KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes

Ngành chăn nuôi Việt Nam hiện nay đang có những chuyển biến mới. Số lƣợng bầy đàn ngày càng tăng và tình hình bệnh trong chăn nuôi ngày càng có nhiều diễn biến phức tạp. Vì thế yêu cầu kiểm soát mầm bệnh đảm bảo sức khỏe cho thú nuôi là yêu cầu cấp thiết. Bên cạnh đó, nhà chăn nuôi còn nhắm tới hiệu quả kinh tế tối đa trong sản xuất với những chi phí tối thiểu. Đó cũng là mục tiêu của các nhà khoa học nhằm ứng dụng thành quả nghiên cứu khoa học trong chăn nuôi.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN

CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa: 2001 – 2005

Sinh viên thực hiện: Trần Hạnh Triết

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN

CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm tạ:

 Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm

Bộ Môn công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

 TS Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

 Phòng vi sinh khoa Chăn nuôi – Thú y, Trường đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

 Phòng phân tích hóa lý – Trung tâm phân tích thí nghiệm, Trường đại học Nông Lâm

 Những anh chị lớp Thú y K26; các bạn lớp Chăn nuôi K27 đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp cùng thời gian với tôi tại phòng vi sinh khoa Chăn nuôi – Thú y, Trường đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

 Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập

 Ba mẹ đã luôn động viên, chăm lo cho con trong suốt thời gian thực hiện đề tài

TÓM TẮT

TRẦN HẠNH TRIẾT, Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 “NGHIÊN

CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus

sporogenes”

Hội đồng hướng dẫn:

TS NGUYỄN NGỌC HẢI

Đề tài được thực hiện trên đối tượng là các chủng vi khuẩn L sporogenes phân

lập từ chế phẩm (Thorne Research, USA) Bước đầu, chúng tôi tìm hiểu về đặc điểm hình thái vi/đại thể và sinh hóa của vi khuẩn Sau đó, tiếp tục khảo sát những đặc tính khác: khả năng sinh acid lactic trong môi trường 10% sữa đặc có đường; khả năng hình thành bào tử trong hai loại môi trường nuôi cấy MRSA và GYE, hai điều kiện nhiệt độ - thời gian 370C/6 ngày và 370C/2 ngày chuyển sang 500C/2 giờ và 700

C/2 giờ Những khảo sát về mặt sinh trưởng và phát triển tạo cơ sở cho nghiên cứu ứng

dụng sản xuất chế phẩm từ bào tử vi khuẩn L sporogenes sau này

Những kết quả đạt được:

1 Đã phân lập được vi khuẩn L sporogenes

2 Vi khuẩn L sporogenes có khả năng sản sinh acid lactic nhưng hàm lượng

không cao (0,144 – 0,342 g/100 ml môi trường sữa)

3 Môi trường nuôi cấy (MRSA và GYE) và điều kiện nhiệt độ - thời gian hóa bào

tử (370C/6 ngày và 370C/2 ngày → 500C/2 giờ → 700C/2 giờ) ảnh hưởng không có

ý nghĩa lên sự hình thành bào tử của các chủng L sporogenes khảo sát

MỤC LỤC

Trang tựa

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình ix

Danh sách các sơ đồ x

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 1

1.3 Yêu cầu 1

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quan về probiotic 2

2.1.1 Định nghĩa về probiotic 2

2.1.2 Các chức năng sinh học của probiotic 2

2.1.2.1 Tăng khả năng tiêu hóa nhờ hệ thống enzyme 2

2.1.2.2 Tổng hợp vitamin K và nhóm B 2

2.1.2.3 Giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột 3

2.1.2.4 Trung hòa độc tố và phân hủy một số độc chất 3

2.1.2.5 Kích thích hệ thống miễn dịch 4

2.1.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong chăn nuôi 4

2.1.3.1 Trong nước 4

2.1.3.2 Thế giới 5

2.2 Tổng quan về Lactobacillus sporogenes 5

2.2.1 Lịch sử phát hiện 5

2.2.2 Đặc điểm phân loại 5

2.2.3 Đặc điểm phân bố 6

2.2.4 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 6

2.2.4.1 Tế bào sinh dưỡng 6

2.2.4.2 Bào tử 8

2.2.5 Những đặc điểm, chức năng sinh học tương đồng giữa L sporogenes và các vi khuẩn Lactobacillus khác 9

2.2.5.1 Những đặc điểm trao đổi chất 10

2.2.5.2 Lợi ích trong dinh dưỡng và trị liệu 13

2.2.6 Các đặc tính giúp L sporogenes vượt trội hơn các vi khuẩn Lactobacillus khác trong ứng dụng làm probiotic 15

2.2.7 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng L sporogenes 18

3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 19

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 19

3.1.1 Thời gian 19

3.1.2 Địa điểm 19

3.2 Vật liệu nghiên cứu 19

3.2.1 Mẫu khảo sát 19

3.2.2 Môi trường 19

3.2.3 Hóa chất 19

3.2.4 Thiết bị – dụng cụ 19

3.3 Nội dung đề tài 19

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.4.1 Tổng quan các bước thực hiện đề tài 20

