Nghiên cứu ảnh hưởng của axit phytic đang được đánh giá toàn diện, nhằm giải quyết các vấn đề liên quan đến sức khỏe con người, dinh dưỡng động vật, quản lý dinh dưỡn sản phẩm nông nghiệp.
LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: • Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. • Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học. • Các Thầy cô trong và ngoài Trường Đại Học Nông Lâm. • Các anh chị trong bộ môn Di Truyền và Chọn Giống Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. Đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong thời gian em học tập tại trường. Đặc biệt xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến: • TS. Nguyễn Thị Lang- Trưởng bộ môn Di Truyền và Chọn giống- Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ em trong nghiên cứu và thực hiện khóa luận. • TS. Trần Thị Dung- Trưởng bộ môn Công Nghệ sinh Học trường Đại Học Nông Lâm đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này. • Thạc sĩ Nguyễn Thanh Xà, Cử Nhân Đỗ Đức Tuyến , kỹ sư Trịnh Hoàng Khải đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian em thực hiện khóa luận. Xin cảm ơn các bạn trong và ngoài lớp đã động viên giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp. Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những người đã sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ con và luôn bên con trong mọi thời điểm. Thủ Đức, ngày 15 tháng 08 năm 2005 iii TÓM TẮT LÊ CÔNG THIỆN, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG AXIT PHYTIC Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỊA PHƯƠNG VÀ MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỘT BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA VÀ MICROSATELLITE”. Hội đồng hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ LANG TS. TRẦN THỊ DUNG Axit phytic còn được gọi là myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphotphate và là hợp chất dự trữ photpho chính của thực vật. Axit phytic được xem là nhân tố đối kháng dinh dưỡng bởi vì nó có thể liên kết với nhiều ion kim loại như Zn, Fe, Ca, Mg .và gây ra sự thiếu khoáng ở người và gia súc. Năm trăm dòng lúa đột biến OM1490, OMCS2000 thế hệ M 3 , lúa mùa và lúa cao sản được phân tích để xác định những dòng lúa có hàm lượng axit phytic thấp bởi phương pháp sinh hóa. Bốn mươi dòng đột biến OM1490 thế hệ M 4 cũng được phân tích sinh hóa để xác định tính trạng axit phytic theo phương pháp sinh hóa. Phân tích bằng marker SSR qua phản ứng PCR với marker RM 207 đối với các dòng axit phytic thấp thuộc quần thể lúa mùa và lúa cao sản. Phân tích bằng marker SSR qua phản ứng PCR với marker RM 207 đối với 40 dòng đột biến OM1490 thế hệ M 4 . Kết quả phân tích sinh hóa cho thấy: Tìm được 19 dòng lúa axit phytic thấp thuộc quần thể đột biến OM1490 thế hệ M 3 và 5 dòng lúa axit phytic thấp thuộc quần thể OMCS2000 thế hệ M 3 . Tìm được 2 giống lúa là nếp Trung Quốc và Tám Xoan biểu hiện tính axit phytic thấp trong 20 cá thể phân tích. iv Tìm được 6 giống biểu hiện tính axit phytic như: OM 2490, OM 4498 , OM 2718 và OM 5731-5 , OM 5731-7, DS 2002 trong 130 giống lúa cao sản. Tìm được 9 cá thể trong 40 dòng đột biến OM1490 thế hệ M 4 có biểu hiện tính trạng axit phytic thấp. Kết quả phân tích bằng marker phân tử: Xác nhận lại được tính trạng axit phytic trong phân tích kiểu hình qua phân tích kiểu gen. Ghi nhận có sự đa hình giữa cá thể có hàm lượng axit phytic thấp và axit phytic cao. Kết quả cũng ghi nhận một số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp qua phân tích sinh hóa nhưng không ghi nhận qua phân tích bằng marker. Qua kết quả của khóa luận này giúp phần nào phát triển dòng lúa giàu dinh dưỡng. v ABSTRACT Topic: Evaluating the phytic acid content in some mutant and local rice lines by bio-chemical and microsatellite method. Done by student: Lê Công Thiện Advisor:Dr. Nguyễn Thị Lang and Trần Thị Dung. Phytic acid is the myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphosphate and the major storage compound