Luận văn : ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG AXIT PHYTIC Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỊA PHƯƠNG VÀ MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỘT BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA VÀ MICROSATELLITE part 4 pptx

31 4.1.2. Quần thể lúa đột biến 4.1.2.1. Quần thể lúa đột biến OM 1490 và OMCS 2000 ở thế hệ M 3 . Hình 4.3. Kết quả phân tích sự biểu hiện chất chỉ thỉ photphate tự do (HIP).Trong đó cá thể 54; 77; 78; 80; 154 thuộc quần thể đột biến OM1490. Các cá thể 202; 210 thuộc quần thể đột biến của OMCS2000. Qua kết quả hình 4.3 cho thấy cá thể số 77 đƣợc ghi nhận có một hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3, 3 hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể 78 có một hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3, và ba hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể 80 có 5 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 210 có hai hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3 và hai hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 154 có 5 hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 54 có một hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3. Cá thể số 202 có bốn hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Các cá thể này sau đó đƣợc trồng ở nhà lƣới và tiếp tục đƣợc phân tích ở các thế hệ tiếp theo. 32 Hình 4.4. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị photphat tự do (HIP). Trong đó cá thể 341, 348 thuộc quần thể đột biến OMCS2000. Qua hình 4.4 cho thấy cá thể 348 thể hiện tính axit thấp với 2 hạt trong 8 hạt đƣợc phân tích. Hai hạt này thể hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng ở mức 2 theo thang photpho chuẩn.Tƣơng tự cá thể 341 cũng có 2 hạt có biểu hiện tính axit phytic thấp, tƣơng đƣơng ở mức 2 theo thang photpho chuẩn. Hai cá thể này sau đó đƣợc tiếp tục trồng ở nhà lƣới để tiếp tục đƣợc kiểm tra ở các thế hệ tiếp theo. Hình 4.5. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị photphat tự do (HIP).Trong đó cá thể 165; 6; 3 biểu hiện đặc tính axit phytic thấp. 33 Từ kết quả hình 4.5 chúng tôi ghi nhận kết quả nhƣ sau: cá thể số 165 có một hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 3 và 3 hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 theo thang photpho chuẩn. Cá thể số 6 có 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng ở mức 3 và hai hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 3 có 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 3 và 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 16 có 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể số 14 có 4 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 tƣơng đƣơng với thang photpho chuẩn. Tuy nhiên các cá thể này biểu hiện tính trạng axit phytic thấp vẫn chƣa đồng nhất và mức biểu hiện tính axit phytic thấp so với đối chứng lúa hoang và Lpa-1 còn thấp rất nhiều. Vì vậy các cá thể này sau đó đƣợc đem ra nhà lƣới và tiếp tục đƣợc chọn ở các thế hệ tiếp theo. Hình 4.6. Kết quả phân tích sự thể hiện chất chỉ thị Photphat tự do. Các cá thể đƣợc ghi nhận có hàm lƣợng axit phytic thấp là :164; 162;168; 1; 81; 170 và cá thể dùng làm đối chứng là lúa vàng và lúa hoang. Các cá thể này thuộc quần thể đột biến OM 1490 thế hệ M 3 . Kết quả hình 4.6 trên cho thấy cá thể số 1 biểu hiện tính axit phytic thấp nhất và tƣơng đối đồng nhất. Cá thể số 1 có 3 hạt thể hiện tính axit phytic thấp ở mức 3 và 