Ngày nay xu hướng sử dụng các thảo dược thiên nhiên để trị bệnh đã trở nên phổ biến, việc tìm kiếm những khả năng chữa trị từ các loại thảo dược đã được tiến hành ở nhiều nơi trên thế giới: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan, ….Trong đó, nấm Linh chi là đối tượng nghiên cứu của nhiều quốc gia. Đặc biệt là các nước vùng Châu Á, vì nó có nhiều tiềm năng về nguồn dược liệu.
Trang 1LỜI CẢM TẠ
Con xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, người đã hết lòng dưỡng dục để cho con có được ngày hôm nay
Xin chân thành cảm ơn!
Ban Giám hiệu, quí Thầy Cô trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho Tôi trong suốt thời gian học tập
Tất cả các Thầy Cô Bộ môn Công Nghệ Sinh học trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức quí báu trong suốt quá trình học tập, cũng như tạo điều kiện tốt cho Tôi thực hiện đề tài
Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Cổ Đức Trọng và Cô Phan Thị Nhiều đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn Tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này
Xin chân thành cảm ơn Cô Nguyễn Thị Dung và Thầy Lưu Phúc Lợi đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá luận tốt nghiệp
Cuối cùng, xin gởi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh học trường Đại học Nông Lâm, những người động viên Tôi và chia sẻ vui buồn trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài
Thành Phố Hồ Chí Minh, Ngày 15 tháng 8 năm 2005
Sinh Viên Nguyễn Minh Khang
Trang 2TÓM TẮT
NGUYỄN MINH KHANG, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng
8/2005 “KHẢO SÁT SINH TRƯỞNG NẤM LINH CHI ĐEN (Amauroderma subresinosum, Corner) PHÁT HIỆN TẠI VÙNG NÚI CHỨA CHAN - VIỆT
NAM”
Giáo viên hướng dẫn: ThS CỔ ĐỨC TRỌNG
Đề tài được thực hiện trên đối tượng là nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum), được thu hái từ tự nhiên ở vùng Núi Chứa Chan thuộc tỉnh Đồng Nai
-Việt Nam Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi đen
(Amauroderma subresinosum) trên các môi trường khác nhau, với mục đích tìm được
môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển
Những kết quả đạt được:
- Môi trường nhân giống cấp 1 phù hợp: PGA + 10% dịch chiết cà rốt
- Môi trường nhân giống cấp 2 phù hợp: 50% lúa + 25% mạt cưa + 25% cám gạo
- Môi trường lỏng PG sợi nấm phát triển tốt
- Môi trường sản xuất có hiệu suất cao: Mạt cưa cao su + 5o/oo SA + 2,5o/oo
DAP
- Định tính sơ bộ thành phần hoạt chất sinh học có trong hệ sợi và quả thể nấm Linh chi đen: Saponin, Saponin steroid, triterpenoid, acid béo và hàm lượng polysaccharide thô có trong quả thể nấm Linh chi đen khoảng 1%
iiv
Trang 3MỤC LỤC
Trang tựa
Cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Mục lục v
Danh sách các bảng ix
Danh sách các hình x
Danh sách các biểu đồ xi
1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích của đề tài 2
1.3 Yêu cầu 2
1.4 Hạn chế 2
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nấm trồng 3
2.1.1 Khái quát về nấm và hình thái học 3
2.1.1.1 Khái quát về nấm 3
2.1.1.2 Hình thái học sợi nấm 4
2.1.1.3 Hình thái học quả thể nấm 5
2.1.2 Sinh lý và biến dưỡng nấm 5
2.1.2.1 Biến dưỡng của sợi nấm 5
2.1.2.2 Sự sinh trưởng của sợi nấm 6
2.1.3 Các giai đoạn phát triển nấm 8
2.1.3.1 Giai đoạn sinh trưởng 8
