Phát hiện một số gen độc lực của E.Coli phân lập được từ phân và thịt bò, heo bằng kỹ thuật multiplex-PRC

Đề tài hy vọng trở thành cơ sở để áp dụng kỹ thuật multiplex - PCR trong việc phát hiện các gen độc lực của E.Coli trong chẩn đoán bệnh và đánh giá tình trạng vệ sinh thực phẩm.

Trang 1

Download» Agriviet.com

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Escherichia coli (E coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế nhất

trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật Tuy nhiên, khi có điều

kiện thích hợp, một số nhóm E coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên

nhân quan trọng gây tiêu chảy trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non (tiêu chảy trên bê nghé, tiêu chảy phân trắng ở heo con theo mẹ, tiêu chảy phù thủng trên heo cai sữa)

E coli được thải qua phân ra môi trường bên ngoài Nếu qui trình vệ sinh kém thì E coli dễ vấy nhiễm vào thịt tươi, đặc biệt là trong quá trình giết mổ Từ

đó nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm không thích hợp thì ngộ độc thực

phẩm do E coli hoàn toàn có thể xảy ra Trong số các tác nhân gây tiêu chảy ở người thì E coli luôn là tác nhân phổ biến nhất ở những nước công nghiệp phát triển lẫn những nước đang phát triển Do đó E coli được xem là vi khuẩn chỉ danh

ô nhiễm thực phẩm và nước được đánh giá dựa trên số lượng của chúng

Dựa trên đặc điểm gây bệnh, E coli được chia thành nhiều nhóm Mỗi

nhóm đều có những yếu tố độc lực khác nhau được qui định bởi những gen độc

lực Một số gen độc lực quan trọng của E coli gồm: gen stx1, stx2, stx2e, hly của nhóm STEC (Shiga toxin-producing E coli); gen eae của nhóm STEC và EPEC (Enteropathogenic E coli); gen sta, stb, lt-I của nhóm ETEC (Enterotoxigenic E coli )…

E coli là vi khuẩn bình thường ở đường ruột và cũng thường có mặt trong thực phẩm nên việc phân lập được vi khuẩn E coli trong phân để tìm nguyên

nhân gây bệnh hay xác định được số lượng vi khuẩn trong thực phẩm hoàn toàn không phản ánh được khả năng gây độc của chúng Do vậy việc xác định các gen

Trang 2

độc lực của E coli là một bước rất cần thiết phục vụ cho việc đánh giá nguy cơ

gây bệnh trên vật nuôi và con người Các kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật PCR thường được áp dụng để phát hiện các gen độc lực này

Cho đến nay, ở Việt Nam việc xác định E coli là nguyên nhân gây bệnh

thường chỉ thực hiện bằng kỹ thuật phân lập và xác định các đặc tính sinh hóa, và theo Tiêu chuẩn Việt Nam, đánh giá tình trạng vệ sinh thực phẩm hiện chỉ dừng lại ở mức độ xác định số lượng vi khuẩn, việc phát hiện những gen độc lực của vi khuẩn chưa được quan tâm Hơn nữa việc ứng dụng kỹ thuật multiplex - PCR để

phát hiện đồng thời các yếu tố độc lực của E coli chưa được thực hiện ở Việt

Nam Với mục tiêu phát hiện một số gen độc lực mã hóa các protein gây độc của

E coli phân lập được từ phân và thịt bò, heo bằng kỹ thuật multiplex – PCR, được

sự hướng dẫn của Thầy Nguyễn Ngọc Tuân, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Phát hiện một số gen độc lực của E coli phân lập được từ phân và thịt bò,

heo bằng kỹ thuật multiplex - PCR”

Bước đầu áp dụng kỹ thuật này, chúng tôi lần lượt thực hiện khảo sát trên các nhóm đối tượng mẫu phân tiêu chảy, phân bình thường, và thịt tươi Đề tài hy vọng trở thành cơ sở để áp dụng kỹ thuật multiplex – PCR trong việc phát hiện

các gen độc lực của vi khuẩn E coli trong chẩn đoán bệnh và đánh giá tình trạng

vệ sinh thực phẩm

Yêu cầu:

- E coli được phân lập định lượng theo qui trình của FAO (1992) và phân

lập định tính bằng môi trường chọn lọc MacConkey đối với mẫu phân hoặc bằng môi trường tăng sinh chọn lọc CT-SMAC (Sorbitol MacConkey với kháng sinh cefixime và tellurite potassium) đối với mẫu thịt

- Ly trích DNA từ vi khuẩn E coli phân lập được;

- Phát hiện một số gen độc lực (eae, hly, stx1, stx2, stx2e, sta, stb, lt-I) của

Trang 3

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Vi khuẩn E coli

2.1.1 Định nghĩa

Vi khuẩn Escherichia coli được phân lập và mô tả đầu tiên vào năm 1885

bởi nhà nghiên cứu người Đức Theodor Escherich

Theo hệ thống phân loại của Bergey, vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia

E coli là trực khuẩn Gram âm, di động, kích thước khoảng 2 – 3 x 0,5 μm, không hình thành bào tử và có giáp mô E coli có mặt thường xuyên và chiếm ưu

thế trong ruột của người và động vật máu nóng, ở phần cuối của ruột non và ở ruột già

2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa

E coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp là

35 - 370C, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu nhất là 7,2 – 7,4)

Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ E coli làm đục nhẹ môi trường, càng

để lâu càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi trường

E coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành

những khuẩn lạc dạng S màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt bóng, kích thước khoảng 2 – 3 mm