5 hạt còn lại biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 trong 8 hạt đƣợc phân tích. 34 Các cá thể 81 và 170 cũng biểu hiện tính axit phytic thấp tƣơng đối đồng nhất Tuy nhiên mức độ này vẫn không cao, mức biểu hiện tƣơng đƣơng ở mức chuẩn mức 2. Cá thể 164 có 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2. Cá thể 162 biểu hiện tính axit phytic thấp với 1 hạt ở mức 2. Cá thể 168 có 3 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 theo thang photpho chuẩn. Hình 4.7. Kết quả phân tích sự thể hiện photphat tự do thế hệ M 3 . Các cá thể đƣợc ghi nhận là có hàm lƣợng axit phytic thấp là 205, thuộc quần thể OMCS 2000 và các cá thể 11, 4, 167 thuộc quần thể OM 1490. Qua kết quả hình 4.7 ta thấy cá thể 167 biểu hiện tính axit phytic thấp nhất. Trong đó có 1 hạt biểu hiện tính axit phytic rất rõ, tƣơng đƣơng ở mức 4, 1 hạt biểu hiện ở mức 3 và 3 hạt biểu hiện ở mức 2 trong 8 hạt đƣợc phân tích. Cá thể 205 biểu hiện tính axit phytic thấp với 8 hạt thể hiện màu ở mức 2. Cá thể số 11 chỉ có một hạt biểu hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng với mức 3. Cá thể số 4 biểu hiện tính axit phytic thấp với 2 hạt thể hiện màu tƣơng đƣơng mức 2 theo thang photpho chuẩn. Tóm lại qua kết quả phân tích sinh hóa quần thể lúa ở thế hệ M 3 , ở giống OM 1490 đột biến số cá thể biểu hiện axit phytic thấp trong 185 cá thể đƣợc phân tích là:19 chiếm tỉ lệ 10,27 %. Cá thể biểu hiện tính axit phytic cao ở OM 1490 là 89,73 %. Tƣơng tự ở giống OMCS 2000, số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp 35 trong 165 cá thể đƣợc phân tích là: 5, chiếm tỷ lệ 3,03 %. Số cá thể biểu hiện tính axit phytic cao ở giống OMCS 2000 đột biến là 96,97 %. 10.27 89.73 3.03 96.97 0 20 40 60 80 100 120 axit phytic thấp axit phytic cao OM1490 OMCS2000 Biểu đồ 4.1. Biểu đồ thể hiện phần trăm số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp và cao ở giống OM 1490 đột biến và OMCS 2000 đột biến thế hệ M 3 Tuy nhiên trong các cá thể đƣợc ghi nhận có hàm lƣợng axit phytic thấp thì sự biểu hiện tính axit phytic thấp không đồng nhất ở các mức trong 8 hạt phân tích. Do vậy việc đánh giá tính axit phytic thấp thông qua từng mức theo thang photpho chuẩn là cần thiết. Việc tính toán này dựa trên số hạt thể hiện màu trên tổng số hạt phân tích. Việc thể hiện phần trăm số hạt biểu hiện tính trạng axit phytic thấp theo từng mức cho ta thấy đƣợc mức độ biểu hiện tính axit phytic của các cá thể trong quần thể. 0 20 40 60 80 100 Mức 1 Mức 2 Mức 3 Mức 4 Mức 5 OM1490 OMCS2000 Biểu đồ 4.2. Biểu đồ thể hiện phần trăm tính trạng axit phytic thấp theo 5 mức thuộc quần thể OM 1490 và OMCS 2000 thế hệ M 3 . 36 Qua biểu đồ hình 4.14 trên cho thấy số hạt biểu hiện tính axit phytic thấp (mức 2, mức 3, mức 4, mức 5) ở các cá thể đột biện thuộc quần thể OM 1490 cao hơn các cá thể đột biến thuộc quần thể OMCS 2000. 4.1.2.2. So sánh với kết quả ở thế hệ M 2 đƣợc nghiên cứu trƣớc đây Theo T.S Nguyễn Thị Lang và cộng tác viên khi nghiên cứu hàm lƣợng axit phytic ở thế hệ M 2 thì tỷ lệ cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp thuộc quần thể OM 1490 chiếm 4,3 % và trên quần thể đột biến OMCS 2000 là 0,81%. Nhƣ vậy tỷ lệ cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp ở thế hệ M 3 đã tăng lên 5,97 đối với quần thể đột biến OM 1490 và 2,22 đối với quần thể OMCS 2000. 4.3 10.27 0.81 3.03 0 2 4 6 8 10 12 Thế hệ M2 Thế hệ M3 OM1490 OMCS2000 Biểu 4.3. Biểu đồ so sánh tỷ lệ cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp ở M 2 và M 3 thuộc quần thể OM 1490. 