gọi là Phytin hay phytate

Hình 2.3.Công thức cấu tạo của muối Phytate

2.2 Đặc điểm của axit Phytic và vai trò của nó

Axit Phytic là một chất kiềm mạnh, đặc biệt là với những cation đa hoá trị hơn là cation đơn hóa trị (Graf, 1986) Muối này gọi là phytate (hay phytin), thông thường chiếm khoảng 1 đến vài phần trăm trọng lượng khô của nhiều hạt và trong

vài trường hợp nó chiếm khoảng 50-80% lượng photpho tổng của hạt (Lott,1984) Không có hạt trưởng thành nào mà không có phytate mặc dù nó có thể không có ở một số mô hạt nhất định nào đó như nội nhũ chứa tinh bột của những hạt ngũ cốc Phytate cũng có ở hạt phấn (Jackson và ctv.,1982; Helsper và ctv., 1984), bào tử túi (DeMaggio và Stetler, 1985) và mô sinh dưỡng như rễ, cuống và lá (Roberts và Loewus, 1968; Brearly và Hanke, 1996 )

Bảng 2.1 Sự phân bố của Phytate ở hạt của một số cây trồng

Vỏ hạt: 0,1%

Sự tổng hợp và vai trò sinh lý của phytate trong hạt gần đây được xem lại bởi Greenwood (1989), Lásztity (1990), Loewus (1990), Raboy (1990 ), Lott và ctv (1995 ) và Raboy và Gerbasis ( 1996 ) Axit phytic được tổng hợp duy nhất ở trong tế bào nơi nó được dự trữ , có thể liên quan đến lưới nội chất, và sự di chuyển những túi nhỏ đến những thể protein đang hình thành để dự trữ (Greenwood và Bewley, 1984 )

Và một khi ở thể protein đang phát triển, những túi nhỏ này bằng cách nào

đó kết tụ thành dạng lớn hơn và dạng quả cầu bề mặt giàu electron gọi là globoid Nơi đó xuất hiện sự tương quan tốt giữa kích thước và tần xuất của những quả cầu

và tỷ lệ ( Mg + Ca )/K của mô hạt trưởng thành trên cơ sở trọng lượng khô (Lott

và ctv.,1985,1994; Lott và Ockenden, 1986) Tỷ lệ ( Mg + Ca )/ K càng cao thì tần xuất xuất hiện của những quả cầu cũng càng cao Ở những hạt có nồng độ K cao, Phytate bị phân tán trong hỗn hợp của những protein (Prattley và Stanley, 1983) Người ta cho rằng những yếu tố giống như Ca và Mg có thể tạo thành những cation đa trị, có thể gắn với những nhóm photphate mang điện tích âm của những axit phytic gần đó Những cầu nối đó là yếu tố chính tạo nên những globoid

Globoid không phải là những cấu trúc dự trữ tĩnh mà hoạt động như những hạt trao đổi ion có thể thay đổi thành phần trong quá trình tạo hạt và nảy mầm của

hạt Nói chung, khi mà hạt hình thành thì lượng K gia tăng ở globoid trong khi lượng Ca thì giảm (Ogawa và ctv.,1979) Trong suốt quá trình nảy mầm của hạt thì lượng K ở những globoid giảm nhanh chóng và những nguyên tố cation hai trị

và ba trị có xu hướng tăng một cách hữu hiệu ( Lott và ctv.,1995;Beecroft và Lott, 1996; Pitterman và ctv.,1996; Wada và Lott, 1997) Người ta cũng phát hiện ra rằng trong suốt quá trình nảy mầm, ở một số tế bào lá mầm xác định, globoid phát triển gấp bốn lần ở hạt khô (Pitt và Lott, 1996)

2.2.1 Axit phytic đối với cây trồng

Axit phytic là nguồn dự trữ Photpho chính trong cơ thể thực vật Axit phytic có thể kết hợp với các cation tạo thành dạng muối, gọi là phytate hay phytin Phytate có một số vai trò nhất định trong hạt và cây mầm, trong đó 2 vai trò sau đây có ý nghĩa nhất.Vai trò rõ nhất của phytate là nguồn dự trữ inositol, photphate, K, Mg, Ca, Mn, Fe và Zn cho mầm cây (Batten và Lott, 1986 ; Lott và Buttrose, 1978a, 1978b ;Chen và Lott, 1992; Wada và Lott, 1997) Những hợp chất dự trữ này được giải phóng cho cây mầm đang phát triển bởi hoạt động của những phytase (Chen và Pan, 1977) Vai trò thứ hai là nó điều khiển lượng photphate vô cơ cả ở hạt đang phát triển và cây mầm ( Strother, 1980 ) Hiện nay các nhà khoa học trong nông nghiệp đang chọn tạo giống cây trồng có hàm lượng axit phytic thấp, đặc biệt là ở những cây tạo ra hạt dùng làm lương thực thực phẩm Tuy nhiên vấn đề được đặt ra là liệu phát triển những cá thể cây trồng có hàm lượng axit phytic thấp có ảnh hưởng đến những tính trạng nông học của cây không như: năng suất cây trồng, khả năng sinh trưởng và phát triển của cây trồng…, đặc biệt là ở những vùng mà đất đai có hàm lượng photpho thấp (Graham và welch ,1996) Tuy nhiên những nghiên cứu cho thấy những cây trồng

