Luận văn : Khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum, Corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan - Việt Nam part 4 potx

31 7 Mạt cưa cao su + cám bắp 10% 8 Mạt cưa cao su + cám gạo 5% + super lân 5 o / oo + urê 2,5 o / oo 9 Mạt cưa cao su + urê 2,5 o / oo + DAP 2,5 o / oo 10 Mạt cưa cao su + cám gạo 5% + dynamic lifter 2,5%. Tổng số bịch cấy trong 3 lần: 390 bịch Các chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi quá trình sinh trưởng và hình thành quả thể nấm Linh chi đen Cách tiến hành:  Mạt cưa cao su khô được bổ sung vôi bột với tỷ lệ 0,25% (theo trọng luợng khô của mạt cưa), bổ sung nước, trộn đều và ủ qua đêm. Độ ẩm của cơ chất mạt cưa đã ủ vôi qua đêm khoảng 45%.  Trộn đều các loại giá thể tổng hợp trên với nước sạch (có bổ sung các chất dinh dưỡng) để đạt đến độ ẩm 65 ± 2% và đóng vào các bịch PP. Hấp thanh trùng bằng hơi nước nóng 100 o C trong 5 giờ.  Sau khi giá thể nguội, chúng tôi dùng giống trên môi trường hạt ngũ cốc để cấy vào các bịch giá thể mạt cưa cao su. Độ tuổi thích hợp nhất của giống là 13 – 14 ngày. Xác định hiệu suất sinh học nuôi trồng nấm Linh chi trên giá thể là tỷ lệ giữa trọng lượng thể quả tươi thu hoạch và trọng lượng cơ chất khô. Tiến hành đánh giá trọng lượng quả thể nấm được nuôi trên bịch PP chứa 180 gam cơ chất khô, trong điều kiện nuôi ở nhiệt độ 28 – 35 o C. 3.5. Xác định dƣợc chất có trong nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) 3.5.1. Phƣơng pháp định tính alcaloid [5] 3.5.1.1. Chuẩn bị dịch thử Để phát hiện sự hiện diện của alcaloid trong dược liệu người ta thường áp dụng nguyên tắc thử của Webb với cách thử gồm 2 phần như sau: - Phần 1: Bột nấm Linh Chi xay nhuyễn (10 – 20 gam) và dung dịch nước 1% H 2 SO 4 được cho vào erlen, đun nhẹ trong 1 giờ. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với cả 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff. 32 Quan sát kết tủa, nếu có kết tủa theo qui định là dương tính. Tuy nhiên, nếu không có kết tủa, chưa thể kết luận là không có alcaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm phần 2. - Phần 2: Bột xay nhuyễn (10 – 20 gam) ngâm trong dung dịch prollius là hổn hợp gồm: chloroform:ethanol 95 o :NH 4 OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (môi trường phải có tính baz). Ngâm nguội trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn. Lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn. Hòa tan cặn trong dung dịch HCl 1% đun ấm cho dễ tan. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff. 3.5.1.2. Thuốc thử định tính alcaloid - Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,36 gam HgCl 2 trong 60 ml nước cất và 5 gam KI trong 10 ml nước cất. Thu hỗn hợp 2 dung dịch này lại và thêm nước cất cho đủ 100 ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lưu ý vì tủa tạo thành có thể hòa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi ethanol có sẵn trong dung dịch thử. - Thuốc thử Dragendorff: Hòa tan 8 gam Nitrat bismuth Bi(NO 3 ) 3 trong 25 ml HNO 3 30% (D=1,18). Hòa tan 28 gam KI và 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất. Hỗn hợp 2 dung dịch này lại để yên trong tủ lạnh 5 o C sẽ thấy tủa màu sậm xuất hiện và tan trở lại, lọc và thêm nước cho đủ 100 ml. Dung dịch màu cam – đỏ được chứa trong chai màu nâu để che sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu vài tuần. Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu. 3.5.2. Phƣơng pháp xác định hợp chất saponin [5] Chiết 10 gam dược liệu với cồn 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc. Cô dịch lọc bốc hơi đến cắn khô. Dùng cắn để làm các phản ứng định tính. 3.5.2.1. Thử nghiệm tính tạo bọt Một đặc tính quan trọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong những phương pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin. Cách tiến hành: Hòa tan một lượng cắn tương ứng với 1 gam dược liệu vào 5 ml nước nóng. Lọc vào một ống nghiệm 1,6 – 16 cm và để nguội, thêm nước cho đủ 33 10 ml, dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút (khoảng 30 lần lắc). Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả: Bọt bền trong 15 phút: + Bọt bền trong 30 phút: ++ Bọt bền trong 60 phút: +++ 3.5.2.2. Thử nghiệm Fontan – Kaudel Lấy một lượng cắn tương ứng với 1 gam bột dược liệu, đun nóng nhẹ trên cách thủy để hòa tan với 10 ml nước. Chia đều vào 2 ống nghiệm. Ống 1: thêm 2 ml HCl 0.1N (pH =1) Ống 2: thêm 2 ml NaOH 0.1N (pH =13) Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm.  Nếu cột bọt trong cả 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau, thì sơ bộ xác định là có saponin triterpenoid.  Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, sơ bộ xác định là có saponin steroid. 3.5.3. Định tính triterpenoid (bằng phản ứng Liebermann – Burchard) Chiết 10 – 20 gam bột dược liệu bằng diethylether lắc trong bình nón, trong 10 – 20 phút, chiết cho tới khi dịch ether sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ, gộp các dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch chiết ether. Lấy 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hới tới cắn. Hòa tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào 1 ống nghiệm nhỏ khô, dùng pipet pasteur thêm cẩn thận 1 – 2 ml H 2 SO 4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiên cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím. Kết luận có triterpenoid 3.5.4. Định tính acid hữu cơ Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri Na 2 CO 3 . Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na 2 CO 3 thì kết luận là có acid hữu cơ. 34 3.6. Định lƣợng polysaccharides (GLPs) [16, 17] Polysaccharide có nhiều dạng và nhiều qui trình chiết khác nhau. Chiết GLPs ở 100 o C trong 16 giờ, cho năng suất ly trích cao, nhưng làm biến đổi cấu trúc sinh học các polysaccharides có trong nấm Linh chi. Một qui trình thứ hai được ứng dụng rộng rãi để chiết các GLPs ở nhiệt độ thấp, nhằm ổn định cấu trúc sinh học của các GLPs. Hình 3.1: Qui trình chiết suất polysaccharides từ nấm Linh chi (Yihuai Gao và ctv, 2001) Thu nhận cả 3 dịch chiết và đem đi lọc. Lấy phần cặn (dịch lơ lửng sau khi lọc) đem đi sấy khô và cân trọng lượng. Từ đó đánh giá hàm lượng polysaccharide thô có trong quả thể nấm Linh chi đen. Quả thể nấm Linh Chi Thái mỏng Hổn hợp chiết rút lần 1 Bã chiết lần 1 Hỗn hợp chiết rút lần 2 Bã chiết lần 2 Dịch chiết lần 3 Dịch chiết lần 1 Dịch chiết lần 2 -Ngâm nước 70 o C trong 3 giờ -Ngâm trong nước 70 o C trong 3 giờ -Ngâm trong cồn 80% ở 70 o C trong 2 giờ 35 3.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý thống kê và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Excell. Tốc độ sinh trưởng trung bình của hệ sợi nấm trên các môi trường được tính như sau: X i = (x 1 + x 2 + x 3 + … + x i )/n i Với: - x i : Tốc độ sinh trưởng trên các môi trường (cm/ngày) - n i : Số quan sát Sử dụng phần mềm Statgraphics Ver. 7.0 để so sánh sự khác biệt về tốc độ tăng trưởng hệ sợi nấm trên các nghiệm thức thí nghiệm ở mức α = 0,05 hay LSD (95%) (Least Significant Difference). 