Trên môi trường thạch EMB: E coli cho khuẩn lạc tím ánh kim

Trên môi trường thạch MacConkey: E coli cho khuẩn lạc đỏ hồng

Trên môi trường thạch nghiêng TSI: E coli tạo acid / acid (vàng / vàng)

Trang 4

Để phân biệt E coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng thử nghiệm IMVC E coli cho kết quả IMVC là + + − − (biotype 1) hoặc − + − −

(biotype 2)

2.1.3 Yếu tố kháng nguyên

E coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp Trước kia, kỹ thuật xác định kháng nguyên bề mặt là phương tiện chính để phân biệt các dòng E coli gây

bệnh Năm 1947, Kauffmann đưa ra hệ thống phân nhóm serotype mà vẫn còn được sử dụng đến ngày nay Hệ thống phân nhóm này dựa vào việc xác định kháng nguyên bề mặt O, H, K

* Kháng nguyên thân O (somatic antigen): có bản chất là

lipopolysaccharide của màng ngoài tế bào, bền với nhiệt và cồn Khi đun nóng ở

1000C trong 2 giờ vẫn giữ được tính kháng nguyên Kháng nguyên O có thể được phát hiện bằng phản ứng ngưng kết Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng

loài vật chủ Kháng nguyên O tạo nền tảng cho việc phân loại serogroup của E coli Có hơn 170 serogroup kháng nguyên O Trong mỗi serogroup có 1 hay nhiều

serotype được phân loại dựa vào kháng nguyên lông H

* Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có bản chất là protein, tạo nên khả năng di động của E coli, kém chịu nhiệt Có khoảng 56 type kháng nguyên H

* Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): Kháng nguyên K lúc đầu

được xác định bằng phản ứng ngưng kết Người ta xác định có sự hiện diện của kháng nguyên K ở vi khuẩn nếu vi khuẩn chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh O khi bị đun nóng Dựa vào khả năng chịu nhiệt người ta chia kháng nguyên K thành

3 type là A, L và B Về sau người ta phân loại kháng nguyên K dựa vào thành phần hóa học của chúng và đã có hơn 80 type kháng nguyên K đã được xác định

Một vài E coli, đặc biệt là E coli tiết độc tố ruột có những lông bám

Trang 5

huyết thanh học Một vài lông bám kháng mannose này (ví dụ như K88 và K89) đã từng được coi là kháng nguyên K Về sau, khi xác định được thành phần hóa học của những lông bám này có bản chất là protein nên việc xếp chúng vào kháng nguyên K không còn phù hợp, chúng được xếp vào nhóm kháng nguyên tiêm mao F

* Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): Tiêm mao (fimbriae) dài

khoảng 4μm, đường kính 2,1 – 7,0 nm, dạng thẳng hay xoắn Tiêm mao không tham gia vào sự di chuyển, ngắn hơn và nhiều hơn flagella Tiêm mao giúp vi khuẩn kết dính vào tế bào niêm mao ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn

Hiện nay có hơn 700 type kháng nguyên hay serotype của E coli từ sự tổ hợp của các nhóm kháng nguyên O, H, K, F Tuy nhiên nói chung, chỉ những E coli ngoài đường ruột mới không có capsul (Jann và Jann, 1992), do đó đối với những E coli gây tiêu chảy, thường thì việc xác định serotype chỉ là sự kết hợp

đặc hiệu giữa kháng nguyên O và kháng nguyên H

2.1.4 Phân loại E coli

Mặc dù E coli là vi khuẩn cộng sinh vô hại trong đường ruột Tuy nhiên

trong một điều kiện thuận lợi, giống như hầu hết các tác nhân gây bệnh trên

màng nhầy, E coli có các yếu tố cần thiết để gây bệnh gồm (1) cư trú trên màng

nhầy, (2) kháng được sự phòng vệ của vật chủ, (3) nhân lên, và (4) gây tổn hại

vật chủ Đặc tính quan trọng nhất của dòng E coli gây tiêu chảy là khả năng cư

trú trên màng nhầy ruột bất chấp nhu động ruột và sự cạnh tranh dinh dưỡng của

hệ vi sinh vật bình thường ở ruột (gồm cả những dòng E coli khác) Sự hiện diện của những lông bám là một đặc điểm của hầu hết các dòng E coli, cả ở những dòng E coli không gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998) Tuy nhiên những dòng E coli gây tiêu chảy có những kháng nguyên lông đặc hiệu giúp E coli có thể bám

dính vào màng nhầy ruột non mặc dù đây không phải là vị trí cư trú bình thường

Trang 6

của E coli (Levine và ctv, 1984) Một khi sự cư trú đã được thiết lập, việc gây bệnh của các dòng E coli gây tiêu chảy rất đa dạng Dựa trên đặc điểm gây

bệnh (gồm các đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng nhầy ruột, hội

chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh), E coli được

chia thành 5 nhóm chính:

- STEC (Shiga toxin-producing E coli) hoặc VTEC (Verotoxigenic E coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E coli)

- EPEC (Enteropathogenic E coli)

- ETEC (Enterotoxigenic E coli)

- EAggEC hay EAEC (Enteroaggregative E coli)

- EIEC (Enteroinvasive E coli)

Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E coli:

(1) Sản xuất độc tố (ETEC, EAEC, STEC) (2) Tấn công / xâm lấn (EIEC)

(3) Bám dính, truyền tín hiệu qua màng (EPEC và EHEC) Tuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thể vật chủ và màng nhầy ruột thì đặc hiệu cho mỗi loại (Nataro và Kaper, 1998)

2.1.5 Shiga toxigenic E coli (STEC)

2.1.5.1 Thuật ngữ: Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra

những thuật ngữ khác nhau để gọi tên cho nhóm E coli này Tên gọi Verotoxigenic E coli (VTEC) được Konowalchuk và ctv (1977) đặt cho nhóm

này khi phát hiện việc sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào Vero Tên gọi