có tính trạng axit phytic thấp thì lượng photpho tổng của chúng vẫn ở mức bình thường, không ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ P từ đất và năng suất cây trồng (Raboy, 1996) Ngoài ra những dạng đột biến axit phytic thấp này còn có khả năng ngăn không cho hạt tổng hợp P thành axit phytic

2.2.2 Axit phytic với con người, vật nuôi và môi trường

2.2.2.1 Ảnh hưởng của axit phytic đối với con người

Axit phytic có trong những thực phẩm được làm từ những nguyên liệu như ngũ cốc, gạo, cây họ đậu làm ngăn cản sự hấp thu ion kim loại như sắt (Fe3+), Magie (Mg2+ ), Canxi (Ca2+), kẽm (Zn2+) Sự kém hấp thu những ion kim loại này

đã tạo ra sự thiếu hụt những vi khoáng lượng cần thiết Ở trẻ em sự dinh dưỡng khoáng đặc biệt quan trọng trong giai đoạn cai sữa Giai đoạn này cơ thể đang phát triển nhanh chóng và nhu cầu cần ion rất cao Lúc này người ta thường cho trẻ ăn những loại cháo bột Do đó sự hấp thu ion của trẻ được lấy từ cháo bột là chủ yếu

vì hàm lượng ion có trong sữa mẹ thì thấp.Vì vậy khi thức ăn cháo bột này có hàm lượng axit phytic cao sẽ dẫn đến sự thiếu ion khoáng cho trẻ

Phytate còn có khả năng ảnh hưởng đến sự tiêu hóa tinh bột, protein liên kết với tinh bột, Ca (hoạt hóa enzym amylase) Phytate còn tạo phức với những protein và ức chế enzym trypsinogen

2.2.2.2 Ảnh hưởng của axit phytic đối với vật nuôi và môi trường

Tháng 12 năm 2002 cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ đưa ra những quy định mới trong việc quản lý nguồn chất thải trong chăn nuôi Trong vòng 30 năm qua các nhà chăn nuôi đã thay đổi từ hình thức trang trại nhỏ, thiếu tập trung đến trang trại lớn hơn và tập trung hơn Và vì thế một lượng lớn chất thải trong chăn nuôi cũng được thải ra ngoài môi trường Vấn đề đặt ra là làm sao gia tăng việc hấp thu dinh dưỡng tối đa ở thú để giảm lượng dinh dưỡng thải ra ngoài môi trường và tạo cân bằng dinh dưỡng ở nông trại

Khoảng 85% Photpho (P) có trong thực phẩm có nguồn gốc từ ngũ cốc dùng làm thức ăn cho heo thì không được sử dụng bởi vì Photpho liên kết ở dạng Phytate photphat (Veum và ctv., 2001) Heo thiếu enzym tiêu hóa phytase giữ vai trò trong việc giải phóng photpho liên kết từ vòng phytate inositol Vì vậy một lượng lớn P vô cơ thường được sử dụng để bổ sung vào khẩu phần ăn cho heo, đáp ứng nhu cầu P cho cơ thể đang phát triển của nó Tuy nhiên khi khẩu phần ăn được

cung cấp thêm P vô cơ, lượng photpho mà heo không sử dụng (liên kết trong hợp chất phytate) được thải vào môi trường và nếu không được quản lý tốt sẽ có thể gây nên những thiệt hại tiềm tàng cho môi trường

(Nguồn: Vũ Văn Vụ và ctv.,2000 Sinh lý học thực vật.)

Hình 2.4 Sơ đồ chu trình photpho trong tự nhiên

Ở gà cũng như những động vật dạ dày đơn khác (trong đó có cả heo) không thể tiêu hóa được axit phytic khi được cho ăn với khẩu phần có chứa ngô và đậu nành Kết quả là chúng bài thải axit phytic ra khỏi cơ thể chúng ở dạng phân có chứa P Nếu như đậu nành, ngô, gạo chứa lượng axit phytic thấp thì chúng sẽ thải ra lượng

P ít hơn trong phân Hiện nay các nhà công nghệ sinh học đã tạo ra giống ngô, đậu nành, gạo có hàm lượng axit phytic thấp nhằm làm giảm sự ô nhiễm do P có trong phân

