Luận văn : NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes part 4 doc

sporogenes, ngoài hình thái khuẩn lạc và tế bào, còn cần đến những phản ứng sinh hóa đặc trưng xem phụ lục 6.1 – 6.3.. 3.4.4 Khảo sát khả năng hình thành bào tử  Nguyên tắc Sự hình th

3.4.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào [9, 40]

 Hình thái khuẩn lạc

Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa [9, 40]

Hình dáng khuẩn lạc: lồi, trơn, màu vàng trùng với màu môi trường xung quanh Đường kính khuẩn lạc: 2,5 mm

 Hình thái tế bào

Tế bào được quan sát ở vật kính 100X sau khi đã tiến hành nhuộm Gram (xem phụ

lục 5.1) Vi khuẩn L sporogenes có hình que, bắt màu Gram (+), không tạo chuỗi Bào tử

nằm ở một đầu tế bào Kích thước tế bào: 0,4 – 0,8 µm  2,5 – 4,5 µm

 Hình thái bào tử

Bào tử được quan sát ở vật kính 100X sau khi đã tiến hành nhuộm Gram (xem phụ

lục 5.2) Bào tử L sporogenes có hình bầu dục, bắt màu hồng, nằm ở một đầu tế bào

Kích thước bào tử: 0,9 – 1,2 µm  1 – 1,7 µm

Mẫu chế phẩm Pha loãng trong 9 ml NaCl 9%0 đến nồng độ 10-8

Giữ 3 ống nồng độ pha loãng 10-6,

10-7, 10-8 ở 1000C/10 phút

Cấy trang trên đĩa GYE

Quan sát khuẩn lạc đặc trưng Giữ giống trên GYE thạch nghiêng

Ủ 370C/48 giờ

3.4.2.2 Khảo sát các phản ứng sinh hóa [35]

Để định danh L sporogenes, ngoài hình thái khuẩn lạc và tế bào, còn cần đến những

phản ứng sinh hóa đặc trưng (xem phụ lục 6.1 – 6.3)

Sơ đồ 3.4: Quy trình tiến hành thủ nghiệm sinh hóa [35]

3.4.3 Khả năng sinh acid lactic

3.4.3.1 Định tính

 Nguyên tắc

Chúng tôi sử dụng phương pháp phát hiện khả năng sinh acid lactic của vi khuẩn L

sporogenes bằng phản ứng với thuốc thử Uffelman

 Tiến hành

Cấy vi khuẩn từ môi trường tăng sinh vào 10 ml canh GYE Ủ 370C/48 giờ Ly tâm ống canh khuẩn ở tốc độ 3000 vòng/10 phút Thu dịch nổi vào bình chiết, thêm 2,5 ml

H2SO4 10%, 25 ml diethyl ether và lắc đều Thu lấy tầng ether và cho bốc hơi thật kỹ trong bồn nước nóng (trong khoảng 60 - 1000C)cho đến khi còn lại một thể tích dung dịch

ổn định Hòa tan phần còn lại này trong 2,5 ml nước cất Thêm vào 2,5 ml thuốc thử Uffelman màu tím xanh Đọc kết quả

Kết quả

Phản ứng (-): dung dịch không chuyển thành màu vàng

Phản ứng (+): dung dịch chuyển thành màu vàng

Giống

Cấy tăng sinh trong GYE lỏng

Ủ 370C/24 giờ

Cấy sang các môi trường thử

sinh hóa

3.4.3.2 Định lượng

 Nguyên tắc

L sporogenes lên men đường tạo ra acid nên có cũng có khả năng làm đông vón sữa

Dựa vào đặc điểm này, chúng tôi xác định và đánh giá lượng acid lactic (chiếm hơn 85%

tổng lượng acid được tạo ra) do các chủng L sporogenes trong chế phẩm Lactospore®

sản xuất thông qua giá trị độ chua Therner.