Enterohaemorrhagic E coli (EHEC) là do dòng này gây viêm kết tràng xuất

huyết (HC) và hội chứng huyết niệu (HUS) (Nataro và Kaper, 1989) Và thuật

ngữ Shiga producing E coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga-like produccing E coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sản sinh độc tố gây độc tế bào giống

Trang 7

toxin-Download» Agriviet.com

STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau, và cả hai đều chỉ ra

rằng nhóm E coli sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào Mặc dù

vậy không phải chỉ cần có gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có

các yếu tố độc lực khác Những dòng E coli mang gen sinh độc tố cũng hiện diện

trong ruột gia súc khỏe mạnh với một số lượng rất ít, nhưng những dòng này thiếu một vài hay tất cả những yếu tố độc lực khác của STEC (Beutin và ctv, 1994) Do đó không phải tất cả STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998)

2.1.5.2 Shiga toxin và những yếu tố độc lực liên quan đến đặc tính gây bệnh của STEC: STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt), còn gọi là Shiga

toxin (Stx) hay Verotoxin (VT) Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2 Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất thay đổi về trình tự, tạo ra nhiều subtype như Stx2c, Stx2hb, Stx2e (Calderwood và ctv, 1996), Stx2g (Leung và ctv, 2003) Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1, Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, và thậm chí nhiều dạng của Stx2

Cả hai độc tố Stx1 và Stx2 đều được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị B 7,7 kDa và

1 tiểu đơn vị A 32 kDa Tiểu đơn vị A gồm peptide A1 28 kDa và peptide A2 4 kDa nối với nhau bằng cầu nối disulfur Peptide A1 có hoạt tính enzyme và peptide A2 có nhiệm vụ gắn kết tiểu đơn vị A vào những tiểu đơn vị B Những tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp với receptor đặc hiệu Gb3

(globotriaosylceramide) hiện diện trên bề mặt của những tế bào eukaryote (Stx2e có receptor là Gb4) Sau khi được chuyển vào bên trong tế bào, tiểu đơn vị A đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome Peptide A1 có hoạt tính enzyme hoạt động như một N-glycosidase cắt một gốc adenin khỏi rRNA 28S của ribosome, do đó gây trở ngại cho sự tổng hợp protein Do không tổng hợp được protein, những tế bào bị Stx tác động (tế bào nội mô của thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào Hela hay bất cứ tế bào nào có receptor là Gb3, receptor

Gb4 đối với Stx2e) sẽ chết Hậu quả gây độc cho tế bào ruột do Stx và các yếu tố

Trang 8

độc lực khác của STEC là gây sự hư hại những tế bào nhung mao ruột, gây tiêu chảy và viêm kết tràng xuất huyết (Haemorrhagic colitis – HC) Sự hư hại những tế bào thành mạch máu do Stx2e sẽ gây nên hiện tượng phù thủng ở heo Những tổn thương ở tế bào nội mô thận gây nên hội chứng huyết niệu (Haemolytic uraemic syndrome - HUS) ở người

Yếu tố bám dính của STEC/EHEC đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong sự định vị vi khuẩn ở ruột Đó chính là intimin, một protein

màng ngoài có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa Intimin được mã hóa bởi gen eae (E coli attaching and effacing) Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy

(attaching-and-effacing, A/E) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu

mô (Donnerberg và ctv, 1993) Gen eae này cũng được tìm thấy ở nhóm EPEC Gen eae gây kiểu tổn thương A/E là một trong số các gen nằm trên vùng gây

bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư hại tế bào ruột – locus of enterocyte effacement, LEE) Vùng LEE của STEC/EHEC chứa những gen mã hóa cho intimin, mã hóa receptor của intimin Tir (translocated intimin receptor) và một số gen khác Vùng LEE không chỉ là điều kiện cần mà còn là điều kiện đủ cho việc

hình thành tổn thương A/E Tuy nhiên không phải tất cả STEC đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có gen eae (Nataro và Kaper, 1998)

Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác giữa protein màng ngoài của vi khuẩn (intimin) và protein Tir Protein Tir được tiết ra khỏi vi khuẩn, chuyển vị vào màng của tế bào vật chủ (Paton và ctv, 1996)

Yếu tố khác có liên quan đến độc lực của STEC là việc tạo ra enterohaemolysin (EHEC-Hly) và có thể cả độc tố ruột chịu nhiệt EAST1

EHEC-Hly được mã hóa bởi gen trên plasmid 60 MDa (pO157) mà plasmid này được tìm thấy ở gần như tất cả các dòng O157:H7 và cũng khá phổ biến cả những dòng STEC non-O157 nữa (Nataro và Kaper, 1998) Trên plasmid

Trang 9

này có sự hiện diện của một operon gồm 4 khung đọc mở (open reading frame -

ORF) là hlyCABD Trong đó hlyA là gen cấu trúc khởi đầu cho haemolysin

Độc tố ruột chịu nhiệt EAST1 (đầu tiên được mô tả ở nhóm EAEC là EAEC heat-stable enterotoxin 1), cũng được tìm thấy ở nhiều dòng STEC Tầm quan trọng của EAST1 đối với khả năng gây bệnh của STEC vẫn chưa được biết, nhưng nó có ở một vài trường hợp tiêu chảy không có máu mà thường thấy ở những người nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998)