2.1.3.2 Giai đoạn phát triển 9
2.2 Nấm Linh chi 9
2.2.1 Khái quát chung 9
2.2.2 Vị trí phân loại 10
2.2.3 Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Linh chi 10
Trang 42.2.3.1 Đặc điểm hình thái của nấm Amauroderma subresinosum 10
2.2.3.2 Chu trình sống sống của nấm Linh chi 11
2.2.4 Điều kiện sống của nấm Linh chi 12
2.3 Nguyên liệu trồng nấm 12
2.4 Thành phần hóa học và đặc tính dược lý của nấm Linh chi 14
2.5 Khả năng chữa bệnh của nấm Linh chi 17
2.6 Giới thiệu sơ lược về hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi 20
2.6.1 Ganoderma polysaccharides (GLPs) 20
2.6.2 Ganoderic Acid 21
2.6.3 Ganoderma Adenosin 22
2.6.4 Alcaloid 22
2.6.4.1 Định nghĩa 22
2.6.4.2 Tính chất 22
2.6.4.3 Công dụng 23
2.6.5 Hợp chất Saponin 23
2.6.5.1 Khái niệm chung về Saponin 23
2.6.5.2 Công dụng 24
2.6.6 Germanium hữu cơ 24
2.7 Phương pháp ổn định dược liệu 24
2.7.1 Chuẩn bị dịch chiết 25
2.7.2 Phương pháp ngâm 25
3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 26
3.2 Đối tượng thí nghiệm 26
3.3 Vật liệu thí nghiệm 26
3.3.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 26
3.3.2 Hóa chất 26
3.3.3 Môi trường nuôi cấy 26
3.3.3.1 Môi trường dinh dưỡng 26
3.3.3.2 Môi trường nhân giống 28
3.3.3.3 Môi trường mạt cưa cao su 28
3.4 Phương pháp thí nghiệm 28
ivi
Trang 53.4.1 Quan sát hình thái quả thể nấm Linh chi đen (Amauroderma
subresinosum) 28
3.4.1.1 Hình thái quả thể nấm Linh chi đen 28
3.4.1.2 Phương pháp quan sát hệ sợi nấm Linh chi đen 28
3.4.1.3 Phương pháp quan sát bào tử nấm Linh chi đen 28
3.4.2 Khảo sát sinh trưởng sợi nấm Linh chi đen trên môi trường thạch…28 3.4.3 Nghiên cứu quá trình lên men dịch thể 29
3.4.4 Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen trên môi trường nhân giống 30
3.4.5 Khảo sát sinh trưởng và phát triển nấm Linh chi đen trên môi trường mạt cưa cao su 30
3.5 Xác định dược chất có trong nấm Linh chi đen 31
3.5.1 Phương pháp định tính Alcaloid 31
3.5.1.1 Chuẩn bị dịch thử 31
3.5.1.2 Thuốc thử định tính alcaloid 32
3.5.2 Phương pháp xác định hợp chất Saponin 32
3.5.2.1 Thử nghiệm tính tạo bọt 32
3.5.2.2 Thử nghiệm Fontan – Kaudel 33
3.5.3 Định tính Triterpenoid (bằng phản ứng Liebermann - Burchard) 33
3.5.4 Định tính acid hữu cơ 33
3.6 Định lượng polysarcharide (GLPs) 34
3.7 Phương pháp xử lý số liệu 35
4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Quan sát hình thái nấm Amauroderma subresinosum 36
4.1.1 Hệ sợi nấm Amauroderma subresinoum 36
4.1.2 Cấu trúc bào tử nấm Amauroderma subresinosum 36
4.1.3 Hình thái quả thể nấm Amauroderma subresinosum 37
4.2 Sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) ……….38
4.2.1 Tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen trên các môi trường thạch……….38
Trang 64.2.2 Sự sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen trên môi trường nhân giống
……… 40
4.2.3 Sự sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen trên môi trường lỏng 42
4.2.4 Sự sinh trưởng và phát triển nấm Linh chi đen trên môi trường mạt cưa cao su 43
4.2.4.1 Giai đoạn sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen 45
4.2.4.2 Giai đoạn phát triển quả thể nấm Linh chi đen 46
4.2.4.3 Đánh giá hiệu suất sinh học trồng nấm Linh chi đen 48
4.3 Xác định dược chất có trong hệ sợi và quả thể nấm Linh chi đen 49