Ngoài mục tiêu tạo ra những hạt có hàm lượng axit phytic thấp, ngành công nghệ sinh học cũng sản xuất được enzym phytase có nguồn gốc vi sinh vật

Apatit

Đá Macma Thực vật

biến đổi gen dùng làm nguồn bổ sung vào trong khẩu phần ăn Phytase là enzym làm phá vỡ cấu trúc của phytate Enzym này được sản xuất ở mức rất giới hạn ở động vật có vú, nhưng nó được tạo ra nhiều ở vi khuẩn Sự thêm phytase vào khẩu

phần ăn của thú dạ dày đơn cho thấy khả năng sử dụng P (Nelson và ctv., 1968;

Cromwell và ctv., 1991), cũng như những khoáng chất khác ( Biehl và ctv., 1995; Radcliffe và ctv., 1995; Simpson và Wise, 1990), protein và amino axit (Johnston, 2000; johnston và ctv., 2004) gia tăng Bằng việc sử dụng enzym phytase bổ sung vào khẩu phần ăn cho động vật giúp làm giảm hàm lượng Photpho có trong phân

So với công nghệ sinh học ứng dụng trong chăn nuôi thì công nghệ sinh học ứng dụng trong thực vật chiếm ưu thế hơn Tuy nhiên các nhà công nghệ sinh học trong nông nghiệp đã tạo được giống heo biến đổi gen có thể tạo ra enzym phytase có trong nước bọt và nó có thể tiêu hóa được axit phytic có trong thức ăn, chuyển từ dạng photpho không tiêu hóa được sang dạng photpho có thể sử dụng được Vì vậy lượng photpho trong phân được thải ra giảm đáng kể, khoảng 64% đến 67%

Phân gà được thải ra ngoài môi trường là nguồn phân bón cho cây trồng Tuy nhiên, nhiều P có trong phân thì không thể sử dụng được cho cây trồng bởi vì

nó nhanh chóng bị gắn kết ở trong đất Điều này đặc biệt đúng với phytate

Nếu như cây trồng có thể sử dụng photpho ở trong đất một cách hữu hiệu, thì người ta có thể dùng phân gà bón cho cây trồng mà không gây ảnh hưởng hoặc nếu có thì cũng không đáng kể đối với môi trường Các nhà công nghệ sinh học cũng đang nghiên cứu tạo ra những giống cây trồng có thể sử dụng photpho ở trong đất có nguồn gốc từ phân một cách hiệu quả nhằm giảm bớt sự ô nhiễm môi trường do lượng phân thải ra trong chăn nuôi

2.3 Công nghệ sinh học phân tử trên cây lúa

Ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trên thực vật không chỉ giải quyết những vấn đề khó khăn trong cải tiến giống cây trồng, an toàn lương thực thực phẩm, phát triển kinh tế mà còn bảo đảm sự bảo tồn, đa dạng hóa nguồn gen và sự bền

vững Công nghệ sinh học đang đóng vai trò như là công cụ sẵn sàng phục vụ cho các nhà chọn giống thực vật, nhằm ứng dụng và tạo ra nhiều định hướng để gia tăng sản lượng, đa dạng hóa cây trồng và sử dụng sản phẩm nguồn gen trong nông nghiệp ngày càng phát triển bền vững (IAEA, Wienna, 2002) Sự phát triển không ngừng với nhiều kỹ thuật hiện đại và ngày càng được cải tiến, được các nhà chọn giống và các nhà sinh học phân tử ứng dụng Các ứng dụng bắt đầu từ việc chọn vật liệu để tạo ra các các tổ hợp lai, thiết lập hay liên kết bản đồ gen trên các tính trạng quan trọng có ý nghĩa kinh tế qua di truyền số lượng (QTL) Thiết lập bản đồ QTL và sự liên kết các gen dựa trên sự chọn lọc nhờ vào các đánh dấu phân tử (MAS) ứng dụng trên quần thể hồi giao, quan hệ phả hệ và quần thể cận giao Thông qua sự so sánh của các hệ thống gen trên sinh vật, phương pháp đánh dấu phân tử cho phép khám phá và tìm ra sự đa dạng sinh học và tiến hóa của sinh vật (IAEA, Wienna, 2002)