3.4.2 Phân lập vi khuẩn 20

3.4.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào 21

3.4.2.2 Khảo sát các phản ứng sinh hóa 22

3.4.3.Khả năng sinh acid lactic 22

3.4.3.1 Định tính 22

3.4.3.2 Định lượng 23

3.4.4 Khảo sát khả năng hình thành bào tử 24

3.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 27

4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes 28

4.1.1 Bố trí thí nghiệm 28

4.1.2 Đặc điểm hình thái của L sporogenes 28

4.1.2.1 Quan sát khuẩn lạc 28

4.1.2.2 Quan sát hình thái tế bào 29

4.1.2.3 Quan sát hình thái bào tử 29

4.1.3 Đặc điểm sinh hóa của L sporogenes 29

4.2 Khả năng sinh acid lactic 31

4.2.1 Định tính 31

4.2.2 Định lượng 32

4.3 Khảo sát khả năng hình thành bào tử 34

5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 36

6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CV Coefficient of variation, hệ số biến thiên

FDA Food & Drug Administration, cơ quan quản lý thực phẩm và

dƣợc phẩm của Mỹ GRAS Generally Recognise As Safe, chứng nhận an toàn cho sức

khỏe MRSA De Man-Rogosa-Sharpe agar

GYE Glucose Yeast Extract

SD standard deviation, độ lệch chuẩn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Những tương đồng về mặt hình thái của L sporogenes và Lactobacillus 6

Bảng 2.2 Những khác biệt về hình thái của L sporogenes so với Bacillus 6

Bảng 2.3 Những tương đồng về đặc điểm sinh trưởng và sinh hóa của L sporogenes và Lactobacillus 7

Bảng 2.4 Những khác biệt về đặc điểm sinh trưởng và sinh hóa của L sporogenes so với Bacillus 8

Bảng 2.5 Một vài loại bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus 11

Bảng 2.6 Tác dụng của một vài sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus 12

Bảng 2.7 Bảng liệt kê những ưu điểm của L sporogenes so với L acidophillus 17

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn L sporogenes 24 Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn L sporogenes 28

Bảng 4.2: Đặc điểm sinh hóa của các chủng L sporogenes phân lập được từ chế phẩm 30 Bảng 4.3 Khả năng sinh acid lactic của các chủng L sporogenes đã thử sinh hóa 31

Bảng 4.4: Giá trị độ Therner và lượng acid lactic do vi khuẩn L sporogenes sản xuất 33

Bảng 4.5 Số lượng bào tử L sporogenes thu được trong 12 nghiệm thức được khảo sát 34

DANH MỤC CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Giản đồ cấu tạo bào tử 8

Hình 2.2 Hai loại đồng phân acid lactic 11

Hình 2.3 Cơ chế ngăn chặn sự hình thành và hấp thụ cholesterol 14

Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn L sporogenes trên môi trường GYE 38

Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn L sporogenes được phóng đại 1000 lần dưới kính hiển vi 29

Hình 4.3: Phản ứng lên men một số loại đường của vi khuẩn L sporogenes 31

Hình 4.4: Thí nghiệm tạo acid lactic của vi khuẩn L sporogenes 32

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

SƠ ĐỒ TRANG

Sơ đồ 2.1 Ích lợi của Lactobacillus về mặt dinh dưỡng và trị liệu 13

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, phát triển của L sporogenes 20

Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập và định danh L sporogenes 20

Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa 21

Sơ đồ 3.4: Quy trình tiến hành thủ nghiệm sinh hóa 22

Sơ đồ 3.5: Quy trình xác định độ chua Therner 23

Sơ đồ 3.6: Quy trình khảo sát sự hình thành vào nảy chồi của bào tử L sporogenes 25

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngành chăn nuôi Việt Nam hiện nay đang có những chuyển biến mới Số lượng bầy đàn ngày càng tăng và tình hình bệnh trong chăn nuôi ngày càng có nhiều diễn biến phức tạp Vì thế yêu cầu kiểm soát mầm bệnh đảm bảo sức khỏe cho thú nuôi là yêu cầu cấp thiết Bên cạnh đó, nhà chăn nuôi còn nhắm tới hiệu quả kinh tế tối đa trong sản xuất với những chi phí tối thiểu Đó cũng là mục tiêu của các nhà khoa học nhằm ứng dụng thành quả nghiên cứu khoa học trong chăn nuôi

Hiện nay, bệnh đường tiêu hóa đã và đang gây nhiều tổn thất về mặt kinh tế cho các nhà chăn nuôi Việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh này đang dần hạn chế do những tác dụng phụ Liệu pháp thay thế cho kháng sinh là sử dụng probiotic (chế phẩm sinh học) ngày càng được chú trọng Probiotic là một hỗn hợp các vi khuẩn sống có lợi hay các enzyme của chúng Chúng có tác dụng ức chế các vi sinh vật gây bệnh, làm cân bằng lại

hệ vi sinh vật đường ruột, tổng hợp vitamin B, thúc đẩy sự tăng trưởng của thú nuôi Trong hỗn hợp probiotic, mỗi vi khuẩn có một đặc tính có lợi riêng Trong đó, nhóm vi

khuẩn Lactobacillus mà đặc biệt là Lactobacillus sporogenes với khả năng tạo bào tử sẽ

cho phép kéo dài thời gian bảo quản và tế bào sinh dưỡng sau khi phục hồi vẫn có hoạt

tính ổn định Nhờ vậy mà L sporogenes ngày càng được ứng dụng nhiều trong sản xuất

chế phẩm sinh học

1.2 Mục đích

Tìm hiểu một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes nhằm ứng dụng để

sản xuất chế phẩm vi sinh (probiotic)