of phosphorus in plants. Phytic acid is considered the anti- nutrional factor because it can bind to many ions such as Zn, Fe, Ca and causes mineral deficiency in human and animals. Five hundreds mutant lines of OM1490 , OMCS2000 M 3 (the third generation), reasonal rice and high quality rice have been analyzed to determine the low phytic acid lines by biochemical method. The result showed that there were 19 lines of 185 lines of OM 1490 and 5 lines of 165 lines of OMCS 2000 had low phytic acid trait. In reasonal rice and local rice we found that there were two lines having the low phytic acid in reasonal rice and 6 lines of local rice having the low phytic acid trait .Analysis with marker RM 207 showed that Tám xoan, OM 2718, OM 4498 having the low phytic acid trait. OM1490 and OMCS2000 mutant lines, M 3 were not identified by SSR marker due to DNA template problems. Forty (40) lines of OM 1490 M 4 were also analyzed using both biochemical and microsatellite method. In analysis of 40 lines OM 1490 M 4 using the bio- chemical method, we found that there were 9 lines having the low phytic acid trait. And the following analysis using SSR marker with marker RM 207, the result showed that there were 6 lines of OM 1490 population M 4 having the low phytic acid trait in marker analysis. We also found out that the marker RM 202 was able to create the polymorphism among the mutant lines. There were 3 lines having the low phytic acid trait in bio-chemical analysis but they didn’t show the low phytic acid trait in marker analysis. All low phytic acid lines were then grown in the nethouse in order to be analyzed in the following generation. Our findings may help plant breeders to develope the nutritional rice lines. vi MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang bìa i Trang tựa ii Lời cảm tạ iii Tóm Tắt iv Mục lục vii Danh sách các chữ viết tắt x Danh sách các hình .xi Danh sách các biểu đồ xiii Danh sách các bảng xiv 1. Lời mở đầu .1 1.1. Đặt vấn đề .1 1.2.Mục tiêu đề tài .2 1.3.Yêu cầu đề tài .2 2. Tổng quan tài liệu 3 2.1. Axit phytic .3 2.2. Đặc điểm của axit Phytic và vai trò của nó .4 2.2.1. Axit phytic đối với cây trồng .6 2.2.2. Axit phytic với con người, vật nuôi và môi trường 7 2.2.2.1. Ảnh hưởng của axit phytic đối với con người 7 2.2.2.2. Ảnh hưởng của axit phytic đối với vật nuôi và môi trường 7 2.3. Công nghệ sinh học phân tử trên cây lúa 9 2.4. Nghiên cứu di truyền gen axit phytic thấp 11 2.5. Đánh dấu siêu vệ tinh (Microsattelite) 15 2.6. Quá trình sinh tổng hợp axit phytic .15 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .18 vii 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .18 3.2. Vật liệu 18 3.3. Nguồn gốc vật liệu 18 3.4. Dụng cụ và hóa chất 20 3.4.1. Dụng cụ 20 3.4.2. Hóa chất .20 3.4.2.1. Hóa chất phân tích sinh hóa 20 3.4.2.2. Hóa chất phân tích phân tử 20 3.5. Xác định lượng photpho trong hạt bằng phương pháp sinh hoá .21 3.5.1. Phương pháp thực hiện 21 3.5.2. Tiến hành phân tích 22 3.6. Đánh giá kiểu gen qua chỉ thị phân tử .23 3.6.1. Phân lập DNA từ mẫu lá lúa 22 3.6.2. Kiểm tra chất lượng DNA 25 3.6.3. Phân tích SSR .26 3.6.3.1. PCR dùng cho một phản ứng 27 3.6.3.2. Phương pháp tiến hành 27 3.6.3.3. Phân tích mẫu trên gel .28 4. Kết quả và thảo luận 29 4.1. Đánh giá tính trạng axit phytic thấp qua phản ứng sinh hóa .29 4.1.1. Quần thể lúa mùa và lúa cao sản 29 4.1.2. Quần thể lúa đột biến .31 4.1.2.1. Quần thể lúa đột biến OM 1490 và OMCS 2000 ở thế hệ M 3 31 4.1.2.2. So sánh với kết quả ở thế hệ M 2 được nghiên cứu trước đây .36 4.1.2.3. Quần thể lúa đột biến OM 1490 và OMCS 2000 ở thế hệ M 4 36 4.2.