1.1 Đặt vẫn đề
Escbherichia coli (E coli) là một trong những vi khuân phơ biến trong đường tiêu hĩa của người và động vật máu nĩng Hầu hết các dịng E cọ¡ tồn tại một cách tự nhiên và khơng gây hại trong đường tiêu hĩa Tuy nhiên, trong một số trường hợp,
nhất là khi sinh lý cơ thể thay đổi, stress, loạn khuẩn xảy ra, .thì một số dịng Z coli
độc cĩ thê gây bệnh trên người và một sơ lồi động vật
Dựa vào đặc điểm gây bệnh, người ta chia E coi thành nhiều nhĩm Mỗi nhĩm
đều cĩ những yếu tố độc lực khác nhau và được quy định bởi những gen độc lực khác
nhau Một số gen độc lực quan trong cua E coli nhu: gen ehxA, stx1, síx2, và uid cua nhĩm STEC (Shiga toxigenic EF coli); gen eae cua nhĩm STEC va EPEC (Enteropathogenic E coli);
Nhin chung, E coli c6 thé duoc phan lap dé dang 6 khap noi trong méi truéng 6
nhiễm phân Ngoai ra, E coli con c6 thé phan lap được từ những vùng nước ấm,
khơng bị ơ nhiễm hữu cơ; vỉ sinh vật này cĩ thê tồn tại và phát triển rất lâu trong mơi trường Với sự phân bố rộng rãi như vậy, E coi dễ dàng vấy nhiễm vào nguyên liệu
thức ăn hay nguồn nước nếu quy trình sản xuất khơng đảm bảo vệ sinh nghiêm ngặt
Từ đĩ, cĩ thể gây nên các bệnh rối loạn đường tiêu hĩa, và nhiễm trùng đường tiết
niệu, cĩ trường hợp gây tử vong cho người và g1a súc
Do vậy, việc xác định các gen độc lực của È coi trong phân gia súc bình thường hoặc tiêu chảy là cần thiết, gĩp phần trong việc chân đốn bệnh trên động vật và đánh giá nguy cơ truyền lây sang người qua con đường thực phẩm Từ đĩ, cĩ những biện pháp phịng ngừa hữu hiệu nhằm bảo vệ sức khỏe cho con người và vật nuơi Những tiến bộ của cơng nghệ sinh học hiện nay với phương pháp PCR sẽ giúp chúng ta chân đốn chính xác, hiệu quả trong thời gian ngắn hơn so với phương pháp truyền
thống (nuơi cấy, phân lập, .) Vì vậy, đề tài tiến hành sử dụng kỹ thuật multiplex —
Trang 2lập được từ phân bị, heo tiêu chảy và thịt bị Hy vọng trong tương lai, đề tài sẽ được
ứng dụng vào thực tiễn chân đốn và tầm sốt bệnh cho gia súc cũng như cho con người qua con đường thực phẩm
Trang 32.1 Vikhuan E coli
Vi khuẩn E coj¡ sống bình thường trong ruột người và động vật, nhiều nhất
trong ruột già Vi khuẩn theo phân ra mơi trường bên ngồi gây ơ nhiễm cho nước, đất, khơng khí, dụng cụ giết mỗ, các nguyên liệu sử dụng trong chế biến thực phẩm,
2.1.1 Đặc điểm sinh học
¢ Phan loai: vi khuan E coli thuéc ho Enterobacteriaceae, giống Escherichia
Hinh thai: là trực khuẩn, gram âm, di động, khơng bào tử, giáp mơ, cĩ lơng tơ xung quanh
s* Kích thước: khoảng 0,5 um X 2-3 pm
* Đặc tính nuơi cấy: vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghỉ Cĩ thê sinh
trưởng ở nhiệt độ 15 - 40°C nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 37C, pH từ 6,4 — 7,4
Mọc tốt trên mơi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc
tron, ướt, trắng đục, khoảng 2 - 3 mm
s* Đặc tính sinh hĩa: E coi lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrate thành nitrite Để phân biệt E coi với vi khuẩn đường ruột khác, người ta thường sử dụng thử nghiệm IMVIC E coli cho kết quả IMVIC la: + + - - hay - + - - (FAO,
1992)
2.1.2 Yếu tố kháng nguyên
Vi khuẩn đường ruột E cojj cĩ cầu trúc kháng nguyên phức tạp Dựa vào tính chất kháng nguyên, người ta phân chia các vi khuẩn cùng loại thành các tuýp huyết
thanh (serotype) khác nhau (Bộ mơn vi sinh, Khoa Y, Dai hoc Y Dược Tp Hồ Chí
Minh, 1996):
* Kháng nguyên thân O (somatic antigen) là kháng nguyên của vách tế bào,
cầu tạo bởi lipopolysaccharide, cĩ trên 150 loại khác nhau Đặc tính của kháng nguyên