Chiến lược chọn giống nhờ vào đánh dấu phân tử là phương pháp tác động mạnh đến hiệu quả chọn giống Các đánh dấu có kết quả kỹ thuật cao trên cơ sở PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm đánh giá kiểu gen của tính trạng mục tiêu được thế giới ủng hộ từ năm 1995 Chọn giống trên cơ sở đánh dấu phân tử từ nguyên lý cơ bản là chứng minh, đánh dấu liên kết với gen nằm đúng vị trí (locus) trên nhiễm sắc thể và vị trí này phản ánh được đặc tính mong muốn Các đánh dấu được chia thành hai nhóm: đánh dấu trên cơ sở PCR và đánh dấu thăm dò và lai DNA ( Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999) Các kỹ thuật đánh dấu phân tử như RFLP, AFLP, RAPD, SSR, ISSR, AFL, SCAR và STS cho phép chọn lọc trực tiếp nhiều tính trạng trên quần thể F2, quần thể cận giao, những dòng đơn bội kép và những dòng tái tổ hợp (IAEA, Wienna, 2002) Ứng dụng đánh dấu phân tử

trên cây lúa (Oryza sativa L.) thành công trong chọn giống chống chịu một số sâu

bệnh hại quan trọng như lập bản đồ gen kháng bệnh đạo ôn (Yu và ctv.,1991), gen kháng bệnh bạc lá (Mc couch, 1991), lập bản đồ gen kháng rầy nâu (Nguyễn Thị Lang và ctv., 2002), gen kháng sâu đục thân (Tan và ctv., 1993) Đánh dấu phân tử RFLP đã được ứng dụng để thiết lập bản đồ gen trên cây lúa Bản đồ phủ trên 12

nhiễm sắc thể và có chiều dài tổng cộng 1389cM từ cặp lai IR34538 (Indica) và Bulu Dalam (Mc couch và ctv, 1998)

Trong những thập niên qua, di truyền Menden đã và đang bước vào thời đại mới, được gọi là hệ gen (Genomics), nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của các gen Những thông tin về chuỗi mã DNA đã được giải mã trên một số loài điển

hình như lúa và Arapidopsis, nhưng chức năng của các gen tìm thấy chưa được

biết nhiều Việc tạo ra đột biến trên cây trồng kết hợp với đánh dấu phân tử đang đóng một vai trò quan trọng để giải quyết vấn đề trên, khi tác nhân gây đột biến làm thay đổi các tính trạng mang gen mục tiêu Các đánh dấu ứng dụng hiện nay được xem như có hiệu quả đáng tin cậy là đánh dấu “siêu vệ tinh” hay còn gọi là SSR (simple sequence repeats) và đang đưa vào ứng dụng rộng đánh dấu “các thể

đa hình nucleotide đơn” hay SNP (Single nucleotid polymorphism) để xác định đột biến

2.4 Nghiên cứu di truyền gen axit phytic thấp

Kiểu gen và môi trường là những nhân tố chính làm thay đổi tổng lượng photpho trong hạt.Trong tự nhiên các kiểu gen điều khiển sự thay đổi lượng photpho trong hạt chủ yếu là tăng hay giảm hàm lượng axit phytic mà các thành phần chứa photpho khác không thay đổi Người ta đã tạo được một số gen lặn (lpa) làm giảm hàm lượng axit phytic bằng phương pháp gây đột biến bằng hoá chất và phân lập gen này ở trên cây bắp và cây lúa mạch Các gen này làm thay đổi rất lớn giữa các thành phần chứa photpho trong hạt như axit phytic, các inositol photphate khác và photphate tự do.Trong đó gen đột biến lpa1 làm giảm hàm lượng axit phytic bằng cách tự cân bằng sinh học trong phân tử với photphat

tự do (tức là làm tăng hàm lượng photphat tự do) Gen này được xác định nằm trên chromosome 1S của cây bắp và trên chromosome 2H của cây lúa mạch Tương tự đối với gen lpa2 thì axit phytic giảm cùng với các dạng inositol photphate khác và làm tăng lên photphate tự do Gen đột biến lpa2 được xác định nằm trên chromosome 1S của cây bắp và chromosome 2H của cây lúa Như vậy cho đến

nay tất cả các gen đột biến cho hàm lượng axit phytic thấp đều làm tăng lượng photphate tự do Đây chính là chỉ thị trong việc chọn lọc các dòng lúa đột biến có hàm lượng axit phytic thấp

Đột biến axit phytic thấp được tạo ra do các tác nhân đột biến trên các loài cây trồng như bắp, lúa gạo, lúa mạch và đậu nành ( Ras-mussen và Hatzack, 1998; Larson và ctv., 2000; Raboy và ctv., 2000; Wilcox và ctv., 2000) và được ứng dụng trong nghiên cứu chọn giống di truyền (Raboy và ctv., 2001) Có hai loại đột biến ảnh hưởng đến axit phytic thấp trên bắp là đột biến lpa1 làm giảm lượng axit phytic nhưng không tích lũy inositol polyphotphate và đột biến lpa2 cũng làm giảm lượng axit phytic nhưng hạt đột biến này tích lũy InsP3, InsP4 và InsP5 (Raboy và ctv., 2000) Dạng đột biến lpa2 ở ngô (Zea mays) xảy ra do sự đột biến