36 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1. Quan sát hình thái giải phẩu nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) 4.1.1. Hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum Hình 4.1: Hình thái sợi nấm Linh chi đen (vật kính x100) 4.1.2. Cấu trúc bào tử nấm Amauroderma subresinosum Dựa vào khoá phân loại của các tác giả Humphrey (1938), Imazeki (1952), Steyaert (1972), Corner (1983), chúng tôi đã xác định loài nấm Linh chi đen có ở vùng núi Chứa Chan - Đồng Nai thuộc loài Amauroderma subresinosum. Quả thể nấm có cuống ngắn, đính bên hoặc có gốc đính ở bên hình nửa tròn hay hình quạt, màu đen nhẵn bóng. Đôi khi có vài mũ nhỏ phát triển chung từ một gốc chung. Mặt trên vỏ cứng màu đen bóng, có nhiều nếp nhăn đồng tâm. Mép mũ nấm thường dày, uốn lượng cong vào có các nếp gấp và các khía răng cưa. Bào tử đảm (Basidiospores) có màu nâu quế, hình trứng. Bào tử có cấu trúc lớp vỏ kép, bên trong chứa dịch trong suốt, hình dạng giống giọt dầu và kích thước bào tử dao động khá lớn 12 – 20 x 8 – 12 µm. Hình 4.2: Cấu trúc bào tử nấm Amauroderma s ubresinosum (vật kính x100) 37 4.1.3. Hình thái quả thể nấm Amauroderma subresinosum Mặt trên quả thể nấm Mặt dưới quả thể nấm Hình 4.3: Hình thái quả thể nấm Amauroderma subresinosum đƣợc nuôi trồng Quả thể nấm Amauroderma subresinosum có dạng hình quạt hay gần tròn hoặc ít nhiều dị dạng. Ở giai đoạn mầm nấm có dạng hình tròn, màu trắng. Sau khoảng 20 – 25 ngày, mầm nấm hình tròn chuyển sang hình quạt và lớp sắc tố nâu – đen bắt đầu hình thành xung quanh cuống nấm. Phía ngoài cùng rìa của quả thể nấm có màu trắng - đục, dày và sau khoảng 30 -40 ngày tiếp theo thì lớp rìa trắng chuyển sang màu đen - quế, lúc này quả thể đã già. Trên mặt mũ nấm có vân gợn đồng tâm và những rãnh nhỏ lồi lõm nhấp nhô không đồng nhất. Mũ nấm rộng 6 – 12 cm, dày 1 – 2 cm, đôi khi có vài mũ nhỏ phát triển từ 1 gốc chung. Mặt trên mũ có lớp vỏ cứng màu đen bóng, gồ lên trên, láng bóng như verni. Mép mũ thường dày, uốn lượng cong vào có các nếp gấp và các khía răng cưa. Bề mặt trên quả thể màu nâu quế, màu gỗ sẫm, nâu sẫm. Mặt dưới quả thể nấm là lớp bào tầng chứa rất nhiều lỗ nhỏ, màu trắng đục và dày cỡ 4 – 6 ống/mm. Chính những lỗ nhỏ này là nơi phóng thích bào tử khi quả thể trưởng thành. 4.2. Sự sinh trƣởng và phát triển nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) 4.2.1. Tốc độ sinh trƣởng hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên các môi trƣờng thạch Trên môi trường thạch, hệ sợi nấm Linh chi đen phát triển dưới dạng hình rễ khá sớm và tốc độ tương đối nhanh. Trong quá trình theo dõi sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Linh chi đen, chúng tôi nhận thấy trong 2 ngày đầu hệ sợi tăng trưởng rất chậm. Sau 3 ngày thì trên môi trường PGA và PGA bổ sung đều xuất hiện lớp sắc tố màu đỏ - nâu được nấm tiết ra ở gốc cấy ban đầu và lan dần đều ra xung quanh bề mặt thạch. Thời gian xuất hiện lớp sắc tố trên môi trường Mizuno là khoảng 5 ngày. Xung quanh 38 rìa khuẩn lạc là hệ sợi nấm đang tăng trưởng, màu trắng - đục và phía bên trong rìa khuẩn lạc có màu đỏ - nâu. Trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau, tốc độ tăng trưởng của sợi nấm Linh chi đen khác nhau. Tốc độ tăng trưởng sợi nấm trên môi trường Mizuno rất chậm, sau 8 ngày hệ sợi nấm phủ kín mặt thạch đĩa petri. Ngược lại trên môi trường PGA thì