1.3 Yêu cầu

Phân lập các chủng L sporogenes từ các sản phẩm chế phẩm sinh học có sẵn

Đánh giá khả năng hình thành bào tử trong điều kiện nhiệt độ và môi trường nuôi cấy thay đổi

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.3 Tổng quan về probiotic

2.3.1 Định nghĩa về probiotic

Thuật ngữ probiotic lần đầu tiên được đưa ra bởi Lilly và Stillwell vào năm 1965 để mô

tả những yếu tố kích thích sinh trưởng do vi sinh vật tạo ra [4] Những nghiên cứu tiếp theo giúp hoàn thiện dần định nghĩa về probiotic Cho đến nay, theo Havenaar (1992) thuật ngữ probiotic được hiểu là một loại hay hỗn hợp các vi sinh vật sống ảnh hưởng có lợi đối với động vật và người bằng cách cải thiện những tính chất của hệ vi sinh vật có sẵn trong đường ruột vật chủ [4] Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic là những vi sinh vật sống trong tự nhiên bao gồm vi khuẩn, nấm mốc và nấm men [2]

2.3.2 Các chức năng sinh học của probiotic

2.3.2.1 Tăng khả năng tiêu hóa nhờ hệ thống enzyme

Vi sinh vật đường ruột có lợi của động vật nuôi có một vai trò quan trọng trong sự tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ Chúng tham gia vào quá trình tiêu hóa các chất dinh dưỡng trong khẩu phần như: carbonhydrate, protein, lipid…thành những chất dễ hấp thu hơn nhờ hệ thống enzyme của chúng như: amylase, protease, cellulase… Nhóm

này gồm những vi khuẩn: Bacillus subtilis, Ruminococcus, Cellulomonas,

Saccaromyces cerevisiae, Aspergillus oryzae, Lactobacillus,…

Theo một số nghiên cứu của Nahashon, việc bổ sung Lactobacillus vào trong khẩu

phần bắp, lúa mạch, đậu nành đã kích thích thèm ăn và tăng tích lũy mỡ, N, Ca, P, Cu

và Mn cho gà đẻ [2]

Ngoài ra, việc bổ dung chế phẩm Saccharomyces boulardii vào khẩu phần gà thịt

làm giảm hệ số chuyển đổi thức ăn trên 1 kg tăng trọng, ảnh hưởng phần nào lên sức đề kháng, làm giảm tỉ lệ chết, tăng hiệu quả sản xuất

2.3.2.2 Tổng hợp vitamin K và nhóm B

Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp vitamin nhóm B như B1, B2, B6, B12 và vitamin K ở manh tràng và đại tràng

Bản thân tế bào nấm men có chứa một lượng dinh dưỡng rất cao bao gồm: protein, lipid, glucid, khoáng và nhiều vitamin nhất là vitamin nhóm B, cải thiện tăng trưởng và sức đề kháng

2.3.2.3 Trung hòa độc tố và phân hủy một số độc chất

Theo Rami và Khetarpaul (1998), probiotic có khả năng sản xuất các chất có tác

dụng trung hòa độc tố gây tiêu chảy của vi khuẩn E coli, có thể làm giảm hoạt tính

urease trong ruột non, ngăn chặn sự tổng hợp các amin độc, làm giảm nồng độ NH3trong phân gia súc, gia cầm [27] Một vài vi sinh vật có khả năng khử độc và phân hủy một số chất có độc tính, tạo thành những dẫn xuất không độc Nhiều nghiên cứu cho thấy tế bào nấm men có tính khử các chất độc được sinh ra trong quá trình tiêu hóa như: indol, skatol, phenol,… Tác dụng trung hòa và khử độc của probiotic không những giúp cho ống tiêu hóa hoạt động tốt hơn mà còn có ý nghĩa về mặt môi trường

2.3.2.4 Giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột

Động vật khỏe mạnh, có hệ tiêu hóa hoạt động tốt là cơ sở cho sự chuyển hóa tốt thức ăn phục vụ cho nhu cầu cơ thể Đặc tính quan trọng nhất của một đường tiêu hóa khỏe mạnh là sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột Việc bổ sung probiotic giúp duy trì hệ vi sinh vật đường ruột thông qua hoạt động cạnh tranh và đối kháng

Hoạt động cạnh tranh thể hiện ở các vị trí bám dính trên nhung mao ruột, các chất dinh dưỡng và khối lượng các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật Nhiều nghiên cứu

chứng minh probiotic ức chế sự bám dính của vi sinh vật gây bệnh như E coli,

Salmonella typhimurium [7, 19, 29] Việc ức chế khả năng bám dính của vi sinh vật gây

bệnh giúp ngăn ngừa sự phát triển và gây bệnh của chúng

Nhóm vi khuẩn lactic là những vi sinh vật tiêu biểu cho hoạt động đối kháng của của probiotic Chúng chống lại các vi sinh vật gây bệnh nhờ vào các sản phẩm do chúng tạo ra như: bacteriocin, acid hữu cơ, hydroperoxydase, lactocidin,… Lactocidin

có phổ kháng khuẩn rất rộng Các acid acetic và lactic làm giảm pH đường ruột khiến môi trường đường ruột trở nên bất lợi cho sự tồn tại của vi sinh vật gây bệnh Gr (-)