 Tiến hành

o Xác định độ chua

Sơ đồ 3.5: Quy trình xác định độ chua Therner

Công thức tính độ chua (T) trong 100 ml dịch sữa lên men

o Tính lượng acid lactic

Công thức tính lượng acid lactic trong 100 ml dịch lên men dựa vào giá trị độ chua

T = n.100/V T: độ chua

n: VNaOH 0,1N sử dụng (ml) V: thể tích dịch sữa lên men chưa pha loãng (ml)

4 ml GYE lỏng

Hấp vô trùng Cấy vi khuẩn

Ủ 370C/24 giờ

Sữa đặc có đường

Pha loãng bằng nước cất với tỉ lệ 1:10

Chiết 40 ml vào bình tam giác

Ủ 370C/24 giờ Hút 10 ml dịch lên men +

90 ml nước cất + 2-3 giọt phenolphtalein

Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi dịch lên men chuyển sang màu hồng nhạt bền trong 5 phút Ghi nhận VNaOH 0,1N

Tính giá trị độ chua (T) theo công thức

3.4.4 Khảo sát khả năng hình thành bào tử

 Nguyên tắc

Sự hình thành và hồi sinh của bào tử L sporogenes chịu ảnh hưởng lớn bởi những điều

kiện môi trường Thí nghiệm sau đây được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và môi trường nuôi cấy lên khả năng tạo bào tử Đối tượng được lựa chọn để thực hiện thí nghiệm

là 3 trong số các chủng giữ giống

 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu 3 yếu tố

Yếu tố 1: nhiệt độ nuôi cấy

Yếu tố 2: môi trường nuôi cấy

Yếu tố 3: 3 chủng vi khuẩn L sporogenes

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng hình thành bào tử L sporogenes

Yếu tố 3

Yếu tố 1 Yếu tố 2

370C/6 ngày [9] 37

0 C/2 ngày  50 0 C/2 giờ

 70 0 C/2 giờ

Chủng

1 Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4

2 Nghiệm thức 5 Nghiệm thức 6 Nghiệm thức 7 Nghiệm thức 8

3 Nghiệm thức 9 Nghiệm thức 10 Nghiệm thức 11 Nghiệm thức 12

Chú ý: mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần

A = 0,009.n.100/V = 0,009.T A: khối lượng acid lactic (g)

n : VNaOH 0,1N chuẩn độ (ml) 0,009 : hệ số chuyển 1 ml NaOH 0,1N sang số gam acid lactic

V : thể tích dịch sữa lên men chưa lên men (ml)

 Quy trình khảo sát

Sơ đồ 3.6: Quy trình khảo sát sự hình thành vào nảy chồi của bào tử

L sporogenes [9, 40]

Chọn 3 chủng Cấy tăng sinh trên GYE lỏng

Ủ 370C/24 giờ

Hút 1ml sinh khối và cấy lên 2 môi

trường thạch đĩa

Ủ 370C/6 ngày Ủ 370C/2 ngày, Ủ 370C/6 ngày

tiếp tục ủ ở

500C/2 giờ và

700C/2 giờ

Ủ 370C/2 ngày, tiếp tục ủ ở

500C/2 giờ và

700C/2 giờ

Thu sinh khối (a) Thu sinh khối (a) Thu sinh khối (a)

Kiểm tra số lượng bào tử trong sinh khối (b)

So sánh số lượng bào tử và đánh giá khả năng hình thành bào tử trong mỗi thí nghiệm bố trí

Kiểm tra số

lượng bào tử

trong sinh

khối (b)

Kiểm tra số lượng bào tử trong sinh khối (b)

Kiểm tra số lượng bào tử trong sinh khối (b)

Thu sinh khối (a)

Ghi chú:

(a) xem phương pháp thu sinh khối

(b) xem phương pháp kiểm tra số lượng bào tử trong sinh khối

o Phương pháp thu sinh khối

 Nguyên tắc

Nhằm đảm bảo thu một lượng sinh khối đồng đều giữa các đĩa, chúng tôi dùng cùng một lượng thể tích dung dịch để đồng nhất sinh khối và thu nhận một thể tích dịch sinh khối nhất định

 Tiến hành

Hút 6 ml NaCl 9%0 vào mỗi đĩa Dùng que cấy trang trộn đều sinh khối trên mặt thạch NaCl 9%0 Chuyển 4 ml dịch sinh khối vào ống nghiệm

o Phương pháp kiểm tra số lượng bào tử trong sinh khối [9,40]

 Nguyên tắc

Số lượng bào tử L sporogenes trong sinh khối chỉ có thể đếm được sau khi đã

pha loãng nhiều lần và cấy trang trên đĩa Ngoài ra, để đánh giá chính xác số lượng bào tử trước khi cấy trang, chúng tôi gia nhiệt những ống pha loãng ở nhiệt độ và thời gian thích hợp để tiêu diệt toàn bộ tế bào sinh dưỡng Những bào tử còn sống sau quá trình gia nhiệt sẽ hồi sinh trở lại khi cấy trang Vì vậy, số khuẩn lạc đặc trưng thu nhận được cũng tương ứng với số bào tử trong dịch pha loãng