4.1.2.3. Quần thể lúa đột biến OM 1490 ở thế hệ M 4 Chọn ngẫu nhiên 40 dòng thuộc quần thể đột biến OM 1490 thế hệ M 4 để phân tích đặc tính axit phytic thấp thông qua phản ứng sinh hóa. Các cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp đƣợc so sánh với thang photpho chuẩn. Sau khi phân tích tính trạng axit phytic thấp thì 40 dòng này sẽ đƣợc cho nảy mầm, ly trích DNA và đƣợc phân tích bằng PCR với marker RM207 và marker RM202. Marker RM 207 liên kết chặt chẽ với gen axit phytic thấp trên nhiễm sắc thể số 2 trong bộ gen của cây lúa. Marker RM 202 không có tác dụng giải thích tính trạng axit phytic thấp tuy nhiên marker cho thấy biểu hiện tính đa hình giữa các dòng đột biến. 37 Hình 4.8. Kết quả phân tích sự thể hiện photphat tự do thế hệ M 4 . Các cá thể đƣợc ghi nhận là có hàm lƣợng axit phytic thấp là : 311-19; 328-1; 158-18; 144-2; 8-1; 8-3; 18-1; 122-1; 166-15 thuộc quần thể OM 1490. Qua kết quả phân tích hình 4.8, các cá thể 311-19; 328-1 biểu hiện tính axit phytic thấp với 2 hạt biểu hiện tính axit phytic thấp ở mức 2 trong 8 hạt phân tích ở mỗi cá thể. Các cá thể 158-18 có 2 hạt biều hiện tính phytic axit thấp tƣơng đƣơng mức 2, cá thể 144-2 biểu hiện tính axit phytic thấp với 5 hạt tƣơng đƣơng mức 2, cá thể 8-1 biểu hiện tính axit phytic thấp với 2 hạt thể hiện màu tƣơng đƣơng mức 3, cá thể 8-3 với 1 hạt thể hiện màu ở mức 5 và 1 hạt ở mức 3, cá thể 18-1 thể hiện tính phytic axit thấp với 3 hạt tƣơng đƣơng mức 2, cá thể 122-1 thể hiện tính axit phytic thấp với 1 hạt ở mức 3 và 1 hạt thể hiện ở mức 4 và cá thể 166-15 thể hiện tính axit phytic thấp với 2 hạt tƣơng đƣơng mức 3. Qua kết quả phân tích bằng phƣơng pháp sinh hóa cho thấy số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp là 9 trong 40 dòng phân tích, chiếm tỷ lệ 22,5 % và số cá thể biểu hiện tính axit phytic cao chiếm 77,5%. So với thế hệ M 3 thì số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp đã tăng 12,23 %. 38 OM1490 10.27 22.5 0 5 10 15 20 25 Thế hệ M3 Thế hệ M4 OM1490 Biểu đồ 4.4. Biểu đồ so sánh tỷ lệ cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp giữa thế hệ M 3 và M 4 thuộc quần thể đột biến OM 1490. OM1490, M4 22.5 77.5 0 20 40 60 80 100 axit phytic thấp axit phytic cao OM1490, M4 Biểu đồ 4.5 . Biểu đồ thể hiện phần trăm số cá thể biểu hiện tính axit thấp và cao thuộc quần thể đột biến OM 1490 thế hệ M 4 . 4.2.Đánh giá tính trạng axit phytic thấp bằng Marker SSR 4.2.1Trên quần thể lúa mùa và lúa cao sản Chúng tôi tiến hành kiểm tra kiểu gen bằng marker SSR với marker RM 207 trên các cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp và các cá thể dùng làm đối chứng nhƣ dạng OM1490 và OMCS2000 chƣa đƣợc đột biến, lúa hoang ,Lpa-1, Xie Q. Zao. Cá thể OM1490 và OMCS2000 chƣa đƣợc đột biến này là đối chứng cho tính trạng axit phytic cao. Cá thể lúa hoang, Lpa-1, Xie Q. Zao là những cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp vì vậy chúng đƣợc dùng làm đối chứng cho tính trạng axit phytic thấp. Marker RM 207 liên kết chặt chẽ với gen axit phytic thấp nằm trên nhiễm sắc thể số 2. Marker RM 207 cho thấy sự khác biệt giữa các cá thể 39 có hàm lƣợng axit phytic cao và các cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp. Dựa vào những dòng đối chứng cao về hàm lƣợng axit phytic nhƣ OM 1490 và OMCS 2000 dạng bố mẹ chƣa đƣợc gây đột biến (lane 1 và lane 3) và đối chứng thấp về hàm lƣợng axit phytic nhƣ giống