Một số bacteriocin thường gặp như: mycobacillin, subtilin (do Bacillus subtilis sinh ra), nizin (do Lactococcus lactis sinh ra), penicillin (do nấm penicillium sinh ra),…L

acidophillus tạo ra lactacin B có tác dụng ức chế các loài Lactobacillus khác và

acidocin ức chế vi sinh vật gây bệnh [6, 34]

2.3.2.5 Kích thích hệ thống miễn dịch

Yếu tố được xác định có vai trò kích thích hệ thống miễn dịch là thành phần của vách tế bào vi khuẩn: peptidoglycan Sự phân hủy peptidoglycan tạo thành chất muramyl peptid có tác dụng kích hoạt đại thực bào [32] Saarela và ctv (2000) cho rằng khả năng bám vào niêm mạc ruột của probiotic tạo sự tương tác giúp probiotic tiếp xúc với hệ thống lympho đường ruột và hệ thống miễn dịch, nhờ đó thúc đẩy hiệu quả miễn dịch và tạo nên sự ổn định hàng rào bảo vệ ruột [28]

2.3.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong chăn nuôi

2.3.3.1 Trong nước

Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, việc sản xuất các chế phẩm cung cấp vi sinh vật có lợi cho đường ruột ở nước ta không ngừng phát triển Kết quả của các nghiên cứu tìm hiểu ảnh hưởng của các chế phẩm này lên sức đề kháng, tỉ lệ tiêu tốn thức ăn, tỉ lệ chết, sức tăng trọng của gia súc, hiệu quả kinh tế… được ứng dụng trong chăn nuôi ngày càng rộng rãi Các công trình nghiên cứu của Viện Thú Y quốc gia:

Sữa chua và canh trùng B subtilis dùng trong phòng trị bệnh phân trắng của lợn con

(Đào Trọng Đạt và Vũ Đình Hưng, 1962)

Viên Subtilis để phòng trị các hội chứng nhiễm khuẩn đường ruột trên gia súc (Lê Thị Tài và ctv, 1968 – 1978) [3]

Chế phẩm chứa Saccharomyces boulardii cải thiện tình hình bệnh phân trắng ở lợn

con (Phan Thanh Phượng và ctv, 1979 – 1984)

Các chế phẩm trên đều khẳng định kết quả phòng trị bệnh đường ruột ở heo và tác dụng điều tiết kích thích sinh trưởng của chế phẩm

Năm 1982, Vũ Văn Ngữ và ctv đã sản xuất và thử nghiệm chế phẩm Subcolac

(Bacillus subtilis, Lactobacillus) làm giảm tỉ lệ tử vong , giảm tỉ lệ tái phát cho bệnh tiêu

chảy so với dùng kháng sinh và heo con tăng trọng tốt (cao hơn đối chứng 0,9 kg/con) Phòng vi sinh Khoa Chăn Nuôi Thú Y trường Đại Học Nông Lâm đã sản xuất thành công chế phẩm Biolactyl, qua sử dụng đã cho hiệu quả tốt trong việc phòng bệnh tiêu chảy cho heo con theo mẹ và hiện đang được sử dụng rộng rãi

Viện Pasteur Nha Trang cũng đã sản xuất chế phẩm Biosubtyl (Bacillus subtilis) đã

sử dụng có hiệu quả trong phòng và trị bệnh tiêu chảy trên người và gia súc

2.3.3.2 Thế giới

Trên thế giới, trong những thập niên gần đây, người ta hướng vào việc phân lập và chọn các chủng vi sinh vật có tính đối kháng cao đưa vào đường ruột, nâng cao sức chống đỡ đối với mầm bệnh, phòng trị bệnh đường ruột cho người, động vật nuôi, nhất

là trẻ sơ sinh, người già và thú non

Hiện nay ở Mỹ, Nhật, Anh và nhiều nước khác trên thế giới đã sản xuất những chế phẩm hỗn hợp nhiều loại enzyme, kết hợp nhiều loài vi sinh vật trong việc phòng trị bệnh, nâng cao khả năng tiêu hoá của người và vật nuôi như: Biozim, Rozim F - 3C, Lactopure, NatureFlora,…

2.4 Tổng quan về Lactobacillus sporogenes

2.4.1 Lịch sử phát hiện

L sporogenes lần đầu tiên được phân lập vào năm 1933 bởi L.M

Horowitz-Wlassowa và N.W Nowotelnow Vào thời gian đó, vi khuẩn được phân loại và mô tả như sau: tế bào hình que, Gram (+), tạo bào tử, sản xuất acid lactic, hiếu khí hay kị khí tùy ý, phản ứng catalase (+) (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 1974)

Vi khuẩn còn có tên là Bacillus coagulans [8]

Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây, đặc biệt là nghiên cứu dựa trên sự tương

đồng về DNA đã khẳng định L sporogenes gần gũi với Lactobacillus hơn Bacillus Năm 1967, L sporogenes được xếp lại vào giống Lactobacillus