ở gen inositol phosphate kinase Gen inositol phosphate kinase ở ngô (ZmIpk) được xác định thông qua sự so sánh trình tự với gen Ins(1,3,4)P3 5/6-kinase ở

người và Arabidopsis Dạng mRNA của gen ZmIpK biểu hiện ở trong phôi, nơi

mà hàm lượng axit phytic gia tăng ở hạt ngô Phân tích Southern-blot, cloning, đọc trình tự gen ZmIpK từ dạng đột biến lpa2 cho thấy alen lpa2-1 được tạo ra do sự sắp xếp lại trình tự ở locus của gen ZmIpK và alen lpa2-2 được tạo ra do sự đột biến nucleotide làm xuất hiện một codon stop ở đầu N của gen ZmIpK Và điều này cho thấy ZmIpK là một trong những enzym kinase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp axit phytic trong giai đoạn phát triển của hạt Sinh tổng hợp axit phytic thấp trong hạt và sự xác định gen thông qua con đường phân lập các nhân bản cDNA trên bắp Các nhân bản này có chuỗi mã di truyền giống với nhiều inositol photphat kinase từ động vật và nấm men Ứng dụng kỹ thuật bất hoạt chèn đoạn

mã đột biến (Mutator insertion knockout) để điều tra chức năng của gen Sau khi bất hoạt những gen này, hàm lượng axit phytic trong hạt sẽ giảm, hạt sẽ tích lũy myo-inositol, inositol photphat và photphat tự do

Trong sự phát triển của hạt, axit phytic được tổng hợp từ quá trình đường phân (Gluco-6-P) Enzym Ins(3) P1 synthase (MIPS) xúc tác quá trình Glucose-6-photphate để tạo ra Ins(3) P1

Phân tích clone MIPS ở cây yến mạch (Avena sativa) cho thấy clone này chứa

1936 bp (accession no AB059557) mã hóa cho polypeptid có số lượng amino axit

là 510 và có tính tương đồng cao với nhiều loại cây trồng khác Theo Yoshida và ctv cho thấy độ tương đồng amino axit giữa protein MIPS ở cây yến mạch với protein MIPS của các cây khác vào khoảng 77 đến 88% (Yoshida và ctv 1999, Hageman và ctv 2001) Protein MIPS có trọng lượng 56.13 kD Phân tích bằng phương pháp Northern blot cho thấy gen MIPS biểu hiện cao trong suốt giai đoạn đầu trưởng thành của hạt và giảm hoạt động ở cuối giai đoạn trưởng thành Nồng

độ axit phytic cũng tăng từ từ cùng với sự trưởng thành của hạt RNA của gen MIPS ít được phát hiện thấy ở hoa và không phát hiện được ở thân và lá Nồng độ RNA MIPS cao nhất được phát hiện ở những hạt giai đoạn chưa trưởng thành của hạt và giảm từ từ theo quá trình phát triển của hạt

Hình 2.5 Phân tích bằng phương pháp Northern-blot ở cây yến mạch A: biểu hiện của gen MIPS ở hạt chưa trưởng thành (1), lá (2) và thân (3) sau

5 ngày trổ hoa B: Biểu hiện gen MIPS ở hạt đang phát triển lúc 0, 5, 10, 15

và 25 ngày sau khi trổ hoa

(Nguồn:www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/3/2/1/724_saneoka.htm)

Hình 2.6 Sự thay đổi nồng độ P tổng, axit phytic và và P vô cơ sau khi trổ

hoa ở cây yến mạch

(Nguồn:www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/3/2/1/724_saneoka.htm)

Phân tích hàm lượng P tổng số, axit phytic cho thấy nồng độ P tổng số ở hoa là 3,51 mg/g trọng lượng khô (DW), và tăng từ từ với sự trưởng thành của hạt (Hình 2.6) Nồng độ P tổng số ở hạt trưởng thành đạt 10,15 mg/g trọng lượng khô lúc 65 ngày sau khi ra hoa (giai đoạn trưởng thành đầy đủ ) Axit phytic bắt đầu tăng ở giai đoạn đầu và tăng nhanh cùng sự trưởng thành của hạt với nồng độ 5,97 mg/g trọng lượng khô Nồng độ P vô cơ là 1,58 mg/g trọng lượng khô ở hoa và tăng đến 3,3 mg/g trọng lượng khô sau 30 ngày trổ hoa, sau đó giảm nhanh cùng với sự tăng lên của axit phytic Những hợp chất chứa P khác ngoại trừ axit phytic và axit

vô cơ thì nồng độ tương đương với nồng độ P vô cơ ở giai đoạn phát triển ban đầu của hạt Hợp chất P khác chứa P tế bào được định nghĩa là những hợp chất đường

có chứa P, trọng lượng phân tử thấp tham gia vào thành phần cấu tạo của màng tế bào Những hợp chất này là những tiền chất quan trọng trong sinh tổng hợp axit phytic và inositol photphat P được hấp thụ bởi cây trồng sẽ được chuyển trực tiếp vào hạt và đóng vai trò quan trọng cho việc tổng hợp những hợp chất hữu cơ chứa

