Luận văn : ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG AXIT PHYTIC Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỊA PHƯƠNG VÀ MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỘT BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA VÀ MICROSATELLITE part 5 pdf

41 Hình 4.10. Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer RM 202 trên quần thể lúa đột biến OM 1490 thế hệ M 4 Hình 4.11. Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer RM 202 trên quần thể lúa đột biến OM 1490 thế hệ M 4 Hình 4.12. Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer RM 207 trên quần thể lúa đột biến OM 1490 thế hệ M 4 Ở hình 4.12 cho thấy sự đa hình thể hiện với hai băng hình 34 và 36 tƣơng đƣơng với hai cá thể 8-1 và 18-1. Hai băng hình này giải thích cho tính trạng axit 250bp 42 phytic thấp trong phân tích kiểu gen với marker RM207 liên kết chặt chẽ với gen axit phytic thấp trên nhiễm sắc thể số 2. Các băng hình còn lại thể hiện tính trạng axit phytic cao trong phân tích kiểu gen. Hình 4.13. Kết quả phân tích bằng microsatellite với primer RM 207 Kết quả phân tích hình 4.13 cho thấy sự đa hình đƣợc thể hiện trên bản điện di. Các băng hình thể hiện tính trạng axit phytic thấp là các band hình thứ 6; 8; 20; 21 tƣơng ứng với các cá thể 166-15; 8-3; 158-18; 144-2. Các băng hình còn lại thể hiện tính trạng axit phytic cao trong phân tích kiểu gen. Một số cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp khi phân tích bằng phƣơng pháp sinh hóa nhƣng không ghi nhận đặc điểm này khi phân tích bằng marker RM207 là 122-1, 311-19, 328-1. 250bp 250bp 43 CHƢƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1.Kết luận Các cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp rất ít và thƣờng không đồng nhất.Tuy nhiên qua so sánh thì số cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp tăng dần qua các thế hệ chọn lọc M 2 đến M 4 Kết quả phân tích sinh hóa ở thế hệ M 3 , chúng tôi tìm đƣợc 19 cá thể thuộc quần thể đột biến OM 1490 trong 185 cá thể đƣợc phân tích và 5 cá thể thuộc quần thể đột biến OMCS 2000 biểu hiện tính axit phytic thấp.Tuy nhiên mức độ biểu biện tính axit phytic thấp vẫn chƣa cao và chƣa đồng nhất so với giống đối chứng ( lúa hoang, Lpa-1, Lpa-2). Đối với giống lúa mùa chỉ ghi nhận 2 cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng mức 3 theo thang photpho chuẩn là Nếp tóc và Tám Xoan. Đối với 130 giống lúa cao sản để đánh giá hàm lƣợng axit phytic. Kết quả chỉ ghi nhận giống OM 2490, OM 4498 , OM 2718 ; OM 5731-5 ; OM 5731-7 và DS 2002 đều tạo phức màu xanh tƣơng đƣơng với giếng chuẩn thứ 3. Ở thế hệ M 4 ghi nhận có 9 cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp trong 40 cá thể phân tích. Tuy nhiên khi Kiểm tra lại bằng marker SSR với primer 207 thì chỉ ghi nhận có 6 cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp. Tìm đƣợc một marker RM 202 liên kết trên nhiễm sắc thể số 11 cho đa hình và tách các dòng đột biến thuộc quần thể đột biến OM 1490 . Đối với kiểu gen phân tích trên marker RM 207 trên nhiễm sắc thể số 2 có ghi nhận đa hình trên các giống có hàm lƣợng axit phytic thấp, tuy nhiên cũng còn vài giống ghi nhận là phytic axit thấp bên kiểu hình nhƣng khi đánh giá bằng marker chƣa cho thấy đa hình . Điều nầy cũng ghi nhận rõ ràng rằng trên hạt gạo cần phải xem xét sự ổn định của các thế hệ nhất là các dòng đột biến. Dựa vào phân tích đánh dấu bằng marker phân tử SSR, chúng ta có thể khai thác tiềm năng kiểu gen của các dòng hoặc cây bố mẹ. Do đó, việc chọn lọc 44 cẩn thận các dòng đột biến sẽ giúp chúng ta có nguồn vật liệu lai phù hợp và dễ khai thác, chọn lựa theo các gen có hàm lƣợng axit phytic cao và thấp nhƣ mong muốn. 5.2.Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu và chọn lọc các cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp ở các thế hệ tiếp theo để tăng số cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp và tăng tính đồng nhất. Tuy nhiên đối với quần thể đột biến đặc biệt là đột biến vật lý , việc chọn lựa quần thể biến động trong một giống rất khó cần phải sử dụng một phƣơng pháp phân tích genome với kỹ thuật SNP để khai thác sự biến động các allele nhỏ trong quần thể đột biến. Đề nghị nghiên cứu tiếp tục bản đồ finemapping cho gen axit phytic thấp trên nhiều quần thể để tìm nhiều marker liên kết cả gen chính và gen phụ trên các tính trạng nầy . 45 CHƢƠNG VI Tài liệu tham khảo 6.1. Tài liệu tiếng việt. 1. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương Pháp Cơ Bản Trong Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học. Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp,TP.Hồ Chí Minh, p 63-72. 2. Nguyễn Thị Lang, Trần Đình Giỏi và Bùi Chí Bửu. 2005. Nghiên Cứu Gen Lúa Có Hàm Lượng Axit Phytic Thấp. Tạp chí Nông Nghiệp (chuẩn bị đăng). 3. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thạch Cân, Trần Thị Lũy, Trịnh Hoàng Khải, Phạm Thị Bé Tƣ, Nguyễn Thị Tâm, Đặng Minh Tâm, Bùi Thị Dƣơng Khuyều, Nguyễn Thuần Khiết, Trần Thanh Sơn, Trần Bá Thảo. 2002. Ứng dụng công nghệ sinh học chọn tạo giống lúa chất lượng cao. Sở khoa học công nghệ và môi trƣờng tỉnh An Giang. 4. Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu,1999. Định hướng công tác chọn tạo gen kháng sâu bệnh cho cây lúa bằng marker phân tử. Hội nghị nghiên cứu và ứng dụng sinh học ở ĐBSCL lần thứ I tháng 5/1999. Liên hiệp các hội khoa học và kỹ thuật tỉnh Cần Thơ. 5.Trịnh Hoàng Khải, 2004. Đánh giá tính trạng nông học và tính trạng axit phytic ở những dòng somclonal đột biến. Đề cƣơng luận văn thạc sĩ chuyên nghành công nghệ sinh học. 6. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên, 1998. Giáo Trình Sinh Hóa Hiện Đại. Nhà Xuất Bản Giáo Dục. 7. Vũ Văn Vụ, 2000. Sinh lý học thực Vật. Nhà xuất bản giáo dục, 251 trang. 6.2. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 8. Hill B., Hankins L., Trapp S. A., Sutton A.L., and Richert B. T.,2002.Effects of Low Phytic Acid Corn, Low Phytic Acid Soybean Meal and Phytase on Nutrient Excretion and Nutrient Digestibility in Pigs. Purdue University Swine Research Report 46 9. Marie T. Ruel and Howarth E. Bouis, June 1997. Plant breeding: a long-term strategy for the control of zinc deficiency in vulnerable populations.The American journal of clinical nutrition volume 30. 10. Drew L. Kershen, 11-2002. Agricultural Biotechnology: Environmental Benefits for Identifiable Environmental Problems. 11. Shi J. and Beach L. R.,1999 . The application of Genomics to improve the nutritional value of corn 12. Lott N.A. John, Ockenden I., Raboy Victor and Batten D. G., 2000. Phytic acid and phosphorus in crop seeds and fruits : a global estimate. Seed science research 10: pp. 11-33. 13. Raboy V., Gerbasi P. F., Young A. K., Stoneberg D. Sierra, Pickett G. Suewiya, Bauman T. Andrew , Murthy P.N. Pushpalatha, Sheridan F. William, and Ertl S.David, September 2000.Origin and Seed Phenotype of Maize low phytic acid 1-1 and low phytic acid 2-1. Plant Physiol 124: 355-368. 