2.4.2 Đặc điểm phân loại

Vi khuẩn L sporogenes có đặc điểm phân loại như sau:

2.4.3 Đặc điểm phân bố

Vi khuẩn L sporogenes có mặt trong các sản phẩm đồ hộp Chúng phân bố tương

đối rộng rãi trong tự nhiên

2.4.4 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

2.4.4.1 Tế bào sinh dưỡng

Hình thái

Vì có quan hệ với hai giống Bacillus và Lactobacillus nên hình thái của L

sporogenes có những nét tương đồng Lactobacillus và khác biệt với Bacillus (xem

Bảng 2.2 Những khác biệt về hình thái của L sporogenes so với Bacillus [35]

Hình dạng khuẩn lạc -Khuẩn lạc Bacillus có bề mặt nhăn

Hình dạng tế bào -Bacillus luôn có dạng hình que thẳng, trong khi

Lactobacillus còn có dạng hình que uốn cong

-Bào tử của Bacillus ở giữa thân còn bào tử của

L sporogenes có ở một đầu tế bào

Các đặc điểm sinh trưởng phát triển và sinh hóa

Tương tự như hình thái, những điểm tương đồng Lactobacillus và khác biệt

Bacillus về mặt sinh trưởng phát triển và sinh hóa của L sporogenes được trình bày ở

Bảng 2.3 và 2.4

Bảng 2.3 Những tương đồng về đặc điểm sinh trưởng và sinh hóa của L sporogenes và Lactobacillus [35]

Môi trường nuôi cấy -Khó nuôi cấy, cần những chất hữu cơ phức tạp để

phát triển như: carbonhydrate (để lên men), peptone, chiết thịt, chiết nấm men

-Môi trường nuôi cấy thích hợp: MRSA có bổ sung nước ép cà chua a

Nhiệt độ tối ưu 30 - 450C

Một số phản ứng sinh hóa -Không thủy phân tinh bột, casein

-Không hóa lỏng gelatine -Indole (-)

-Không sinh gas hay H2S -Không có menaquinones Khả năng lên men đường -Sản xuất acid khi lên men các loại đường: lactose,

arabinose, xylose, glucose, galactose, mannose, fructose, maltose, sucrose và trehalose

-Sản xuất acid lactic khi lên men: glucose, fructose, sucrose, trehalose và lactose

Một số đặc điểm khác -Gram (+)

-Hiếu khí hay kị khí tùy ý

Lưu ý:

(a) L sporogenes cũng phát triển tốt trong môi trường GYE (glucose yeast extract agar)

Bảng 2.4 Những khác biệt về đặc điểm sinh trưởng và sinh hóa của L sporogenes so với Bacillus [35]

Môi trường nuôi cấy Dễ nuôi cấy hơn Lactobacillus

Một số phản ứng sinh hóa Lactobacillus cho phản ứng oxidase (-) và nitrate (-)

trong khi Bacillus luôn cho hai phản ứng này (+)

Khả năng lên men đường Bacillus không lên men được lactose

2.4.4.2 Bào tử

Hình thái

Lớp vỏ bào tử có cấu tạo là một phức hệ peptidoglycan - acid dipicolinic - calcium Bào

tử hình ellip, nằm ở một đầu của tế bào sinh dưỡng, có kích thước 0,9 - 1,21,0 - 1,7 µm

Cấu tạo chi tiết của bào tử L sporogenes được mô tả theo Hình 2.1

Hình 2.1 Giản đồ cấu tạo bào tử Gồm: lớp ngoại bào tử (exosporium), màng

ngoài (outer coat), màng trong (inner coat), lớp vỏ dưới màng trong (cortex), màng vỏ của vách tế bào mầm (cortical membrane of the germ cell wall), tế bào chất sát nhập vào tế bào mẹ (incorporated mother cell cytoplasm), nguyên sinh chất (core/protoplast), vật chất nhân (nuclear material) [15, 39]

Khi gặp phải điều kiện bất lợi như nhiệt độ, pH, môi trường dinh dưỡng không phù

hợp,… L sporogenes từ dạng tế bào sinh dưỡng tạo thành bào tử

Đặc tính

o In vitro

Bào tử L sporogenes bền với nhiệt và những điều kiện môi trường khắc nghiệt

khác Chúng vẫn sống ngay cả sau khi đã xử lý ở 100oC trong 20 phút trong dung dịch đệm phosphate ở pH 7 Bào tử nảy chồi trong dịch canh chứa malt ngay cả khi có HCl pha loãng (pH 4,6 – 5,6), dịch NaOH (pH 7,6 – 9,6), dịch muối (nồng độ 5%, 10%, 20%), dịch acid boric 2,5% và nước cất Bào tử chịu được kháng sinh 2 – 8 lần so với tế bào dinh dưỡng [12]

o In vivo Khi qua đường miệng, bào tử được hoạt hóa và hồi sinh trong môi trường acid của

dạ dày - ruột với pH thấp nhờ hoạt động đánh khuấy hóa học của dạ dày và môi trường nước trong dạ dày Các lớp màng (coat) hút nước và trương phồng lên Sự gia tăng hàm lượng nước làm tăng tỉ lệ trao đổi chất của vi khuẩn trong bào tử, chồi hình thành và ló

ra ngoài lớp màng của bào tử Tại tá tràng, bào tử không còn nữa, các tế bào nảy chồi chuyển thành tế bào sinh dưỡng Chúng nhân lên rất nhanh trong ruột non Thông thường, sự nảy chồi diễn ra khoảng 4 giờ sau khi bào tử đi vào qua đường miệng Tế bào sinh dưỡng nhân đôi sau mỗi 30 phút Các tế bào này cố định trên bộ máy tiêu hóa

và tiếp tục hoạt động trao đổi chất, sản xuất acid lactic và bacteriocin Điều này tạo một môi trường bất lợi cho vi khuẩn có hại trong đường ruột [13]

