Hai hạt này thể hiện tính axit phytic thấp tương đương ở mức 2 theo thang photpho chuẩn.Tương tự cá thể 341 cũng có 2 hạt có biểu hiện tính axit phytic thấp, tương đương ở mức 2 theo tha
Trang 1Hình 4.3 Kết quả phân tích sự biểu hiện chất chỉ thỉ photphate tự do
(HIP).Trong đó cá thể 54; 77; 78; 80; 154 thuộc quần thể đột biến OM1490 Các cá thể 202; 210 thuộc quần thể đột biến của OMCS2000
Qua kết quả hình 4.3 cho thấy cá thể số 77 được ghi nhận có một hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3, 3 hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 Cá thể 78 có một hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3, và ba hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 Cá thể 80 có 5 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức
2 Cá thể số 210 có hai hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3 và hai hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 Cá thể số 154 có 5 hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 Cá thể số 54 có một hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3 Cá thể số 202 có bốn hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 Các cá thể này sau đó được trồng ở nhà lưới và tiếp tục được phân tích ở các thế hệ tiếp theo
Trang 2Hình 4.4 Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị photphat tự do (HIP) Trong đó cá thể 341, 348 thuộc quần thể đột biến OMCS2000
Qua hình 4.4 cho thấy cá thể 348 thể hiện tính axit thấp với 2 hạt trong 8 hạt được phân tích Hai hạt này thể hiện tính axit phytic thấp tương đương ở mức 2 theo thang photpho chuẩn.Tương tự cá thể 341 cũng có 2 hạt có biểu hiện tính axit phytic thấp, tương đương ở mức 2 theo thang photpho chuẩn Hai cá thể này sau
đó được tiếp tục trồng ở nhà lưới để tiếp tục được kiểm tra ở các thế hệ tiếp theo
Hình 4.5 Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị photphat tự do (HIP).Trong đó cá thể 165; 6; 3 biểu hiện đặc tính axit phytic thấp
Trang 3thấp ở mức 2 theo thang photpho chuẩn Cá thể số 6 có 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp tương đương ở mức 3 và hai hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức
2 Cá thể số 3 có 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 3 và 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 Cá thể số 16 có 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp
ở mức 2 Cá thể số 14 có 4 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 tương đương với thang photpho chuẩn Tuy nhiên các cá thể này biểu hiện tính trạng axit phytic thấp vẫn chưa đồng nhất và mức biểu hiện tính axit phytic thấp so với đối chứng lúa hoang và Lpa-1 còn thấp rất nhiều Vì vậy các cá thể này sau đó được đem ra nhà lưới và tiếp tục được chọn ở các thế hệ tiếp theo
Hình 4.6 Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị Photphat tự do Các cá thể được ghi nhận có hàm lượng axit phytic thấp là :164; 162;168; 1; 81; 170
và cá thể dùng làm đối chứng là lúa vàng và lúa hoang Các cá thể này thuộc quần thể đột biến OM 1490 thế hệ M 3
Kết quả hình 4.6 trên cho thấy cá thể số 1 biểu hiện tính axit phytic thấp nhất