P ở giai đoạn đầu của quá trình trưởng thành Những kết quả nghiên cứu này cho thấy enzym MIPS biểu hiện mạnh trong hạt và đóng vai trò sinh tổng hợp axit phytic trong suốt quá trình phát triển của hạt

2.5 Đánh dấu siêu vệ tinh (Microsatellite)

Đánh dấu siêu vệ tinh hay SSR được ứng dụng thành công từ năm 1995 (Mc

couch và ctv., 1996) Đó là tập hợp các đoạn chuỗi mã rất ngắn từ 2-10bp Các

đoạn này xuất hiện trên chuỗi mã DNA được lặp đi lặp lại nhất định, sắp xếp ngẫu nhiên, rất khác nhau được phân tán khắp nơi trên bộ gen động vật thực vật và con người (Gunter Kahl, 2001) Những chuỗi mã ngắn này có thể ở dạng lặp lại của hai, ba hay bốn nucleotid và được xắp xếp ngẫu nhiên trên một dãy của 5-50 bản sao (copy) chẳng hạn như (AT)29, (CAC)16 hay (GACA)32 SSR xuất hiện rất nhiều

trên bộ gen thực vật và có mặt trung bình sau mỗi 6-7kb (Cardle và ctv., 2000)

Các đoạn này được khuyếch đại trong phản ứng PCR nhờ vào mồi xuôi và mồi ngược Sản phẩm PCR chứa các alen SSR được tách rời thông qua điện di trên gel agarose hay gel acrylamide

SSR hữu ích trong việc thiết lập bản đồ di truyền, bản đồ vật lý và bản đồ chuỗi

mã cơ bản (Sequence-based) trên cây lúa Ngoài ra SSR còn cung cấp cho nhà chọn giống và nhà di truyền công cụ đáng tin cậy và hiệu quả để liên kết sự khác biệt giữa kiểu gen và kiểu hình

2.6 Quá trình sinh tổng hợp axit phytic

Con đường sinh tổng hợp axit phytic có thể tóm tắt gồm 2 phần sau: sự cung cấp Ins và sự tổng hợp Ins polyphotphat sau đó Nguồn tổng hợp vòng Ins duy nhất là enzym Ins(3) P1 synthase (MIPS) Enzym này chuyển Glc-6-P thành Ins(3)

P1(Loewus và Murthy, 2000) Hoạt tính enzym Ins(3) P1synthase ở những hạt đang phát triển cung cấp Ins cũng như Ins(3)P1 (Yoshida và ctv., 1999) mà sau đó

sẽ được chuyển thành axit phytic qua sự photphoryl hóa của hai hay nhiều enzym

kinase (Biswas và ctv., 1978; Stephens và Irvine, 1990 ) Bước photphoryl hóa

Inositol đầu tiên được xúc tác bởi enzym Inositol kinase Enzym này cũng xúc tác tạo ra Ins(3)P1 (Englishvà ctv., 1966; Loewus và ctv., 1982) Con đường tổng hợp

axit phytic khởi đầu bằng cơ chất ban đầu là Ins, hoạt động của enzym Ins kinase

và trải qua nhiều giai đoạn photphoryl hóa thông qua những hợp chất trung gian đã

được miêu tả lần đầu tiên thông qua những nghiên cứu ở nấm nha bào

Dictyostelium discoideum (Stephens và Irvine, 1990) và những nghiên cứu sau này

ở tập đoàn đơn bào Spirodela polyrhiza (Brearley và Hanke, 1996, 1996b Con đường sinh tổng hợp ở D Discoideum tiến hành thông qua những hợp chất trung

gian Ins(3)P1, Ins(3,6) P2, Ins(3,4,6) P3, Ins(1,3,4,6) P4, và Ins(1,3,4,5,6)P5 Con

đường sinh tổng hợp axit phytic ở S Polyrhiza tiến hành thông qua những hợp

chất trung gian Ins(3) P1, Ins(3,4) P2, Ins(3,4,6) P3, Ins(3,4,5,6) P4, và

Ins(1,3,4,5,6) P5 Những con đường này có điểm chung ở những hợp chất trung gian đầu và cuối Những Ins photphat này vẫn chưa được biết với vai trò là những chất truyền tín hiệu thứ cấp