Hầu hết các ổ dịch của STEC/EHEC là do O157:H7, nên người ta cho rằng có thể serotype này độc hơn và dễ lây truyền hơn những serotype khác (Nataro và Kaper, 1998) Tuy nhiên cũng có nhiều serotype khác ngoài O157:H7 có liên quan đến HC và HUS trên người Những serotype non-O157 phổ biến nhất liên quan đến bệnh trên người thuộc O26, O91, O103, O111 (Paton, 1989) Hầu hết

tính chất sinh hóa của E coli O157:H7 đều tương tự như những E coli khác

Điểm khác biệt về sinh hóa của dòng O157:H7 là không lên men đường sorbitol

và β-glucuronidase dương tính 93% chủng E coli thì lên men sorbitol trong 24 giờ, trong khi E coli O157:H7 lại không 93% chủng E coli cho β-glucuronidase dương tính trong khi E coli O157:H7 thì không Ngoài ra trong môi trường TSB,

O157:H7 phát triển nhanh ở 30 – 42oC, tăng trưởng khó khăn ở 43 – 44oC và ngừng tăng trưởng ở 45oC (dẫn liệu bởi Trần Thanh Phong, 1998)

Liều gây nhiễm của E coli O157:H7 là rất nhỏ, từ 10 – 100 vi khuẩn (Griffin, 1994; Paton, 1996), nhưng cũng may mắn là E coli O157 hiện diện trong

phân, thực phẩm với tần số thấp hơn nhiều so với nhóm non-O157 (Paton, 1998)

Đây cũng là trở ngại cho việc phát hiện E coli O157:H7 Dựa vào những tính chất riêng biệt của dòng E coli này, nhiều môi trường tăng sinh và chọn lọc đã

được tạo ra để phát hiện O157:H7 trong thực phẩm Người ta dùng môi trường tăng sinh có bổ sung thêm kháng sinh cefixime, cefsulodin, vancomycin để hạn chế sự tăng trưởng của những vi trùng Gram âm khác Sau đó sử dụng môi trường

Trang 10

tuyển lựa để phát hiện nhóm E coli O157 Thường nhất là môi trường SMAC

hoặc SMAC có bổ sung cefixime và tellurite (CT-SMAC) (FDA, 2002)

2.1.5.3 Nguồn lây nhiễm: STEC có thể được tìm thấy trong phân của

nhiều loài động vật như trâu bò, cừu, dê, heo, chó và mèo (Beutin, 1993; Beutin, 1995; Chapman, 1997) và ngựa (Chalmer, 1997) Loài động vật quan trọng nhất trong việc gây nhiễm cho người là trâu bò Đường gây nhiễm chủ yếu của STEC vào thực phẩm là việc vấy nhiễm chứa vật đường tiêu hóa và phân vào thịt trong quá trình giết mổ (Paton, 1998) STEC lây truyền qua người chủ yếu bằng con đường thực phẩm, nước và từ người qua người Hầu hết các trường hợp là do ăn thực phẩm đã bị nhiễm, đặc biệt là thực phẩm có nguồn gốc động vật, mà thịt bò là nguyên nhân chủ yếu (Keskimaki, 2001)

2.1.6 Enteropathogenic E coli (EPEC)

EPEC là nhóm E coli gây tiêu chảy quan trọng có liên quan đến tiêu chảy

ở trẻ sơ sinh tại những nước đang phát triển

Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E (attaching-and-effacing, A/E), có thể quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay thú bị nhiễm bệnh và trong nuôi cấy tế bào (dẫn liệu Nataro và Kaper, 1998) Kiểu hình riêng biệt này được đặc trưng bởi sự hư hại của các vi nhung mao và sự kết dính chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biểu mô

Dạng tổn thương này khác với dạng tổn thương do dòng ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và V cholerae bám theo kiểu không chặt, không gây bào mòn vi nhung)

Mặc dù những nghiên cứu trước đây đã báo cáo về những tổn thương mô bệnh học dạng này, nhưng cho đến khi Moon và ctv (1983) báo cáo rằng kiểu tổn thương này có liên quan rộng rãi đến EPEC thì thuật ngữ “gắn kết và gây hư hại” (“attaching and effacing” – A/E) mới được đưa ra Gen cần thiết cho việc tạo ra

tổn thương A/E là gen eae mã hóa protein intimin Protein này là yếu tố độc lực

Trang 11

2.1.7 Enterotoxigenic E coli (ETEC)

2.1.7.1 Các yếu tố độc lực: Nhóm ETEC có hai nhóm quyết định độc lực

chính là độc tố ruột (enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF)

Độc tố ruột enterotoxin

Nhóm ETEC gồm những E coli tạo ra ít nhất một trong hai loại độc tố

đường ruột là ST và LT

ETEC thường được xem là đại diện của cơ chế gây bệnh bằng cách vi khuẩn bám vào bề mặt màng nhầy ruột non và tiết ra độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch Nhóm ETEC gây tiêu chảy thông qua sự tiết độc tố đường

ruột LT và ST E coli nhóm này có thể chỉ tiết độc tố LT, hoặc chỉ tiết ST, hoặc

có thể tiết cả LT và ST

(1) Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile toxin - LT): Độc tố LT của E

coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc tố tả (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra LT và CT giống nhau nhiều đặc

tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau khoảng 80%), tương đồng về receptor, hoạt tính enzym, và tác động của nó trên thú hay nuôi cấy tế bào LT có

Trang 12

2 serogroup chính là LT-I và LT-II LT-I và LT-II không có phản ứng chéo về mặt miễn dịch

I được tiết bởi những dòng E coli gây bệnh trên người và thú Còn

LT-II được tìm thấy chủ yếu ở E coli trên thú và hiếm khi ở người Về mặt khái

niệm, trừ khi đi kèm với chữ số la mã thì tên gọi LT dùng để chỉ LT-I (Nataro và Kaper, 1998)

