Thuốc nhuộm được bảo quản trong chai màu tối.. Thuốc nhuộm phải được bảo quản trong chai màu tối.. Phương pháp nhuộm Gram Cố định tiêu bản Đặt giấy lọc lên vết bôi Nhuộm crystal violet
Trang 1PHỤ LỤC
1 Thành phần môi trường
1.1 Môi trường GYE agar (Glucose Yeast Extract)
pH 6.3 0,2
Thành phần khoáng vi lượng
Đun sôi môi trường cho hòa tan
Hấp khử trùng ở 1150C/30 phút
1.2 Môi trường MRSA
Trang 2K2HPO4 2g
Đun sôi môi trường cho hòa tan
Hấp khử trùng ở 1150C/30 phút
1.3 Môi trường Nutrient broth (NB)
pH 7,0 0,2
Hấp khử trùng ở 1210C/20 phút
1.4 Môi trường lên men đường
1.5 Môi trường thạch bán lỏng
pH 7,2 0,2
Trang 3Đun sôi môi trường cho hòa tan
Hấp khử trùng ở 1210C/20 phút
2 Hóa chất
2.1 Nước muối sinh lý NaCl 9% 0
2.2 NaOH 0,1N
Cân 40g NaOH tinh thể hòa vào 50ml nước cất lắc đều, để yên 24h, gạn lấy nước trong ở trên rồi bổ sung thêm nước cất cho đủ 1000ml
3 Thuốc nhuộm
3.1 Crystal violet
Trộn 2 dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đều rồi đem lọc Thuốc nhuộm được bảo quản trong chai màu tối
3.2 Fuchsine kiềm
Trộn 2 dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đều rồi đem lọc Thuốc nhuộm phải được bảo quản trong chai màu tối
Trước khi dùng, pha loãng 5 lần (dịch pha loãng không giữ được lâu còn dịch đậm đặc có thể giữ trong nhiều tháng)
3.3 Lugol
Trang 4Iod tinh thể 1g
Hòa tan 2g KI vào 5ml nước cất Sau đó thêm 1g iod và chờ cho iod tan hết mới thêm nước cho đủ 300ml
3.4 Methylene blue
Trộn 2 dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan Bảo quản trong chai màu tối
4 Thuốc thử và chỉ thị màu
4.1 Thuốc thử Ufellman
4.2 Thuốc chỉ thị Bromocresol purple (BCP)
Pha dung dịch a trước, sau đó trộn với b Giữ hỗn hợp trong chai màu tối
5 Phương pháp nhuộm
5.1 Phương pháp nhuộm Gram
Cố định tiêu bản
Đặt giấy lọc lên vết bôi
Nhuộm crystal violet 1-2 phút
Rửa nước
Cố định lugol 1 phút
Rửa nước
Tẩy ethanol 900 15 giây
Rửa nước
Trang 5Nhuộm fuchsine kiềm loãng 1phút
rửa nước
Để khô
Xem kính hiển vi ở vật kính 100X
5.2 Phương pháp nhuộm bào tử
Cố định tiêu bản
Nhuộm HCl 1%
Rửa nước
Đặt giấy lọc lên vết bôi
Nhuộm fuchsine đậm đặc, hơ nhẹ trên đèn cồn trong 2-4 phút
Rửa nước
Rửa cồn 900 15 giây
Rửa nước
Nhuộm Methylene blue 1 phút
Rửa nước
Để khô
Xem kính hiển vi ở vật kính 100X
6 Phương pháp thực hiện các phản ứng sinh hóa
6.1 Khả năng lên men đường
Nguyên tắc
Một số vi sinh vật sử dụng và lên men một số lọai đường làm pH môi trường giảm Khi đó, chỉ thị màu phenol red từ màu đỏ chuyển sang màu vàng, có sinh hơi hay không sinh hơi tùy vào từng lọai vi khuẩn
Chuẩn bị
Môi trường đường: glucose, sucrose, fructose, maltose, mannitol, lactose,
sorbitol, dextrin
Giống vi khuẩn: L sporogenes
Ống nghiệm, ống durham
Tiến hành
Trang 6Phân môi trường vào các ống nghiệm có ống durham, đem hấp vô trùng
1150C/20 phút để nguội, cấy vi khuẩn từ môi trường tăng sinh vào, ủ ở 370C/24h, đọc kết quả
Kết quả
Phản ứng (-): môi trường đục và có màu đỏ cam
Phản ứng (+): môi trường đục và có màu vàng
6.2 Khả năng di động
Nguyên tắc
Một số vi khuẩn có tiêm mao nên có khả năng di động trong môi trường bán lỏng
Chuẩn bị
Môi trường bán lỏng
Que cấy thẳng
Giống vi khuẩn L sporogenes
Tiến hành
Cấy vi khuẩn từ môi trường tăng sinh sang môi trường bán lỏng (cấy chích thẳng từ trên xuống dưới), ủ 370C/24h Đọc kết quả
Kết quả
Phản ứng (-): vi khuẩn mọc theo đường cấy
Phản ứng (+): vi khuẩn mọc lan ra xung quanh
6.3 Phản ứng catalase
Nguyên tắc
Một số vi khuẩn có khả năng sản xuất enzyme catalase phân giải H2O2 thành
H2O2 và O2
Chuẩn bị
Môi trường GYE thạch nghiêng
Giống vi khuẩn L sporogenes
Tiến hành
Cấy ria vi khuẩn từ môi trường tăng sinh lên môi trường GYE thạch nghiêng, ủ
370C/24h, nhỏ H2O2 lên sinh khối
Trang 7 Kết quả
Phản ứng (-): không có hiện tƣợng nào xảy ra
Phản ứng (+): có hiện tƣợng sủi bọt khi H2O2 tiếp xúc sinh khối