Sự tổng hợp axit phytic cũng có thể tiến hành một phần qua những con đường liên quan đến những chất truyền tín hiệu bao gồm photphatidylinositol (PtdIns), những photphat trung gian và Ins(1,4,5)P3 (Bước 6 và 7; Van der kayy và ctv., 1995; York và ctv., 1999) Ins photphat bị photphoryl hóa ở mức độ cao hơn axit

phytic như là InsP7 và InsP8, là những hợp chất được ghi nhận là xảy ra phổ biến ở

tế bào eukaryotic (steps 12 và 13; Mayr và ctv., 1992; Menniti và ctv., 1993; Stephens và ctv., 1993; Brearley và Hanke, 1996c; Safrany và ctv., 1999)

Những nghiên cứu còn cho thấy (Biswas và ctv., 1978b; Phillippy và ctv., 1994; Brearley và Hanke, 1996b) Ins(1,3,4,5,6) P5 còn đóng vai trò là chất Ins

photphat sau cùng trong con đường tổng hợp axit phytic ở tế bào eukaryotic

Hình 2.7 Sơ đồ con đường sinh tổng hợp axit phytic ở trong tế bào eukaryo: (1), D-Ins(3)-P 1 (or L-Ins[1]-P 1 ) synthase; (2), D-Ins 3-phosphatase (or L-Ins 1-phosphatase); (3), D-Ins 3-kinase (or L-Ins 1-kinase); (4), Ins P- or polyP kinases; (5), Ins (1,3,4,5,6) P 5 2-kinase hay phytic acid-ADP phosphotransferase; (6), PtdIns synthase; (7), PtdIns và PtdIns P kinases, theo sau bởi PtdIns P-specific phospholipase C, và Ins P kinases; (8), D- Ins(1,2,3,4,5,6) P 6 3-phosphatase; (9) D-Ins(1,2,4,5,6) P 5 3-kinase; (10), D- Ins(1,2,3,4,5,6) P 6 5-phosphatase; (11), D-Ins(1,2,3,4,6) P 5 5-kinase; (12), pyrophosphate-forming Ins P 6 kinases; (13), pyrophosphate-containing Ins PolyP-ADP -phosphotransferases

Nguồn: http://www.plantphysiol.org/cgi/content/full/124/1/355

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện từ ngày 1 tháng 3 năm 2005 đến ngày 1 thánh 8 năm

2005 tại phòng phân tích sinh hóa và phòng thí nghiệm sinh học phân tử thuộc Bộ Môn Di Truyền và Chọn Giống của Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, quận

Ô Môn, TP Cần Thơ

3.2 Vật liệu

Tên của các giống lúa trong thí nghiệm

Bảng 3.1 Tên các giống lúa được phân tích

OM 1490 đột biến OMCS 2000 đột biến Lúa mùa

OM CS2000 được phát triển từ cặp lai OM1738/MRC19399 và OM 1490 được phát triển từ cặp lai OM606/IR44592-62-1-3-3 Đây là hai giống được chọn

số dòng nhiều để đánh giá và phân tích hàm lượng axit phytic

Quần thể lúa đột biến OM1490 và OMCS2000 được tạo ra bằng việc gây đột biến bằng tia gamma với 5 Kr và phát triển thông qua chọn lọc ở các thế hệ

M0 M1 , M2, M3 và M4

AS996 được phát triển từ phương pháp lai xa và cứu sống phôi mầm IR 64/

O Rufipogon và được phóng xạ bằng tia gamma với 3Kr

Nàng thơm Chợ Đào -5 được đột biến bằng tế bào soma và tiếp tục được đột biến với tia phóng xạ gamma với cường độ 5 Kr

Qui trình phát triển dòng đột biến OM 1490 và OMCS 2000 ( Lang 2004)

Máy điện di nằm ngang (Gibco BRL model 4001-Life technologies)

Máy chụp hình gel bằng tia UV

3.4.2 Hóa chất

3.4.2.1 Hóa chất phân tích sinh hóa

HCL, H2SO4, Amonium Molybdate, Axit Ascorbic, K2HPO4 của Trung Quốc

3.4.2.2 Hóa chất phân tích phân tử

Các hóa chất ly trích DNA bao gồm: Cloroform : isoamylalcohol (24:1), Isopropanol, Etanol 100% và 70%, Dung dịch đệm ly trích DNA (xem phụ lục), SDS, CTAB, NaCl, TE thuộc hãng Merck của Đức

Các hóa chất trong chạy điện di: Agarose (Mỹ), Dung dịch TAX 50X và TBE 10X

Các hóa chất chạy PCR : Dung dịch stock của dNTPs (5mM), dung dịch stock của PCR buffer (10X)

3.5 Xác định lượng photpho trong hạt bằng phương pháp sinh hoá

Dùng phương pháp tách chiết từng hạt theo Chen và ctv (1956) thực hiện trên đĩa vi độ chuẩn 96 giếng

3.5.1 Phương pháp thực hiện

Chuẩn bị pha dung dịch Chen’s :