2.4.5 Những đặc điểm, chức năng sinh học tương đồng giữa L sporogenes và các vi khuẩn Lactobacillus khác

Vi khuẩn L sporogenes là một loài thuộc giống Lactobacillus nên mang nhiều đặc tính và chức năng sinh học của Lactobacillus Những đặc tính và chức năng này đều có

ý nghĩa trong ứng dụng sản xuất probiotic

2.4.5.1 Những đặc điểm trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất của Lactobacillus có vai trò rất quan trọng trong khả năng chữa bệnh của vi khuẩn Các nghiên cứu nuôi cấy Lactobacillus trong môi trường sữa

đã thể hiện rõ ràng những hoạt tính đáng chú ý sau:

Phân giải protein

Lactobacillus sản sinh enzyme proteinase phân giải protein thành các polypeptide

mạch ngắn

Hoạt tính này của vi khuẩn giúp cho protein được cơ thể vật chủ tiêu hóa dễ dàng

Vì vậy, các chế phẩm từ hoạt động lên men của Lactobacillus được đánh giá là nguồn

dinh dưỡng có giá trị cao cho các đối tượng: trẻ sơ sinh, người đang dưỡng bệnh, người già hay gia súc non

Phân giải lipid

Nhờ có enzyme lipase, Lactobacillus có khả năng phân cắt chất béo ở dạng

triglyceride thành các acid béo và glycerol Điều này cũng có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng đối với người và vật nuôi

Có những nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng (preclinical) cho rằng Lactobacillus

phân giải được cholesterol trong lipid huyết thanh (serum lipids) [25, 26] và muối mật [14] Cả hai khả năng này đều có ý nghĩa về mặt lâm sàng

Phân giải đường lactose

Lactobacillus mang enzyme beta - galactosidase, glycolase và lactic dehydrogenase

(LDH) có tác dụng chuyển hoá đường lactose thành acid lactic Đây là một acid hữu cơ

có những đặc tính sinh học đặc biệt

o Vai trò của acid lactic [5]

Về mặt sinh lý học, acid lactic có những ưu điểm sau:

 Tăng cường khả năng tiêu hóa protein sữa thông qua sự đông vón

 Tăng cường hoạt tính Ca, P, Fe

 Kích thích sự tiết dịch vị

 Tăng nhanh cử động đẩy nhanh thức ăn đi xuống dạ dày

 Là nguồn năng lượng cho quá trình hô hấp

Chính những ưu điểm trên đã phần nào chứng minh hiệu quả của việc ứng dụng

Lactobacillus làm probiotic Tùy thuộc vào loài và điều kiện nuôi cấy, Lactobacillus

sản xuất hai loại đồng phân quang học: D (-) và L (+) acid lactic (xem Hình 2.3) Ở người, cả hai loại đồng phân này đều được hấp thu trong đường ruột

D(-) acid lactic L(+) acid lactic Hình 2.2 Hai loại đồng phân acid lactic

L (+) acid lactic: được chuyển hóa hoàn toàn và nhanh chóng trong quá trình tổng hợp glycogen

D (-) acid lactic: được chuyển hóa ít hơn và phần không chuyển hóa sẽ được bài tiết dưới dạng urine Sự hiện diện của acid không được chuyển hóa trong ống tiêu hóa sẽ gây tình trạng nhiễm acid trong trao đổi chất (metabolic acidosis) ở trẻ sơ sinh Một số

loài Lactobacillus, tiêu biểu là L acidophilus có sản xuất D (-) acid lactic nên lợi ích về

mặt lâm sàng là không chắc chắn mặc dù đã sớm được sử dụng trong nhiều liệu pháp

Vì vậy, xu hướng mới trong sản xuất probiotic là tìm những nguồn vi sinh vật có khả năng tạo ra L (+) acid lactic sẽ an toàn hơn cho sức khỏe Đại diện tiêu biểu thỏa mãn

yêu cầu này là Lactobacillus sporogenes

Ngoài ra, acid lactic còn làm hạ pH đường ruột còn 4 – 5 Do đó, sự phát triển của

vi sinh vật gây thối và E coli (thích nghi ở pH 6 – 7) bị ức chế

Sản xuất bacteriocin và các cơ chất kháng khuẩn

Bacteriocin là protein hay hợp chất protein do vi khuẩn sản xuất có hoạt tính diệt

khuẩn trực tiếp [23, 31] Cơ chất này giúp vi khuẩn Lactobacillus thể hiện hoạt tính ức

chế đối với các vi sinh vật gây thối trong hệ tiêu hóa

Bảng 2.5 Một vài loại bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus

Tên bacteriocin Loài sản xuất

Acidophilin L acidophilus

Lactacin B L acidophilus

Vi khuẩn Lactobacillus còn có thể ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây thối

nhờ vào những sản phẩm trao đổi chất khác nhƣ: H2O2, CO2 và diacetyl

Bảng 2.6 Tác dụng của một vài sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus [33]

1.Carbon dioxide Ức chế sự khử nhóm carboxyl?