Lpa-1, giống lúa hoang, Xie Qing Zao (lane 2, lane 11, lane 12), các dòng khác đƣợc ghi nhận nhƣ sau: Các dòng có biểu hiện tính axit phytic thấp là OM 2718, OM 4498, lúa vàng. Theo kết quả nghiên cứu trƣớc đây kích thƣớc band hình trên bản điện di của các dòng này là 250 bp. Các dòng khác biểu hiện tính axit phytic thấp trong thử nghiệm bằng phƣơng pháp sinh hóa nhƣng không ghi nhận qua phân tích bằng marker phân tử là : OM 2490 (lane 4), nếp tóc (lane 5), OM 5731 (lane 6), Tám xoan (lane 7). Tuy nhiên sự đa hình nầy chƣa thấy rõ sự tách kiểu gen nghiên về hàm lƣợng phytic acid thấp hay cao . Do hàm lƣợng phytic acid trong hạt gạo có liên quan đa gen khó đánh giá đơn gen và một vài marker cần phải nghiên cứu và phối hợp di truyền số lƣợng để tách đa gen nầy. Hình 4.9:Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer RM 207 trên quần thể lúa mùa và cao sản. 1: OM 1490 , 2: Lpa -1 , 3: OMCS 2000, 4: OM 2490 , 5: Nếp tóc ;6: OM 5731, 7: Tám xoan -93, 8: OM 2718, 9:OM 4498, 10: lúa Vàng , 11: lúa hoang , 12 : Xie Qing Zao 250bp 40 4.2.2. Trên quần thể đột biến OM 1490 ở thế hệ M 4 Bốn mƣơi dòng M 4 đƣợc đánh giá kiểu gen thông qua hai marker RM 207F-R và RM 202F-R . Hai marker nầy đƣợc liên kết trên nhiễm sắc thể số 2 và nhiễm sắc thể số 11 theo thứ tự. Bảng 4.1.Các cá thể đƣợc ký hiệu theo số trong bằng điện di: 1. 39-1 2. 2-1 3. 12-14 4. 60-1 5. 80-1 6. 166-15 * 7. 69-2 8. 8-3 * 9. 20-1 10. 100-2 11. 61-2 12. 131-2 13. 122-1 * 14. 311-19 * 15. 1-13 16. 61-1 17. 129-2 18. 335-9 19. 249-1 20. 158-18 * 21. 144-2 * 22. 15-1 23. 173-2 24. 103-2 25. 38-1 26. 222-1 27. 171-1 28. 137-1 29. 11-2 30. 27-10 31. 107-1 32. 44-2 33. 328-1 * 34. 8-1 * 35. 338-20 36. 18-1 * 37. 336-1 38. 261-10 39. 187-1 40. 338-1 ( Dấu “*” ký hiệu các cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp qua phân tích sinh hóa) Bảng 4.5. Các cá thể thuộc quần thể OM 1490 thế hệ M 4 Đối với marker RM 202 là marker liên kết với nhiễm sắc thể số 11 , tuy nhiên ghi nhận có sự đa hình trên các dòng đột biến . Do đó đối với marker nầy chỉ là số liệu tham khảo để giải thích cho các gen đột biến nhƣng không giải thích rõ hàm lƣợng phytic acid cao và thấp (hình 4.10 và 4.11). Để phân tích marker liên kết với gen hàm lƣợng phytic thấp và cao , tiếp tục dùng marker RM 207F-R để chạy PCR . Sản phẩm PCR đƣợc chạy điện di trên gel agarose với nồng độ 3%. Kết quả ghi nhận băng hình cho thấy đa hình trên hình 4.12 và 4.13. Mặc dù không có thang DNA chuẩn trong bản điện di để xác định kích thƣớc các đa hình này nhƣng với sự so sánh với những đối chứng mà có tính trạng axit phytic cao trong phân tích sinh hóa và những nghiên cứu trƣớc đây của Lang và cộng sự năm 2004 thì những băng hình giải thích cho tính trạng axit phytic thấp này có kích thƣớc là 250 bp. So sánh kiểu gen và kiểu hình trên marker RM 207 trên quần thể M 4 ghi nhận cả hai cho sự liên kết phù hợp trên bảng là 66,67 % . . -93, 8: OM 2718, 9:OM 44 98, 1 0: lúa Vàng , 1 1: lúa hoang , 12 : Xie Qing Zao 250bp 40 4. 2.2. Trên quần thể đột biến OM 149 0 ở thế hệ M 4 Bốn mƣơi dòng M 4 đƣợc đánh giá kiểu. tính axit phytic thấp và cao ở giống OM 149 0 đột biến và OMCS 2000 đột biến thế hệ M 3 Tuy nhiên trong các cá thể đƣợc ghi nhận có hàm lƣợng axit phytic thấp thì sự biểu hiện tính axit phytic. thấp ở M 2 và M 3 thuộc quần thể OM 149 0. 4. 1.2.3. Quần thể lúa đột biến OM 149 0 ở thế hệ M 4 Chọn ngẫu nhiên 40 dòng thuộc quần thể đột biến OM 149 0 thế hệ M 4 để phân tích đặc tính axit