14. Raboy V., 2002. Progress in breeding low phytate crops. Journal Nutrition 132 Lackey K. H., Pope M. P. and Johnson D. M., 2003. Expression of L-Myoinositol- 1-photphate synthase in organelles. Plant Physiology 132: pp.2240-2247. Các trang web: www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/3/2/1/724_saneoka.htm www.etd.lsu.edu/docs/available/etd-03242004- 154627/unrestricted/Chapters1and2.pdf www.Chemicalland21.com www.etd.lsu.edu/docs/available/etd-03242004- 154627/unrestricted/Chapters1and2.pdf www.ajcn.org/cgi/content/abstract/68/2/488S www.ansc.purdue.edu/swine/swineday/sday02/4.htm www.botanischergarten.ch/Benefits/KershenEnvirBenefits.pdf 47 Phụ lục 1.Thành phần các dung dịch chuẩn bị trong phƣơng pháp sinh hoá Thành phần Hàm lƣợng Thể tích (ml) 0.4M HCl 6N H 2 SO 4 2.5%(NH 4 ) 2 Mo 10% Vitamin C 1mM K 2 PO 4 3.5 ml 16.3 ml 2.5g 10.00g 0.013g 100 100 100 100 100 2.Thành phần TE (pH=8) Thành phần Nồng độ Thể tích 50ml Tris(PH=8) EDTA (pH=8) H 2 O 10 mM 0.5M 0.5ml 0.1ml 49.6ml 3. Thành phần loading buffer 10X Thành phần Thể tích 1M Tris (pH=8) Glycerol 0,5M EDTA (pH=8) Bromphenol blue Xylen cyanol R H 2 O 0,5ml 5,0ml 100,0 l 15,0mg 15,0mg 4,5ml 4.Thành phần TAE 50X Thành phần Thể tích (1lít) Tris baz Glacial acetic axit 0,5M EDTA (pH=8) 24g 57,1ml 100ml 5. Thành phần dung dịch ly trích Dung dịch ly trích bao gồm các thành phần sau: 48 1M Tris, 5M NaCl, 0.5M EDTA. Các thành phần này đƣợc lấy theo thể tích tƣơng ứng là 100ml 1M Tris, 100ml 5M NaCl, 40ml 0.5M EDTA và thêm nƣớc cấtt 2 lần vào cho đủ 1000ml. 6. Bảng thể hiện số hạt có tính trạng axit phytic thấp theo từng mức ở các cá thể đột biến thế hệ M 3 thuộc quần thể đột biến OM 1490. Mức Cá thể Mức1 (hạt) Mức 2 (hạt) Mức 3 (hạt) Mức 4 (hạt) Mức 5 (hạt) 1. Cá thể 54 2. Cá thể 77 3. Cá thể 78 4. Cá thể 80 5. Cá thể 154 6. Cá thể 165 7. Cá thể 6 8. Cá thể 3 9. Cá thể 16 10. Cá thể 14 11. Cá thể 1 12. Cá thể 81 13. Cá thể 170 14. Cá thể 164 15. Cá thể 162 16. Cá thể 168 17. Cá thể 167 18. Cá thể 11 19. Cá thể 4 7 4 4 3 3 4 4 4 6 4 0 0 0 6 7 5 3 7 6 0 3 3 5 5 3 2 2 2 4 5 8 8 2 1 3 3 0 2 1 1 1 0 0 1 2 2 0 0 3 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 49 7. Bảng thể hiện số hạt có tính trạng axit phytic thấp theo từng mức ở các cá thể đột biến thế hệ M 3 thuộc quần thể đột biến OMCS 2000. Mức Cá thể Mức 1 (hạt) Mức 2 (hạt) Mức 3 (hạt) Mức 4 (hạt) Mức 5 (hạt) Cá thể 210 Cá thể 202 Cá 348 Cá thể 341 Cá thể 205 4 4 6 6 0 2 4 2 2 8 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8. Bảng thể hiện số hạt có tính trạng axit phytic thấp theo từng mức ở các cá thể đột biến thế hệ M 4 thuộc quần thể đột biến OM 1490 Mức Cá thể Mức1 (hạt) Mức 2 (hạt) Mức 3 (hạt) Mức 4 (hạt) Mức 5 (hạt) 20. cá thể 158-18 21. Cá thể 144-2 22. Cá thể 8-1 23. Cá thể 8-3 24. Cá thể 18-1 25. Cá thể 122-1 26. Cá thể 166-15 27. Cá thể 311-19 28. Cá thể 328-1 6 3 6 6 5 6 6 6 6 2 5 0 0 3 0 0 2 0 0 2 1 0 1 2 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 . để tăng số cá thể có hàm lƣợng axit phytic thấp và tăng tính đồng nhất. Tuy nhiên đối với quần thể đột biến đặc biệt là đột biến vật lý , việc chọn lựa quần thể biến động trong một giống rất. học và tính trạng axit phytic ở những dòng somclonal đột biến. Đề cƣơng luận văn thạc sĩ chuyên nghành công nghệ sinh học. 6. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên, 1998. Giáo Trình Sinh Hóa. với giống lúa mùa chỉ ghi nhận 2 cá thể biểu hiện tính axit phytic thấp tƣơng đƣơng mức 3 theo thang photpho chuẩn là Nếp tóc và Tám Xoan. Đối với 130 giống lúa cao sản để đánh giá hàm lƣợng axit