Làm giảm tính thấm của màng tế bào?

arginine

3 Hydrogen peroxide /

Lactoperoxidase

Oxi hóa những protein cơ bản

2.4.5.2 Lợi ích trong dinh dƣỡng và trị liệu

Các sản phẩm lên men từ sữa đã đƣợc dùng để chữa bệnh trong nhiều nền y học thời

xa xƣa ở Trung Cận Đông Tuy nhiên giá trị về mặt dinh dƣỡng và trị liệu của các vi khuẩn lactic vẫn còn đang đƣợc tranh cãi Mặc dù vậy, một số nghiên cứu lâm sàng và

tiền lâm sàng đã cho thấy ích lợi của Lactobacillus (xem Sơ đồ 2.1)

Các lợi ích về mặt dinh dưỡng

Nghiên cứu trên chuột cho thấy tốc độ phát triển và lượng ăn vào tăng lên khi cho

ăn sữa chua chứa Lactobacillus [10] Vài loài Lactobacillus có khả năng tự tổng hợp

vitamin B Hàm lượng các loại vitamin nhóm B và K trong sữa chua thường cao hơn trong sữa tươi Ngoài ra, tính chất sinh học tự nhiên của Cu, Fe, Ca, Zn, Mg và P cũng tăng lên khi dùng sữa chua làm thức ăn cho chuột [16]

Các lợi ích về mặt trị liệu

Các chế phẩm chứa Lactobacillus đều cho thấy hiệu quả trong chữa trị vô số những

rối loạn và viêm nhiễm bao gồm: viêm ruột kết, táo bón, tiêu chảy, đầy hơi, bệnh hepatic encephalopathy, ung bướu, lượng cholesterol trong máu cao, đau đầu và viêm

Tăng cường miễn dịch

Loại bỏ carcinogen trong sản phẩm cuối

Ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh trong thực phẩm

Sản xuất vitamin nhóm

B, K

Tăng cường khả năng tiêu hóa các chất trong thực phẩm và tăng cường những hoạt tính sinh học tự nhiên của chất dinh dưỡng

Sơ đồ 2.1 Ích lợi của Lactobacillus về mặt dinh dưỡng và trị liệu [35]

âm đạo không điển hình, cải thiện tình trạng không sử dụng được lactose (lactose intolerance)

Khẩu phần chứa Lactobacillus có tác dụng làm hạ cholesterol trong máu Cơ chế tác động của Lactobacillus lên quá trình hình thành cholesterol có thể được biểu diễn như

Hình 2.5

Hình 2.3 Cơ chế ngăn chặn sự hình thành và hấp thụ cholesterol [35]

Ngoài ra, có nghiên cứu còn cho rằng Lactobacillus làm giảm lượng cholesterol gắn

cholesterol vào khoang ruột [17]

Lactobacillus tạo ra enzyme beta – galactosidase (lactase), có tác dụng thủy phân

lactose thành acid lactic [21] Vì vậy, Lactobacillus giúp cải thiện tình trạng không sử

dụng được lactose ở những người thiếu enzyme lactase

Vi khuẩn Lactobacillus sản xuất acid lactic và các cơ chất khác tạo một môi trường

bất lợi cho sinh vật gây thối phát triển trong đường tiêu hóa Do đó, lượng urase trong ruột giảm và kéo theo lượng NH3 trong máu Hơn nữa, pH thấp do acid lactic tạo ra gây trở ngại cho NH3 hấp thu từ ruột vào mô và thúc đẩy việc bài tiết NH3 từ máu vào ruột [24]

Những vi khuẩn gây thối rữa ở ruột kết tạo các enzyme beta-glucuronidase, azoreductase và nitroreductase chuyển hóa procarcinogen thành carcinogen, chất có vai trò trong việc hình thành và phát triển khối u Bằng cách ức chế cạnh tranh và tạo môi

Chất béo trong khẩu phần

trường acid không thuận lợi, Lactobacillus đã kìm hãm sự trao đổi chất của vi khuẩn

trong ruột kết Có lẽ điều này làm giảm sự hình thành carcinogen ở ruột già [18]

Nhờ vào khả năng sản xuất acid lactic và bacteriocin trong đường ruột,

Lactobacillus cải thiện tình trạng tiêu chảy Acid lactic cũng giúp tăng cường nhu động

ruột nên chữa được chứng táo bón

Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy các loài Lactobacillus có thể thúc đẩy khả

năng sản xuất anfa-interferon, tính tự vệ của tế bào và hoạt tính của enzyme 2 – 5 A - synthase Viện Pasteur ở Tokyo đã ghi nhận được lượng interferon tăng 65% ở những

người tham gia thí nghiệm sau 2 tuần tiêu thụ chế phẩm chứa Lactobacillus [22]