- LT-I: LT-I là một oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu

đơn vị A 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B 11,5 kDa Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm trong hoạt tính enzym của độc tố gồm peptide A1 và peptide A2 liên kết nhau bởi cầu nối disulfur Những tiểu đơn vị B sắp xếp thành vòng nhẫn, liên kết chắc chắn với ganglioside GM1 và liên kết lỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein ruột – chúng là các receptor của LT Hai loại LT-I có liên hệ gần nhau và có thể phản ứng chéo một phần với nhau là LTp (LTp-I) đầu tiên được phân lập từ heo và

LTh (LTh-I) được phân lập từ người Gen mã hóa cho LT là elt hay lt-I nằm trên

plasmid mà plasmid này có thể chứa cả gen mã hóa ST và/hoặc gen mã hóa những kháng nguyên của yếu tố định vị (colonization factor antigen - CFA)

Sau khi độc tố đi vào nội bào, chúng di chuyển trong tế bào nhờ hệ thống vận chuyển của Golgi (Golgi vận chuyển) Đích của LT trong tế bào là enzym adenylate cyclase nằm ở lớp màng ngoài của tế bào biểu mô ruột Peptide A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến của protein liên kết GTP (GTP-binding protein) là GS, gây hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm gia tăng AMP vòng (cAMP) trong tế bào Vì vậy enzyme cAMP-dependent protein kinase (A kinase) được họat hóa dẫn đến sự phosphoryl hóa kênh chloride (Cl-) ở màng tế bào biểu mô vượt quá mức bình thường Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào bên dưới tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thụ NaCl bởi những tế bào có lông nhung Hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng

Trang 13

- LT-II: Nhóm LT-II giống với LT-I và CT khoảng 55 - 57% ở tiểu đơn vị

A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B LT-II làm gia tăng cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II sử dụng GD1 làm receptor thay vì GM1 Như đã nói ở trên, LT-II không có liên quan đến bệnh trên người và thú

(2) Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin - ST): Ngược với LT, ST có

trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này ST được chia thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động Gen mã hóa cho cả 2 nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon STa (hay còn gọi là ST-I) được tạo bởi ETEC và một vài vi khuẩn Gram âm khác gồm

Yersinia enterocolitica và V cholerae không phải O1 ST giống 50% trình tự acid

amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 của EAEC Gần đây, còn có báo cáo cho rằng một vài dòng của ETEC cũng có thể sản sinh độc tố EAST1 ngoài độc tố STa Còn STb chỉ được tìm thấy ở ETEC

Trang 14

- STa: STa là một peptide gồm 18 -19 amino acid với trọng lượng phân tử

khoảng 2 kDa STa được chia thành 2 loại là STp (ST porcine hay STIa) phân lập được đầu tiên trên heo và STh (ST human hay STIb) phân lập trên người Cả 2 loại độc tố có thể được tìm thấy ở dòng ETEC người

Receptor chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C C) thuộc họ những enzyme receptor cyclase Sự kết hợp của STa vào GC-C kích thích hoạt tính GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự kích thích tiết Cl- và/hoặc ngăn cản sự hấp thụ NaCl, gây

(GC-ra sự tiết chất lỏng trong ruột

- STb: STb chủ yếu có liên quan đến dòng ETEC phân lập từ heo mặc dù

cũng có báo cáo về vài chủng ETEC người cũng sản sinh STb Không như STa, STb gây ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của biểu mô ruột và teo nhung mao một phần Receptor của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố có thể kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào trong tế bào Không tạo ra sự tiết Cl-

như STa, STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO3-) STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại bào STb cũng kích thích phóng thích PGE2 và serotonin, từ đó người ta cho rằng ENS có thể cũng có liên quan đến đáp ứng tiết gây ra bởi độc tố này (Hitotsubashi, 1992)

Yếu tố định vị (colonization factor – CF): Cơ chế mà ETEC kết dính và

cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên cứu kỹ Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF)

CFA có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái Có 3 loại chính gồm loại lông hình que cứng, lông hình que mềm có dạng bó, lông có cấu trúc

Trang 15

cho độc tố ST và/hoặc LT Tiểu đơn vị cấu trúc lông thường tạo miễn dịch vượt trội và do đó tiểu đơn vị có tính kháng nguyên mạnh nhất

2.1.7.2 Dịch tễ

Dòng ETEC liên quan đến 2 hội chứng lâm sàng chính: tiêu chảy trên trẻ

em thôi bú ở những nước đang phát triển và tiêu chảy ở du khách Dịch tễ của bệnh do ETEC được quyết định bởi nhiều yếu tố: (1) miễn dịch tại màng nhầy đối với sự nhiễm ETEC khác nhau ở từng cá thể, (2) những người nhiễm không có biểu hiện triệu chứng vẫn bài thải một lượng lớn vi khuẩn qua phân, và (3) việc nhiễm chỉ đạt được khi liều gây nhiễm khá cao Ba đặc tính này tạo nên tình trạng ô nhiễm ETEC trong môi trường ở những vùng có dịch và hầu hết trẻ em trong vùng này sẽ đương đầu với ETEC ở thời kỳ thôi bú Trẻ em đã ở tuổi đến trường và người lớn có nguy cơ tiêu chảy do ETEC rất thấp Dòng ETEC sản sinh

ST là nguyên nhân của hầu hết các trường hợp dịch bệnh

Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng thức ăn và nước bị ô nhiễm là những phương tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black, 1981) Sự nhiễm ETEC ở những vùng dịch thường tập trung chủ yếu vào những tháng ấm và ẩm, khi đó thì sự nhân lên của ETEC trong thực phẩm và nước là lý tưởng nhất