tốc độ lan rất nhanh và sau 4 ngày đa số sợi nấm đã phủ kín mặt thạch đĩa petri. Mặt khác mật độ hệ sợi nấm trên môi trường PGA và Mizuno rất nhiều, hệ sợi phân nhánh, nhô lên bề mặt thạch. Trên môi trường Czapek – Dox thì hệ sợi nấm rất mỏng manh, không phân nhánh, phát triển tương đối nhanh và chỉ sau 6 ngày hệ sợi nấm phủ kín mặt thạch đĩa petri. PGA Mizuno Czapek - Dox PGA+10% cà rốt Hình 4.4: Hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên các môi trƣờng thạch Bảng 4.1: Tốc độ sinh trƣởng của hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên các môi trƣờng thạch Môi trường Thời gian (ngày) Đường kính colonie (cm) PGA 2 4 2,418 ± 0,151 6,441 ± 0,18 PGA + 10% nước dừa già 2 4 2,732 ± 0,168 6,832 ± 0,19 PGA + 10% dịch chiết nước cà rốt 2 4 2,9 ± 0,227 7,823 ± 0,156 39 Mizuno 2 4 1,673 ± 0,072 3,164 ± 0,107 Czapek - Dox 2 4 2,268 ± 0,113 5,46 ± 0,174 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 cm/ngày Ngày thứ 2 Ngày thứ 4 Biểu đồ 1: Sự sinh trƣởng hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên các môi trƣờng thạch Sử dụng phần mềm Statgraphics Ver. 7.0 so sánh sự khác biệt tốc độ sinh trưởng hệ sợi giữa các môi trường trong thí nghiệm với mức ý nghĩa α = 0,05 hay LSD (95%) cho thấy tốc độ sinh trưởng sợi nấm trên các môi trường là khác nhau. Trong quá trình khảo sát nhận thấy tốc độ sinh trưởng hệ sợi ở môi trường 3 là cao nhất, môi trường 4 là chậm nhất. 4.2.2. Sự sinh trƣởng hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên môi trƣờng nhân giống Trên môi trường nhân giống, hệ sợi nấm Linh chi đen lan sâu vào khối cơ chất trong ống nghiệm với tốc độ tương đối chậm nhưng đồng đều mọi phía. Lúc còn non sợi nấm có màu trắng đục, sau 12 – 13 ngày hệ sợi lan hết khối cơ chất trong ống nghiệm. Mật độ hệ sợi tăng dần theo thời gian. Trong quá trình sinh trưởng hệ sợi nấm, thấy xuất hiện những đốm sắc tố màu đen – nâu ở bề mặt ngoài ống nghiệm. Tốc độ lan hệ sợi nấm đo được trong ống nghiệm chứa 2/3 khối cơ chất thể hiện trong bảng 4.2. 40 Bảng 4.2: Tốc độ lan sâu của hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên môi trƣờng nhân giống Thờigian (ngày) Tốc độ lan sâu xuống đáy ống nghiệm (cm) MT1 MT2 MT3 MT4 6 4,818 ± 0,199 5,372 ± 0,127 3,964 ± 0,169 4,782 ± 0,209 9 7,95 ± 0,165 8,745 ± 0,246 7,01 ± 0,191 7,827 ± 0,22 12 11,4 ± 0,167 11,782 ± 0,232 10,309 ± 0,197 10,845 ± 0,163 0 2 4 6 8 10 12 14 MT1 MT2 MT3 MT4 cm/ngày Ngày 6 Ngày 9 Ngày 12 Biểu đồ 2: Tốc độ lan sâu hệ sợi nấm Linh chi đen trên các môi trƣờng nhân giống Nhận xét: Tốc độ lan sâu hệ sợi nấm trên các môi trường nhân giống là khác nhau về mặc thống kê học với mức ý nghĩa α= 0,05. Riêng ở môi trường 1 và 4 là không có sự khác biệt về mặt thống kê học. Tốc độ lan sâu hệ sợi nấm trên môi trường 2 là nhanh nhất và ở môi trường 3 là chậm nhất. . Phần 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4. 1. Quan sát hình thái giải phẩu nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) 4. 1.1. Hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum Hình 4. 1: Hình thái sợi nấm Linh chi đen. thể nấm Linh chi đen. Quả thể nấm Linh Chi Thái mỏng Hổn hợp chi t rút lần 1 Bã chi t lần 1 Hỗn hợp chi t rút lần 2 Bã chi t lần 2 Dịch chi t lần 3 Dịch chi t lần 1 Dịch chi t. triển nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) 4. 2.1. Tốc độ sinh trƣởng hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên các môi trƣờng thạch Trên môi trường thạch, hệ sợi nấm Linh chi đen phát