Lactobacillus duy trì pH âm đạo ở khoảng 4 – 4,5 nhờ vào hoạt động lên men

glycogen thành acid lactic Đây là môi trường không thích hợp cho mầm bệnh phát

triển như Trichomonas vaginalis (protozoa kí sinh) và Candida albicans (nấm men),…

Lactobacillus có hiệu quả trong phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột và

giúp hình thành hệ vi sinh vật dạ cỏ Nhờ vào sự giảm nồng độ NH3 và hạn chế vi sinh

vật gây thối nhiễm vào đường ruột, Lactobacillus có hiệu quả kích thích tăng trưởng ở

thú nuôi [11]

2.4.6 Các đặc tính giúp L sporogenes vượt trội hơn các vi khuẩn Lactobacillus

khác trong ứng dụng làm probiotic

Ngoài những chức năng sinh học kể trên, L sporogenes còn vượt trội hơn các vi khuẩn

khác làm probiotic nhờ đáp ứng những yêu cầu của một loại probiotic lý tưởng như:

Có nguồn gốc tự nhiên và thích hợp với cơ thể người và vật nuôi

Không mang độc tính hay bất kỳ một tác dụng phụ nào cho người và vật nuôi

Có khả năng gắn vào tế bào biểu mô ruột và cố định trên trên đường tiêu hóa để ngăn ngừa và chống mầm bệnh xâm nhập

Kháng được acid và mật, vẫn sống sau khi di chuyển từ dạ dày xuống ruột non Lên men và tạo ra L (+) acid lactic, được chuyển hóa hoàn toàn trong quá trình trao đổi chất nên không gây tình trạng nhiễm acid như D (-) acid lactic

Tỉ lệ sống cao sau khi trải qua quy trình sản xuất (thu hoạch, sấy khô,…)

Tính ổn định cao ở nhiệt độ phòng khi trộn hay không trộn với những thành phần khác

Có tác dụng cải thiện sức khỏe vật chủ

Ngoài ra, L sporogenes còn là loài Bacillus duy nhất dùng làm probiotic mang

chứng nhận an toàn cho sức khỏe GRAS (Generally Recognise As Safe) do FDA (Food

& Drug Administration) cấp Vì những lý do kể trên giúp L sporogenes ngày càng được ưa chuộng hơn Lactobacillus quen thuộc khác Điển hình nhất trong số này là L

acidophillus Đây là loài vi khuẩn rất thông dụng và phổ biến có mặt trong sữa chua,

các loại thực phẩm lên men khác và thuốc trị rối loạn tiêu hóa,… và được con người tin dùng từ rất lâu

Những đặc điểm vượt trội của L sporogenes so với L acidophilus được thể hiện qua Bảng 2.7

Bảng 2.7 Bảng liệt kê những ưu điểm của L sporogenes so với L acidophillus

Bào tử vẫn sống sau khi đã xử lý

100oC/20 phút trong môi trường đệm

Tất cả tế bào sinh dưỡng đều bị tiêu diệt sau khi thanh trùng Pasteur

Khi gặp điều kiện bất lợi, tế bào sinh

dưỡng tạo thành bào tử chống chịu tốt

với những điều kiện bất lợi: nhiệt độ,

pH thấp trong đường tiêu hóa, dịch

mật, sấy khô, đông lạnh, bức xạ, hóa

chất diệt khuẩn và kháng sinh

Vi khuẩn không tạo bào tử

Tế bào sinh dưỡng rất nhạy cảm với nhiệt độ

Lên men đồng hình tạo ra L (+) acid

lactic dễ dàng chuyển hóa trong cơ thể

[13]

Sản xuất D (-) acid lactic có thể gây chứng nhiễm acid vào quá trình trao đổi chất (tài liệu 159, International Dairy Federeration, 1983)

Khả năng tái sinh tốt và tính ổn định

của bào tử nên vẫn đạt được hiệu quả

Tuy nhiên, L sporogenes có một khuyết điểm duy nhất đó là thời gian tồn tại trong

ống tiêu hóa chỉ trong 6 – 7 ngày Cuối cùng, bào tử theo phân thải ra ngoài Hiện nay,

cơ chế và nguyên nhân của vấn đề này còn đang được nghiên cứu

2.4.7 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng L sporogenes

Từ khi được phân lập lần đầu tiên vào năm 1933 đến nay, L sporogenes đã trải qua

nhiều nghiên cứu Những khảo sát về độc tính, khả năng làm giảm cholesterol, trị viêm

âm đạo không điển hình, trị rối loạn tiêu hóa,… đã chứng minh dần những đặc tính có

lợi và vượt trội của vi khuẩn này Các sản phẩm probiotic chứa L sporogenes được sản

xuất ngày một nhiều hơn như: Lactospore®, Sporlac®, SANVITA,…của Sabinsa Corporation, Lactopure của Pharmed Medicare, NaturaFlora® & NaturaFlora Kids Formula-Chewable® của Natura Health,… [35, 36, 37, 38]

Một nghiên cứu của Tae-Han Kim và ctv (đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã thành công khi dùng N – methyl – N’ – nitro – N – nitrosoguanidine (NTG) gây đột

biến kháng rifampicin cho L sporogenes [20] Điều mở ra hướng kết hợp L

sporogenes với loại kháng sinh này dùng làm thuốc mà không gây bất hoạt sự phát triển

của L sporogenes