và tương đối đồng nhất Cá thể số 1 có 3 hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3
và 5 hạt còn lại biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 trong 8 hạt được phân tích
Trang 4Các cá thể 81 và 170 cũng biểu hiện tính axit phytic thấp tương đối đồng nhất Tuy nhiên mức độ này vẫn không cao, mức biểu hiện tương đương ở mức chuẩn mức
2 Cá thể 164 có 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 Cá thể 162 biểu hiện tính axit phytic thấp với 1 hạt ở mức 2 Cá thể 168 có 3 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 theo thang photpho chuẩn
Hình 4.7 Kết quả phân tích sự thể hiện photphat tự do thế hệ M 3 Các cá thể được ghi nhận là có hàm lượng axit phytic thấp là 205, thuộc quần thể OMCS
2000 và các cá thể 11, 4, 167 thuộc quần thể OM 1490
Qua kết quả hình 4.7 ta thấy cá thể 167 biểu hiện tính axit phytic thấp nhất Trong đó có 1 hạt biểu hiện tính axit phytic rất rõ, tương đương ở mức 4, 1 hạt biểu hiện ở mức 3 và 3 hạt biểu hiện ở mức 2 trong 8 hạt được phân tích Cá thể
205 biểu hiện tính axit phytic thấp với 8 hạt thể hiện màu ở mức 2 Cá thể số 11 chỉ có một hạt biểu hiện tính axit phytic thấp tương đương với mức 3 Cá thể số 4 biểu hiện tính axit phytic thấp với 2 hạt thể hiện màu tương đương mức 2 theo thang photpho chuẩn
Tóm lại qua kết quả phân tích sinh hóa quần thể lúa ở thế hệ M3, ở giống OM
1490 đột biến số cá thể biểu hiện axit phytic thấp trong 185 cá thể được phân tích là:19 chiếm tỉ lệ 10,27 % Cá thể biểu hiện tính axit phytic cao ở OM 1490 là 89,73 % Tương tự ở giống OMCS 2000, số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp
Trang 589.73
3.03
96.97
0 20 40 60 80 100 120
axit phytic thấp axit phytic cao
OM1490 OMCS2000
Biểu đồ 4.1 Biểu đồ thể hiện phần trăm số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp và cao ở giống OM 1490 đột biến và OMCS 2000 đột biến thế hệ M 3
Tuy nhiên trong các cá thể đƣợc ghi nhận có hàm lƣợng axit phytic thấp thì
sự biểu hiện tính axit phytic thấp không đồng nhất ở các mức trong 8 hạt phân tích Do vậy việc đánh giá tính axit phytic thấp thông qua từng mức theo thang photpho chuẩn là cần thiết Việc tính toán này dựa trên số hạt thể hiện màu trên tổng số hạt phân tích Việc thể hiện phần trăm số hạt biểu hiện tính trạng axit phytic thấp theo từng mức cho ta thấy đƣợc mức độ biểu hiện tính axit phytic của các cá thể trong quần thể
0 20 40 60 80 100
Mức 1
Mức 2
Mức 3
Mức 4
Mức 5
OM1490 OMCS2000
Biểu đồ 4.2 Biểu đồ thể hiện phần trăm tính trạng axit phytic thấp theo 5
mức thuộc quần thể OM 1490 và OMCS 2000 thế hệ M 3
Trang 6Qua biểu đồ hình 4.14 trên cho thấy số hạt biểu hiện tính axit phytic thấp (mức 2, mức 3, mức 4, mức 5) ở các cá thể đột biện thuộc quần thể OM 1490 cao hơn các cá thể đột biến thuộc quần thể OMCS 2000
4.1.2.2 So sánh với kết quả ở thế hệ M 2 được nghiên cứu trước đây
Theo T.S Nguyễn Thị Lang và cộng tác viên khi nghiên cứu hàm lượng axit phytic ở thế hệ M2 thì tỷ lệ cá thể có hàm lượng axit phytic thấp thuộc quần thể
OM 1490 chiếm 4,3 % và trên quần thể đột biến OMCS 2000 là 0,81% Như vậy
tỷ lệ cá thể có hàm lượng axit phytic thấp ở thế hệ M3 đã tăng lên 5,97 đối với quần thể đột biến OM 1490 và 2,22 đối với quần thể OMCS 2000