4.3.1 Định tính Alcaloid 49
4.3.2 Định tính Saponin 51
4.3.2.1 Thử nghiệm tính tạo bọt 51
4.3.2.2 Thử nghiệm Fontan – Kaudel 51
4.3.3 Định tính Triterpenoid 52
4.3.4 Định tính acid hữu cơ 52
4.3.5 Định lượng polysaccharide từ quả thể nấm Linh chi đen 53
5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 54
5.2 Đề nghị 54
6 TÀI LIỆU THAM KHẢO
7 PHỤ LỤC
i viii
Trang 7DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng
2.1 Nồng độ một số dạng muối khoáng cần cho nấm trồng 7
Bảng 2.2 Điều kiện môi trường cần thiết cho sự phát triển nấm Linh chi 12
Bảng 2.3 Hàm lượng các chất có trong mùn cưa 12
Bảng 2.4 Thành phần dinh dưỡng trong cám 13
Bảng 2.5 Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi 15
Bảng 2.6 Lục bảo Linh chi và tác dụng trị liệu 18
Bảng 2.7 Một số bài thuốc chữa bệnh của nấm Linh chi 20
Bảng 2.8 Các hoạt chất Triterpenoid có tác dụng trị bệnh trong nấm Linh chi 21
Bảng 4.1 Tốc độ tăng trưởng của hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên các môi trường thạch 39
Bảng 4.2 Tốc độ lan sâu hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên môi trường nhân giống 41
Bảng 4.3 Khả năng tích lũy sinh khối hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum trên môi trường lỏng 42
Bảng 4.4 Hiệu suất sinh học đạt được trên các môi trường mạt cưa cao su 48
Trang 8DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Thành phấn cấu tạo nấm Amauroderma subresinosum 11
Hình 2.2 Chu trình phát triển của nấm Linh chi 11
Hình 3.1 Qui trình chiết suất polysaccharide (GLPs) 34
Hình 4.1 Hình thái hệ sợi nấm Amauroderma subresinosum (vật kính x100) 36
Hình 4.2 Cấu trúc bào tử nấm Amauroderma subresinosum (vật kính x100) 37
Hình 4.3 Hình thái quả thể nấm Amauroderma subresinosum 37
Hình 4.4 Hệ sợi nấm Linh chi đen trên các môi trường thạch 39
Hình 4.5 Sự sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen trên môi trường nhân giống 42
Hình 4.6 Sinh khối hệ sợi nấm Linh chi đen trên môi trường lỏng PG 43
Hình 4.7 Qui trình nuôi trồng nấm Linh chi 44
Hình 4.8 Bố trí thí nghiệm 45
Hình 4.9 Quá trình hình thành và tăng trưởng quả thể nấm Linh chi đen 47
Hình 4.10 Quả thể nấm Linh chi đen sau 120 ngày 49
Hình 4.11 Kết quả nuôi trồng nấm Linh chi đen 49
Hình 4.12 Định tính Alcaloid với thuốc thử Mayer 50
Hình 4.13 Định tính Alcaloid với thuốc thử Dragendorff 50
Hình 4.14 Thử nghiệm tính tạo bọt từ sinh khối nấm Linh chi đen 51
ix
Trang 9Hình 4.15 Thử nghiệm Saponin toàn phần theo Fontan – Kaudel ở sinh khối
nấm Linh chi đen 52
Hình 4.16 Định tính Triterpenoid bằng phản ứng Liebermann – Burchard 52
Hình 4.17 Định tính acid hữu cơ có trong quả thể nấm Linh chi đen 53
Hình 4.18 Sản phẩm bột polysaccharide thô từ quả thể nấm Linh chi đen 53
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 1 Sự sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen trên các môi trường thạch………40
Biểu đồ 2 Tốc độ lan sâu hệ sợi nấm Linh chi đen trên môi trường nhân giống…….41
Biểu đồ 3 Sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen trên môi trường lỏng PG….………42
Biểu đồ 4 Tỷ lệ sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi đen trên môi trường mạt cưa cao su ………46
Biểu đồ 5 Hiệu suất sinh học nuôi trồng nấm Linh chi đen ……….48
Trang 10i xii