Bảng 3.2 Thành phần các hóa chất trong dung dịch Chen’s

H2O Chuẩn bị thang photpho chuẩn cho thí nghiệm 96 giếng Thang photpho chuẩn này được thực hiện trên đĩa vi độ chuẩn 96 giếng và dùng để so sánh với mẫu phân tích của các dòng lúa khác

Ngoài ra cần lưu ý là dung dịch Chen’s và thang Photpho chuẩn phải được pha mới từng ngày

Thang chuẩn Photpho được pha theo 5 mức sau:

Bảng 3.3 Thang photpho chuẩn theo 5 mức

Mức µl 1mM

K2HPO4

µl HCl 0.4M µl H2O

3.5.2 Tiến hành phân tích

Tiến hành bóc hạt lúa để lấy hạt gạo bên trong của các dòng thuộc các giống trên và cho vào từng gói có đánh dấu riêng biệt theo từng dòng.Trong đó bao gồm có 185 dòng OM 1490 đột biến, 165 dòng OMCS 2000 đột biến, 2 dòng

bố mẹ của OM 1490 và OMCS 2000, 150 dòng thuộc giống lúa mùa và cao sản Ngoài những giống trên còn có thêm các giống khác như lúa hoang, golden rice, huyết rồng, Lpa-1, Lpa-2, Xie Q Zao dùng làm đối chứng trong phân tích Những dòng này đã được đột biến thành công về tính trạng axit phytic thấp

Bước 1: Lấy mỗi dòng 8 hạt, nghiền riêng từng hạt và cho từng hạt đã được nghiền vào từng giếng theo hàng dọc

Bước 2: Cho vào mỗi giếng 200 µl HCL 0.4M và ủ qua đêm ở nhiệt

độ phòng

Bước 3: Trích từ mỗi giếng 10 µl sang giếng mới, sau đó thêm vào 90µl

H2O vào mỗi giếng Thêm vào 100µl dung dịch Chen’s vừa mới pha

Bước 4: Ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 tiếng Kết quả được so sánh với thang Photpho chuẩn Hạt càng xanh đậm được đánh giá là hạt có hàm lượng axit phytic càng thấp nghĩa là khoáng vi lượng càng cao

Hình 3.1 Thang photpho chuẩn

3.6 Đánh giá kiểu gen qua chỉ thị phân tử

3.6.1 Phân lập DNA từ mẫu lá lúa (Nguyễn Thị Lang, 2002 )

Lấy mẫu lá: Mô lá lúa non, khỏe được lấy trên từng cá thể riêng lẻ sau khi đã gieo được 10 ngày cho vào ống tube, ghi nhãn cẩn thận và được đặt trong thùng đá

Ly trích DNA: Ở đây DNA được ly trích theo phương pháp CTAB Có thể tiến hành ly trích DNA theo những phương pháp khác đơn giản hơn, tuy nhiên phương pháp này cho ra kết quả tinh sạch hơn

Giới thiệu phương pháp CTAB

1.Cắt lá nhỏ và nghiền trên cối

7 Ủ trong water bath khoảng10 phút ở nhiệt độ 65oC

8 Chuyển mẫu vào tube mới (1,5ml or 2 ml)(có thể không chuyển)

9 Thêm 900µl cloroform : isoamyl alcohol = 24 :1 và ly tâm 12000 vòng trong 3 phút

10.Chuyển supernatant vào một tube mới 2.0 và thêm vào 600ul isopropanol

Vai trò của một số chất ly trích

1 Chất phá vỡ màng tế bào :

Màng tế bào cấu tạo là lớp lipid kép được phá vỡ bằng chất tẩy Ví dụ: SDS (sodium dodecylsulfat, lauryl sulfat, 2- mercaptoethanol Trong đó 2-mercaptoehanol có tác dụng phá màng mạnh

Trong dung môi chiết luôn hiện diện 2 chất là EDTA và Tris

EDTA: có tác dụng gắn chặt ion Mg++ Vì các enzym nuclease muốn hoạt động cần Mg++làm cofactor, do đó EDTA gắn chặt với Mg++ làm bất hoạt enzym này góp phần bảo vệ DNA

Tris: có tác dụng đệm rất hiệu quả giúp dung môi luôn giữ ở pH 8 vì

ở pH đó DNA rất ổn định Trong môi trường acid purin rất dễ bị loại thải

2 Chất loại tạp ( protein, polysaccharid…):

Để loại bỏ tạp chủ yếu là protein sử dụng tác nhân biến tính protein ( dung dịch chloroform : isoamyl alcohol = 24:1)

Tủa trong isopropanol: không cần sự hiện diện của muối, thể tích isopropanol thấp ( 0,6 thể tích mẫu ) Các DNA trọng lượng phân tử thấp không

bị tủa do đó có thể loại bỏ chúng khi tủa bằng isopropanol

Tủa bằng CTAB ( cetyltrimethylammonium bromid):