Đánh giá tính trạng axit phytic thấp bằng Marker SSR .38 4.2.1.Trên quần thể lúa mùa và lúa cao sản .32 4.2.2. Trên quần thể đột biến OM 1490 ở thế hệ M 4 .40 5. Kết luận và đề nghị 43 viii 5.1. Kết luận .42 5.2. Đề nghị 44 6. Tài liệu tham khảo 45 6.1.Tài liệu tiếng việt .45 6.2. Tài liệu tiếng nước ngoài 45 Phụ lục 47 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT HIP: high inorganic phosphorous InsP: myo-inositol mono-photphate InsP 2 : myo-inositol bis-photphate InsP 3 : myo-inositol tris photphate InsP 4 : myo-inositol tetrakisphotphate InsP 5 : myo-inositol pentakisphotphate InsP 6 : myo-inositol hexakisphotphate PCR : polymerase chain reaction SSR: simple sequence repeat P: photpho K: Kali Zn: Kẽm Fe: Sắt Ca: Canxi M 2 , M 3 , M 4 : Thế hệ thứ 2, 3,4 MAS: Marker assisted selection x DANH SÁCH CÁC HÌNH TÊN HÌNH TRANG Hình 2.1.Cấu trúc của inositol 3 Hình 2.2. Cấu tạo lập thể của axit Phytic 4 Hình 2.3.Công thức cấu tạo của muối Phytate 4 Hình 2.4. Sơ đồ chu trình photpho trong tự nhiên 8 Hình 2.5. Phân tích bằng phương pháp Northern-blot cây yến mạch 13 Hình 2.6. Sự thay đổi nồng độ P tổng, axit phytic và và P vô cơ sau khi trổ hoa ở cây yến mạch 14 Hình 2.7. Sơ đồ con đường sinh tổng hợp axit phytic ở trong tế bào eukaryot 17 Hình 3.1. Thang photpho chuẩn 22 Hình 3.2. Kết quả DNA đã ly trích được kiểm tra chất lượng .26 Hình 4.1. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị phosphate tự do trên quần thể lúa địa phương và lúa cao sản 29 Hình 4.2. Kết quả phân tích sự thể hiện photphat tự do trên quần thê lúa mùa và lúa cao sản 30 Hình 4.3. Kết quả phân tích sự biểu hiện chất chỉ thị photphate tự do trên quần thể lúa đột biến thế hệ M 3 .31 Hình 4.4. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị photphat tự do trên quần thể lúa đột biến thế hệ M 3 32 Hình 4.5. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị photphat tự do trên quần thể lúa đột biến thế hệ M 3 32 Hình 4.6. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị Photphat tự do trên quần thể lúa đột biến thế hệ M 3 33 Hình 4.7. Kết quả phân tích sự thể hiện photphat tự do thế hệ M 3 .34 xi Hình 4.8. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị photphat tự do thế hệ M 4 37 Hình 4.9. Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer RM 207 trên quần thể lúa mùa và cao sản .39 Hình 4.10. Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer RM 202 trên quần thể lúa đột biến OM 1490 thế hệ M 4 41 Hình 4.11. Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer RM 202 trên quần thể lúa đột biến OM 1490 thế hệ M 4 41 Hình 4.12. Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer RM 207 trên quần thể lúa đột biến OM 1490 thế hệ M 4 41 Hình 4.13. Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer RM 207 trên quần thể lúa đột biến OM 1490 thế hệ M 4 .42 xii [...]... TRANG Biểu đồ 4.1 Biểu đồ thể hiện phần trăm số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp và cao ở giống OM 1490 đột biến và OMCS 2000 đột biến thế hệ M3 35 Biểu đồ 4.2 Biểu đồ thể hiện phần trăm tính trạng axit phytic thấp theo 5 mức thuộc quần thể OM 1490 và OMCS 2000 thế hệ M3 .35 Biểu 4.3 Biểu đồ so sánh tỷ lệ cá thể có hàm lượng axit phytic thấp ở M2 và M3 thuộc quần thể OM 1490 36 Biểu... có hàm lượng axit phytic thấp giữa thế hệ M3 và M4 thuộc quần thể đột biến OM 1490 38 Biểu đồ 4.5 Biểu đồ thể hiện phần trăm số cá thể biểu hiện tính axit thấp và cao thuộc quần thể đột biến OM 1490 thế hệ M4 38 xiii DANH SÁCH CÁC BẢNG TÊN BẢNG TRANG Bảng 2.1 Sự phân bố của Phytate ở hạt của một số cây trồng .5 Bảng 3.1 Tên các giống lúa được phân tích 18 Bảng 3.2 Thành phần các hóa. .. 18 Bảng 3.2 Thành phần các hóa chất trong dung dịch Chen’s 21 Bảng 3.3 Thang photpho chuẩn theo 5 mức 21 Bảng 3.4 Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR 27 Bảng 3.5 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 28 Bảng 4.1.Các cá thể được ký hiệu theo số trong bằng điện di 40 xiv . Tháng 8/2005. “ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG AXIT PHYTIC Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỊA PHƯƠNG VÀ MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỘT BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA VÀ MICROSATELLITE .. M 3 , lúa mùa và lúa cao sản được phân tích để xác định những dòng lúa có hàm lượng axit phytic thấp bởi phương pháp sinh hóa. Bốn mươi dòng đột biến