 Tiến hành

Từ sinh khối thu được, hút 1ml và đồng nhất trong 9 ml NaCl 9%0 để có nồng

độ pha loãng 10-1 Hút tiếp 1 ml và đồng nhất trong 9 ml NaCl 9%0 để có nồng độ pha loãng 10-2 Tiếp tục như thế cho đến nồng độ pha loãng 10-9 Giữ 3 ống 10-7 ,10-8 , 10-9 bồn nước 1000C/10 phút Hút 0,1 ml dịch khuẩn ở 3 nồng độ trên và trang trên 2 loại môi trường thạch đĩa GYE và MRSA, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ

370C/48 giờ Đếm số lượng khuẩn lạc trong mỗi đĩa và tính số bào tử có trong sinh khối ban đầu

 Tính kết quả

Số khuẩn lạc trong 1 g hay 1 ml dịch mẫu ở mỗi độ pha loãng

Công thức

Số khuẩn lạc trung bình trong 1 g hay 1 ml mẫu ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp khác nhau

3.4.5 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics 7.0 để so sánh số lượng bào tử khác nhau ở các điều kiện khảo sát

V

1 h

1 x

N

dịch mẫu N: tổng số khuẩn lạc trong các đĩa cùng nồng

độ pha loãng x: số đĩa cùng nồng độ pha loãng h: nồng độ pha loãng (10-7, 10-8, 10-9) V: thể tích dịch mẫu cấy trên 1 đĩa (ml)

3

X X X

loãng

X1, X2, X3: số lượng khuẩn lạc trung bình có trong 1 g hay 1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.4 Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes

4.4.1 Kết quả phân lập

Từ chế phẩm, chúng tôi phân lập được 20 chủng L sporogenes (xem Bảng 4.1)

Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn L sporogenes

Số khuẩn lạc nghi

ngờ được chọn

Khuẩn lạc có hình thái vi/đại

thể phù hợp với L sporogenes

Khuẩn lạc có sinh hóa phù

hợp với L sporogenes

Vì 100% khuẩn lạc nghi ngờ được chọn đều có hình thái vi thể và đặc điểm sinh hóa

phù hợp với L sporogenes nên chúng tôi kết luận trong chế phẩm của Thorne Research

(USA) chỉ thuần một loại vi khuẩn L sporogenes

4.4.2 Đặc điểm hình thái của L sporogenes

4.4.2.1 Quan sát khuẩn lạc

Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường GYE ở 370C/48 giờ Chúng tôi quan sát được hình dạng khuẩn lạc như sau: tròn, lồi, đều, màu vàng, bề mặt mịn; đường kính khuẩn lạc trung bình 2 – 3 mm; vùng môi trường xung quanh khuẩn lạc chuyển từ màu tím sang màu vàng

4.4.2.2 Quan sát hình thái tế bào

Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn L sporogenes trên môi trường GYE

Chúng tôi tiến hành nhuộm Gram khuẩn lạc điển hình phân lập được trên môi trường thạch GYE sau 48 giờ ủ ở 370C Vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần (100X) Hình thái của tế bào vi khuẩn được chúng tôi ghi nhận như sau: hình que, bắt màu Gram (+), 2 đầu hơi tròn, không tạo chuỗi; kích thước tế bào 0,4 – 0,8 µm  2,1 – 4,5 µm; bào tử nằm về một đầu tế bào (xem Hình 4.2)

4.4.2.3 Quan sát hình thái bào tử

Chúng tôi tiến hành nhuộm bào tử từ mẫu khuẩn lạc điển hình trên môi trường GYE sau 72 giờ ủ ở 370C Bào tử quan sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần có những đặc điểm sau: hình bầu dục; phình to ở một đầu tế bào; bắt màu hồng; kích thước 1 – 1,2

µm  1,2 – 1,8 µm

4.4.3 Đặc điểm sinh hóa của L sporogenes

Từ 20 chủng L sporogenes phân lập được, chúng tôi tiến hành thử phản ứng sinh

hóa Kết quả ghi nhận được trình bày qua bảng 4.2

Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn L sporogenes được phóng đại 1000 lần

dưới kính hiển vi