Mặc dù sự nhiễm ETEC xảy ra chủ yếu trên trẻ em, nhưng những người trưởng thành chưa có miễn dịch cũng có thể nhiễm Thực vậy ETEC là nguyên nhân chính gây tiêu chảy trên du khách trưởng thành từ những nước đã phát triển đến thăm những vùng nhiễm dịch ETEC Nhiều nghiên cứu cho rằng 20 - 60% số

du khách này có triệu chứng tiêu chảy và 20 - 40% các trường hợp là do ETEC Việc tiêu chảy trên du khách thường xảy ra ở những du khách lần đầu tiên đến thăm những nước đang phát triển Tiêu chảy trên du khách thường là do thức ăn và nước uống bị ô nhiễm

Trang 16

2.1.7.3 Khía cạnh lâm sàng

Triệu chứng bệnh thường xảy ra đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn (14 – 50 giờ) Bệnh nhân tiêu chảy như nước, thường không có máu; một vài bệnh nhân có hiện tượng sốt và ói mữa Tiêu chảy do ETEC có thể nhẹ, ngắn và tự bớt

dần nhưng cũng có thể gây ra tiêu chảy xổ nghiêm trọng giống như nhiễm Vibrio cholerae

Hầu hết các trường hợp nhiễm ETEC nguy hiểm đến tính mạng xảy ra trên trẻ em thôi bú ở những nước đang phát triển Mặc dù việc sử dụng kháng sinh nhạy cảm cũng làm giảm thời gian và mức độ tiêu chảy, nhưng những thuốc trị có hiệu quả thì không sẵn có ở những vùng nguy cơ cao; ngoài ra sự đề kháng kháng sinh của dòng ETEC cũng là vấn đề đáng quan tâm Do đó cần phải lưu ý rằng cơ sở của việc chăm sóc bệnh nhân nhiễm ETEC là duy trì đủ lượng nước trong cơ thể nếu có triệu chứng tiêu chảy

2.1.8 Enteroaggregative E coli (EAEC hay EAggEC)

EAEC hay EaggEC là nhóm E coli không sinh enterotoxin và bám dính

vào tế bào Hep-2 theo kiểu bám dính kết tập (aggregative adhesion – A/A)

Nhóm EAEC gồm cả dòng E coli gây bệnh và không gây bệnh Tất cả các

EAEC đều có plasmid 60 MDa chứa gen tạo tổn thương dạng A/A và gen mã hóa cho độc tố ruột chịu nhiệt EAST1 (EAEC heat-stable enterotoxin 1) Vai trò của EAST1 trong tiêu chảy chưa rõ ràng, nhưng gen mã hóa A/A trên plasmid là cần thiết cho quá trình gây bệnh (Baudry 1990) Ngoài ra EAEC còn có những yếu tố độc lực khác như haemolysin, các độc tố và các yếu tố có liên quan đến quá trình bám dính như lông và những protein màng ngoài

EAEC gây tiêu chảy kéo dài (trên 14 ngày) Trong hầu hết các báo cáo đều mô tả EAEC ở các ca tiêu chảy lẻ tẻ, nhưng EAEC cũng có thể là tác nhân gây thành ổ dịch (dẫn liệu Keskimaki, 2001)

Trang 17

2.1.9 Enteroinvasive E coli (EIEC)

Những E coli dòng EIEC thường không điển hình về các đặc tính sinh hóa và khó xác định EIEC rất giống với Shigella về mặt kháng nguyên, sinh hóa và

đặc tính gây bệnh Triệu chứng lâm sàng của bệnh bao gồm sốt, đau bụng quặn, khó chịu, nhiễm trùng máu và tiêu chảy như nước hay bệnh lỵ điển hình với máu,

dịch nhầy và nhiều bạch cầu trong phân Cả Shigella spp và EIEC đều có khả

năng xâm nhập vào tế bào biểu mô kết tràng và chúng đều tiết một hay nhiều độc tố ruột liên quan đến tiêu chảy (Nataro và Kaper, 1998) EIEC cũng có thể gây tiêu chảy ở khách du lịch và liên quan đến những vụ ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn bị ô nhiễm

Tóm lại, một số gen độc lực quan trọng của những nhóm E coli gồm:

STT Gen độc lực Nhóm E coli

Việc phát hiện các gen độc lực của E coli thường được thực hiện dựa trên

những kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật PCR

2.2 Kỹ thuật PCR

2.2.1 Nguyên tắc

PCR (polymerase chain reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 Đây là kỹ thuật in vitro cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong thời gian ngắn (tạo dòng in vitro, không cần hiện diện của tế bào)

Trang 18

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Các mồi này gồm có mồi “xuôi” (forward primer: mồi tác động lên sợi 3’→ 5’) và mồi “ngược” (reverse primer: mồi tác động lên sợi 5’→ 3’)

2.2.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

Bước 1 (giai đoạn biến tính - denaturation): hai mạch của phân tử DNA

tách rời nhau thành hai mạch đơn Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là ở 94 – 950 C trong vòng 30 giây đến 1 phút

Bước 2 (giai đoạn ủ bắt cặp – anealing): Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn

Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 – 600C tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

Bước 3 (giai đoạn kéo dài – elongation hay extension): nhiệt độ ở giai

đoạn này được tăng lên 720C giúp DNA polymerase hoạt động tổng hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate Đoạn DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA

Mỗi chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng DNA mẫu của lần trước Tổng DNA khuếch đại được tính theo công thức:

Tổng DNA khuyếch đại = m * 2n

Với n là số chu kỳ, m là số bản sao của chuỗi mã hóa

Trang 19

* Số chu kỳ của phản ứng PCR

Trong thực tế, không vượt quá 40 chu kỳ trong một phản ứng, vì phản ứng PCR diễn ra qua hai giai đoạn:

Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng mẫu ban đầu

Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:

+ Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng

+ Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng

+ Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà lại bắt cặp với nhau

Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu Số bản mẫu 105

thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, số bản mẫu 102 – 103 thì số chu kỳ phải là 35 – 40

2.2.3 Các thành phần của một phản ứng PCR

- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại

- Mồi (primer): Mồi là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung với trình tự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen, không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một mồi Chiều dài các mồi tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide (thường là 18 – 24 nucleotide) Trình tự nằm giữa hai mồi “xuôi” và “ngược” không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1Kb

- Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt, được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng Taq DNA

polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến

Trang 20

cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg2+ Taq DNA polymerase tổng

hợp DNA theo hướng 5’ → 3’ và hoạt động tốt nhất ở 70 - 720 C

- Các nucleotide (dNTP- deoxyribonucleotide triphosphate): Là hỗn hợp 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA

- Dung dịch đệm: Thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tuỳ loại enzyme được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+ Nó hình thành một phứp hợp hoà tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho emzyme polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi Nồng độ

Mg2+ (thường được sử dụng ở dạng MgCl2) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng PCR Ngoài ra nồng độ MgCl2 có thể ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của mồi, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn, hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả Nồng độ Mg2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm Nồng độ MgCl2 trong hổn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

Trang 21

Hình 2.1 Nguyên lý của phản ứng PCR

A : Biến tính – tách rời 2 mạch của phân tử DNA

B : Ủ bắt cặp – cặp mồi chuyên biệt bắt cặp với khuôn

C : Kéo dài – DNA polymerase tổng hợp mạch mới kể từ mồi đã bắt cặp

dưới sự hiện diện của 4 loại dNTP và chất đệm thích hợp

Trang 22

2.2.4 Phân tích kết quả PCR

Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA được khuếch đại) sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di

Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các DNA DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường Sự di chuyển của phân tử trong bản gel dưới tác động của một điện trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử (tức là số nucleotide) và nồng độ các chất cấu thành gel, điện thế

Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng Các DNA trong gel agarose được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide, chất này có khả năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV (bước sóng λ = 300 nm) thành vạch màu đỏ da cam

Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng một

“yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker – MWM) là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (DNA ladder)

2.3 Multiplex – PCR

Multiplex - PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dùng đồng thời nhiều cặp mồi trong một phản ứng Multiplex - PCR đầu tiên được mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kể từ đó multiplex - PCR được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiểm tra DNA (Protocol online)

Trang 23

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

- Việc xác định các gen độc lực của E coli được thực hiện tại Trung tâm

Phân tích thí nghiệm Hóa sinh, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Nội dung

- Phân lập vi khuẩn E coli trong phân và thịt bò, heo bằng phương pháp

định lượng Từ đó đánh giá mức độ vệ sinh thực phẩm bằng cách so sánh với tiêu

chuẩn Việt Nam về số lượng E coli trên thịt tươi (TCVN 7046 - 2002) Sử dụng kỹ thuật multiplex - PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn E coli phân

lập được bằng qui trình định lượng

- Phân lập định tính vi khuẩn E coli trong phân bê tiêu chảy, phân heo con tiêu chảy, thịt bò và thịt heo Phát hiện các gen độc lực của E coli đã phân

lập định tính bằng kỹ thuật multiplex - PCR

Trang 24

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phân lập vi khuẩn E coli

Đối tượng lấy mẫu

- Thịt bò, heo được lấy từ các chợ lẻ (dùng cho qui trình định lượng)

- Bề mặt quày thịt bò, thịt heo được lấy trong lò mổ (dùng cho qui trình

Cách lấy và bảo quản mẫu

- Mẫu thịt: Chọn ngẫu nhiên miếng thịt để lấy mẫu Khối lượng mẫu là 50

g thịt

- Mẫu bề mặt quày thịt: Chọn ngẫu nhiên quày thịt ở giữa ca giết mổ

Dùng gạc vô trùng lau bề mặt quày thịt với tổng diện tích khoảng 200 cm2

- Mẫu phân bình thường: Dùng muỗng múc khoảng 25 g ở phần giữa cục

phân gia súc mới thải

- Mẫu phân tiêu chảy: Phân được lấy từ trực tràng bằng tăm bông (± 0,1 g)

rồi cho vào môi trường vận chuyển Carry Blair

Tất cả các loại mẫu sau khi lấy đều được đựng trong dụng cụ vô trùng và

giữ lạnh ở 4 – 80C cho đến khi tiến hành xét nghiệm (mẫu được giữ tối đa 24 giờ)

Số lượng mẫu

Số lượng mẫu khảo sát được tính là số mẫu đã phân lập được vi khuẩn E

coli từ các mẫu đã lấy

Trang 25

Qui trình phân lập vi khuẩn E coli

- Từ mẫu thịt và mẫu phân bình thường, vi khuẩn E coli được phân lập,

định lượng theo qui trình FAO (1992)

- Mẫu phân bê và heo con tiêu chảy được cấy ria trực tiếp trên môi trường EMB hoặc MAC, ủ ở 37oC trong 24 giờ Khuẩn lạc E coli điển hình trên môi

trường EMB sẽ dẹp, có màu tím ánh kim với tâm sậm màu, và trên môi trường MAC có màu hồng, tròn, lồi