4.3
10.27
0.81
3.03
0 2 4 6 8 10 12
OM1490 OMCS2000
Biểu 4.3 Biểu đồ so sánh tỷ lệ cá thể có hàm lượng axit phytic thấp ở M 2 và
M 3 thuộc quần thể OM 1490
4.1.2.3 Quần thể lúa đột biến OM 1490 ở thế hệ M 4
Chọn ngẫu nhiên 40 dòng thuộc quần thể đột biến OM 1490 thế hệ M4 để phân tích đặc tính axit phytic thấp thông qua phản ứng sinh hóa Các cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp được so sánh với thang photpho chuẩn Sau khi phân tích tính trạng axit phytic thấp thì 40 dòng này sẽ được cho nảy mầm, ly trích DNA và được phân tích bằng PCR với marker RM207 và marker RM202 Marker RM 207 liên kết chặt chẽ với gen axit phytic thấp trên nhiễm sắc thể số 2 trong bộ gen của cây lúa Marker RM 202 không có tác dụng giải thích tính trạng axit phytic thấp tuy nhiên marker cho thấy biểu hiện tính đa hình giữa các dòng đột biến
Trang 7Hình 4.8 Kết quả phân tích sự thể hiện photphat tự do thế hệ M 4 Các cá thể được ghi nhận là có hàm lượng axit phytic thấp là : 311-19; 328-1; 158-18;
144-2; 8-1; 8-3; 18-1; 122-1; 166-15 thuộc quần thể OM 1490
Qua kết quả phân tích hình 4.8, các cá thể 311-19; 328-1 biểu hiện tính axit phytic thấp với 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 trong 8 hạt phân tích ở mỗi cá thể Các cá thể 158-18 có 2 hạt biều hiện tính phytic axit thấp tương đương mức 2, cá thể 144-2 biểu hiện tính axit phytic thấp với 5 hạt tương đương mức 2, cá thể 8-1 biểu hiện tính axit phytic thấp với 2 hạt thể hiện màu tương đương mức 3, cá thể 8-3 với 1 hạt thể hiện màu ở mức 5 và 1 hạt ở mức 3, cá thể 18-1 thể hiện tính phytic axit thấp với 3 hạt tương đương mức 2, cá thể 122-1 thể hiện tính axit phytic thấp với 1 hạt ở mức 3 và 1 hạt thể hiện ở mức 4 và cá thể 166-15 thể hiện tính axit phytic thấp với 2 hạt tương đương mức 3
Qua kết quả phân tích bằng phương pháp sinh hóa cho thấy số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp là 9 trong 40 dòng phân tích, chiếm tỷ lệ 22,5 % và số cá thể biểu hiện tính axit phytic cao chiếm 77,5% So với thế hệ M3 thì số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp đã tăng 12,23 %
Trang 810.27
22.5
0 5 10 15 20 25
OM1490
Biểu đồ 4.4 Biểu đồ so sánh tỷ lệ cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp giữa
thế hệ M 3 và M 4 thuộc quần thể đột biến OM 1490
OM1490, M4
22.5
77.5
0 20 40 60 80 100
axit phytic thấp axit phytic cao
OM1490, M4
Biểu đồ 4.5 Biểu đồ thể hiện phần trăm số cá thể biểu hiện tính axit thấp và
cao thuộc quần thể đột biến OM 1490 thế hệ M 4
4.2.Đánh giá tính trạng axit phytic thấp bằng Marker SSR
4.2.1Trên quần thể lúa mùa và lúa cao sản
Chúng tôi tiến hành kiểm tra kiểu gen bằng marker SSR với marker RM
207 trên các cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp và các cá thể dùng làm đối chứng nhƣ dạng OM1490 và OMCS2000 chƣa đƣợc đột biến, lúa hoang ,Lpa-1, Xie Q Zao Cá thể OM1490 và OMCS2000 chƣa đƣợc đột biến này là đối chứng cho tính trạng axit phytic cao Cá thể lúa hoang, Lpa-1, Xie Q Zao là những cá thể