- Mẫu bề mặt quày thịt (200 cm2) được làm đồng đều trong 180 ml pepton đệm phosphate và dập mẫu trong 60 giây Bổ sung kháng sinh cefixime với nồng độ 0,0125 mg/l (FDA, 2002) Ủ ở 37oC trong 24 giờ Pha loãng canh tăng sinh 10 lần với nước sinh lý vô trùng Hút 100 μl canh tăng sinh ở nồng độ 10-1 dàn đều lên bề mặt đĩa thạch CT-SMAC Ủ ở 37oC trong 24 giờ Vi khuẩn E coli

O157:H7 điển hình thường phát triển trên môi trường CT-SMAC tạo khuẩn lạc không màu hoặc màu xám với tâm đục

Trang 26

Mẫu (thịt, phân bình thường)

Làm đồng đều mẫu

QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH

Mẫu phân Mẫu thịt

Trang 27

TCVN có số lượng E coli không quá 100 vi khuẩn / gam

3.3.2 Ly trích DNA từ vi khuẩn E coli phân lập được

Theo Cebula và ctv (1995), kết hợp với phương pháp ly trích DNA từ E coli của Cerna (2003) và Botteldoorn (2003), chúng tôi tiến hành ly trích DNA từ

vi khuẩn E coli phân lập được bằng phương pháp nhiệt như sau:

- Chọn khoảng 20 khuẩn lạc E coli trên môi trường thạch cho vào

eppendorf đựng sẵn 1 ml nước cất 2 lần vô trùng

- Đun sôi trong 10 phút

- Chuyển ngay vào tủ –70 oC, giữ trong 10 phút

- Rã đông hoàn toàn

- Ly tâm với tốc độ 10.000 rpm trong 3 phút

- Thu phần nổi làm DNA khuôn mẫu

3.3.3 Xác định gen độc lực eae, hly, stx1, stx2, stx2e, sta, stb, lt-I của E

coli phân lập được từ thịt và phân

Việc phát hiện các gen độc lực của E coli được thực hiện bằng 2 phản

ứng multiplex – PCR với máy luân nhiệt (thermal cycler):

- Multiplex – PCR1: phát hiện các gen eaeA, hlyA, stx1, stx2

- Multiplex – PCR2: phát hiện các gen stx2e, sta, stb, lt-I

Trong quá trình thực hiện phản ứng multiplex – PCR, mẫu đối chứng dương (EDL933 hoặc H44) được thực hiện đồng thời với những mẫu khảo sát

+ EDL933 là đối chứng dương với các gen eaeA, hlyA, stx1, stx2

+ H44 là đối chứng dương với các gen stx2e, stb, lt-I

Trang 28

Hai mẫu đối chứng dương này được cung cấp từ Phòng thí nghiệm Trường Đại học Thú y Toulouse (Pháp)

Số mẫu xét nghiệm các gen độc lực của E coli

Mẫu E coli phân lập được Số mẫu thực hiện PCR Phương pháp

phân lập Đối tượng mẫu

Multiplex – PCR1

Multiplex – PCR2

(bp)

stx1 Stx1-R Stx1-F ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC AGAACGCCCACTGAGATCATC 180

stx2 Stx2-R Stx2-F GGCACTGTCTGAAACTGCTCC TCGCCAGTTATCTGACATTCTG 255

eaeA EaeA-R EaeA-F GACCCGGCACAAGCATAAGC CCACCTGCAGCAACAAGAGG 384

hlyA HlyA-R HlyA-F GCATCATCAAGCGTACGTTCC AATGAGCCAAGCTGGTTAAGCT 534

(Dẫn liệu của Paton và Paton, 1998)

Trang 29

* Các thành phần của phản ứng multiplex – PCR:

STT Thành phần Nồng độ

7 Nước cất 2 lần Vừa đủ 50 μl

* Chu trình nhiệt trong phản ứng multiplex – PCR1 (Paton và Paton, 1998):

Trang 30

lt-I LT-R LT-F GGCGACAGATTATACCGTGC CCGAATTCTGTTATATATGTC 696

sta STa-R STa-F TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG CTTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC 147

stb STb-R STb-F ATCGCATTTCTTCTTGCATC GGGCGCCAAAGCATGCTCC 172

stx2e Stx2e-R Stx2e-F CCTTAACTAAAAGGAATATA CTGGTGGTGTATGATTAATA 230

(Dẫn liệu Blanco và ctv, 1997)

1 chu kỳ

10 chu kỳ

11 chu kỳ

Trang 31

* Các thành phần của phản ứng multiplex – PCR2:

STT Thành phần Nồng độ

7 Nước cất 2 lần Vừa đủ 50 μl

* Chu trình nhiệt trong phản ứng multiplex – PCR2 (Nguyen Ngoc Hai, 2002):

3.3.4 Điện di trên gel agarose và đọc kết quả điện di

Sau phản ứng multiplex - PCR, 10 μl sản phẩm PCR + 2 μl loading dye được điện di trên gel agarose 1,5% trong TBE Thang ladder cũng được điện di đồng thời Thời gian điện di là 35 – 40 phút ở 100 V và 250 mA

Gel điện di được ngâm trong 30 phút với dung dịch ethidium bromide

1 mg/ml TBE Sau đó rửa sạch bằng nước và chụp hình gel với tia UV bằng

25 chu kỳ

Trang 32

máy chụp gel (phần mềm Quality One 2000, Bio-Rad) Các băng DNA được xác định bằng cách so với các băng của đối chứng dương và thang ladder

100 bp (AB gene, UK)

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR1 EDL933: đối chứng dương (stx1, stx2, eae, hly); 1, 2, 4, 5, 6 là các mẫu xét nghiệm

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR2

H44: đối chứng dương (lt-I, stb, stx2e); Lad:thang chuẩn;

1, 4, 5, 6 là các mẫu xét nghiệm

Trang 33

Chương 4 KẾT QUẢ – THẢO LUẬN