có hàm lƣợng axit phytic thấp vì vậy chúng đƣợc dùng làm đối chứng cho tính trạng axit phytic thấp Marker RM 207 liên kết chặt chẽ với gen axit phytic thấp nằm trên nhiễm sắc thể số 2 Marker RM 207 cho thấy sự khác biệt giữa các cá thể
Trang 92000 dạng bố mẹ chưa được gây đột biến (lane 1 và lane 3) và đối chứng thấp về hàm lượng axit phytic như giống Lpa-1, giống lúa hoang, Xie Qing Zao (lane 2, lane 11, lane 12), các dòng khác được ghi nhận như sau: Các dòng có biểu hiện tính axit phytic thấp là OM 2718, OM 4498, lúa vàng Theo kết quả nghiên cứu trước đây kích thước band hình trên bản điện di của các dòng này là 250 bp Các dòng khác biểu hiện tính axit phytic thấp trong thử nghiệm bằng phương pháp sinh hóa nhưng không ghi nhận qua phân tích bằng marker phân tử là : OM 2490 (lane 4), nếp tóc (lane 5), OM 5731 (lane 6), Tám xoan (lane 7)
Tuy nhiên sự đa hình nầy chưa thấy rõ sự tách kiểu gen nghiên về hàm lượng phytic acid thấp hay cao Do hàm lượng phytic acid trong hạt gạo có liên quan đa gen khó đánh giá đơn gen và một vài marker cần phải nghiên cứu và phối hợp di truyền số lượng để tách đa gen nầy
Hình 4.9:Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer RM 207
trên quần thể lúa mùa và cao sản
1: OM 1490 , 2: Lpa -1 , 3: OMCS 2000, 4: OM 2490 , 5: Nếp tóc ;6:
OM 5731, 7: Tám xoan -93, 8: OM 2718, 9:OM 4498, 10: lúa Vàng ,
11: lúa hoang , 12 : Xie Qing Zao
250bp
Trang 104.2.2 Trên quần thể đột biến OM 1490 ở thế hệ M 4
Bốn mươi dòng M4 được đánh giá kiểu gen thông qua hai marker RM 207F-R và RM 202F-R Hai marker nầy được liên kết trên nhiễm sắc thể số 2 và
nhiễm sắc thể số 11 theo thứ tự
Bảng 4.1.Các cá thể được ký hiệu theo số trong bằng điện di:
1 39-1
2 2-1
3 12-14
4 60-1
5 80-1
6 166-15 *
7 69-2
8 8-3 *
9 20-1
10 100-2
11 61-2
12 131-2
13 122-1 *
14 311-19 *
15 1-13
16 61-1
17 129-2
18 335-9
19 249-1
20 158-18 *
21 144-2 *
22 15-1
23 173-2
24 103-2
25 38-1
26 222-1
27 171-1
28 137-1
29 11-2
30 27-10
31 107-1
32 44-2
33 328-1 *
34 8-1 *
35 338-20
36 18-1 *
37 336-1
38 261-10
39 187-1
40 338-1
( Dấu “*” ký hiệu các cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp qua phân tích sinh hóa)
Bảng 4.5 Các cá thể thuộc quần thể OM 1490 thế hệ M 4
Đối với marker RM 202 là marker liên kết với nhiễm sắc thể số 11 , tuy nhiên ghi nhận có sự đa hình trên các dòng đột biến Do đó đối với marker nầy chỉ là số liệu tham khảo để giải thích cho các gen đột biến nhưng không giải thích
rõ hàm lượng phytic acid cao và thấp (hình 4.10 và 4.11)
Để phân tích marker liên kết với gen hàm lượng phytic thấp và cao , tiếp tục dùng marker RM 207F-R để chạy PCR Sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agarose với nồng độ 3% Kết quả ghi nhận băng hình cho thấy đa hình trên hình 4.12 và 4.13 Mặc dù không có thang DNA chuẩn trong bản điện di để xác định kích thước các đa hình này nhưng với sự so sánh với những đối chứng mà có tính trạng axit phytic cao trong phân tích sinh hóa và những nghiên cứu trước đây của Lang và cộng sự năm 2004 thì những băng hình giải thích cho tính trạng axit phytic thấp này có kích thước là 250 bp
So sánh kiểu gen và kiểu hình trên marker RM 207 trên quần thể M4 ghi nhận cả hai cho sự liên kết phù hợp trên bảng là 66,67 %