O là:
= Chiu được nhiệt, khơng bị hủy khi đun nĩng 100°C trong 2 giờ
Trang 4“Rất độc, chỉ cần 0,05 mg đủ để giết chuột nhất sau 24 giờ
Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết O Kháng nguyên O giữ vai trị nhất định đối với khả năng gây bệnh của
dịng vi khuân và cĩ tính chất chuyên biệt cho từng lồi vật chủ
+* Kháng nguyên lơng H (flagellar antigen): cĩ trên 50 loại khác nhau, cẫu tạo bởi protein và cĩ tính chất khơng chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase,
khơng bị hủy bởi formol 5% Khi kháng nguyên H gặp kháng thê tương ứng sẽ xảy ra
hiện tượng ngưng kết H
** Kháng nguyên giáp mơ K (capsular antigen): cĩ hơn 100 loại khác nhau và nằm ngồi kháng nguyên O Kháng nguyên K là polysaccharide hay là protein Nếu kháng nguyên K che phủ hồn tồn thân vi khuẩn thì sẽ ngăn cản phản ứng ngưng kết O Kháng nguyên giáp mơ K (capsular antigen) giúp E coii bám vào tế bào biểu mơ
trước khi xâm lấn đường tiêu hĩa hay đường tiết niệu
** Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): cĩ dạng hình sợi, dài khoảng 4 um, thăng hay xoắn, đường kính 2,1 — 7 nm, giúp vi khuân bám vào tế bào niêm mạc ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn
Hiện nay cĩ hơn 700 tuýp huyết thanh của E coj¡ từ sự tơ hợp các nhĩm kháng nguyên O, H, K, F Dựa vào đĩ, người ta cĩ thể định danh vi khuẩn
2.1.3 Phan loai E coli
Dé phan loai E coli gay bệnh, người ta dựa vào đặc điểm sinh bệnh như: gen độc lực mã hĩa các protein gây bệnh cho vật chủ, sự tác động khác nhau lên màng nhay ruột, hội chứng lâm sàng và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh Cĩ 5 nhĩm Z
coli gay bénh (Keskimaki, 2001):
(1) E coli sinh déc t6 Shiga (STEC- Shiga toxigenic E coli hay VTEC-
Verotoxigenic E coli va EHEC Enterohemorrhagic E coli )
(2) E coiï gầy bệnh đường ruột (EPEC- Enteropathogenmic E coli)
Trang 5(5) E coli tân cơng hay xâm lẫn đường ruột (EIEC- Enteroinvasive E coli)
2.2 Shiga toxigenic E coli (STEC)
Nhĩm STEC được kết tội là liên quan đến nhiều đợt dịch bệnh viêm dạ dày, đã
và đang đe dọa sức khỏe cộng đồng Vào những năm đầu thập niên 1980, các dịng STEC gây ra những đợt dịch liên quan đến hội chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC)
và hội chứng huyết niệu (HUS) HUS biểu hiện ba triệu chứng điển hình là suy thận
cấp, giảm tiểu cầu và thiếu máu tan huyết do ton thương mao mạch Bao gồm nhiều serotype khác nhau như O26, OII1, O113, O124, O145, O157, (Bộ mơn vi sinh,
Khoa VY, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh, 1996) Hiện nay, người ta cơng nhận các
dong STEC gây bệnh nghiêm trọng cho con người, đặc biệt O157:H7 là serotype chinh
của STEC gây nhiều ơ dịch lớn trên khắp thế giới (Smith và ctv, 1988)
2.2.1 Thuật ngữ
Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những thuật ngữ khác nhau
để gọi tên cho nhĩm E coii này Thuật ngữ Verotoxigenic E coli hay
Verocytotoxigenic EF coli (VTEC) được Konowalchuk và ctv (1977) đặt cho nhĩm này khi phát hiện việc sản xuất độc tố gây độc dịng tế bào Vero (ở thận khi mặt xanh
châu Phi) Thuật ngữ Enterohemorrhaglc EF coli ( EHEC) chi nhimg dong £ coli gay
HC va HUS (Nataro va Kaper, 1998) Va thuat ngir Shiga toxin-producing E coli (STEC) chi nhimg serotype £ coli san sinh độc tố gây độc tế bào giống như độc tố của vi khuan Shigella (Calderwood va ctv, 1996)
STEC va VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau, và cả hai đều đề cập đến Z coi¡ sản sinh một hay nhiều độc tố gây độc tế bào Tuy nhiên, khơng phải chỉ cĩ gen sán sinh độc tố là cĩ thể gây bệnh nếu khơng cĩ các yếu tố độc lực khác Những dịng
E coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe mạnh với số
lượng rất ít, nhưng những dịng này thiếu một hay vài yếu tố độc lực khác của STEC
(Beutin và ctv, 1995) Do đĩ, khơng phải tất cả STEC đều cĩ khả năng gây bệnh
Trang 62.2.2.1 Độc tố Shiga (Stx)
Shigella dysenteriae do Kiyoshi Shiga phat hién nim 1897, san sinh déc tố thường được gọi là Shiga Và sau này người ta phát hiện ở STEC cũng sản xuất độc tố
tác động tương tự như Shiga (Shiga-like toxin) (Nataro va Kaper, 1998)
Stx là một ngoại độc tố khơng bền với nhiệt, tác động lên ruột lẫn hệ thần kinh
trung ương Ở ruột, E coi gây tiêu chảy, đồng thời ức chế hấp thu đường và các axit amin ở ruột non Ở hệ thần kinh, nĩ gây biểu hiện lâm sàng trầm trọng cĩ thể tử vong
(Bộ mơn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh, 1996) Trong số hơn 200
serotype E colj cĩ thể sản sinh độc tổ Stx thì cĩ hơn 50 serotype gây HC hay HUS ở người (Nataro và Kaper, 1998)
+ Cấu trúc và tơ chức các gen síx: họ độc tố Stx ở STEC gồm hai nhĩm chính khơng phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2 Trong khi Stx1 cĩ tính bảo tồn cao thì
Stx2 rất thay đơi về trình tự, tạo ra nhiều biến chủng như Stx2c, Stx2hp, Stx2e Một
dịng STEC cĩ thê sản sinh Stx1 hay Stx2, hoặc cả Stx1 lẫn Stx2, và thậm chí nhiều
dạng của Stx2
Những nghiên cứu đầu thập niên 80 đã xác định Stx1 và Stx2 được mã hĩa trên thực khuẩn thể và thực khuẩn thể này chèn vào nhiễm sắc thể cia E coli (O’Brien va ctv, 1984) Bảng 2.1 Danh pháp các thành viên trong họ Stx
Tên gọi hiện nay
Tên gọi trước đây Gen Protein
Shiga toxin (Stx) six Stx
Trang 7- Tiéu don vi A , 32 kDa, gồm peptide A; 28 kDa va peptide A, 4 kDa ndi véi nhau bang cau néi disulfit Peptide A; co hoat tinh enzyme va peptide A; cĩ nhiệm vụ
gắn kết tiêu đơn vị A vào những tiêu don vi B
- Năm tiêu đơn vị B, cĩ trọng lượng phân tử là 7,7 kDa Các tiêu đơn vị B giúp
độc tố kết hợp với thụ thê đặc hiệu của nĩ
®% Vai trị của Stx trong sinh bệnh: Để gây bệnh, trước tiên Stx phải được tiếp nhận bởi các thụ thê đặc hiệu Các nghiên cứu cho thấy rằng Stx cĩ tính chất gây độc
trực tiếp lên tế bào ruột do chúng nhắm đến thụ thé Gb; (globotriaosylceramide), dang
thu thé glycolipid, trên nhung mao của tế bào biểu mơ ruột ở động vật (Stx2e cĩ thụ
thê là Gbx) Gbạ hoặc Gb cịn tìm thấy ở tế bào nội mơ thận, tế bào Vero, tế bào Hela
Nhờ tính đặc hiệu của tương tác này và sự phân bố của các thụ thể thay đơi theo loại tế bào đã ảnh hưởng chính đến cách sinh bệnh (Lingwood, 1996)
Sau khi làm hư hại các tế bào biểu mơ, Stx xuyên qua hàng rào biểu mơ, xâm
nhập vào dịng máu và tiến đến các mơ đích khác nhau cĩ chứa thụ thê glycolipid, gây tốn thương tế bào nội mạch, tế bào thận Cụ thể là những tiểu đơn vị B sẽ giúp độc
tố kết hợp với các thụ thể đặc hiệu này Sau khi được chuyển vào bên trong tế bào, tiểu đơn vị A đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome, rồi cắt một gốc
adenin khỏi rRNA 28S của ribosome, do đĩ gây trở ngại cho sự tổng hợp protein Vì
khơng tơng hợp được protein, những tế bào bị Stx tác động sẽ chết Hậu quả là gây
tiêu chảy, viêm kết tràng xuất huyết (HC) và hội chứng huyết niệu (HUS) Trong khi
đĩ, hậu quả do Stx2e là hiện tượng phù thủng ở heo sau cai sữa (trích dẫn của Lê Thị Mai Khanh, 2004)
% Ảnh hưởng của các loại Stx trong sinh bệnh: Các nghiên cứu dịch tễ đã chỉ ra rang những dịng STEC chỉ sản sinh Stx2 thì gây bệnh trầm trọng hơn so với những dịng STEC chỉ sản sinh Stx1, bệnh càng nặng hơn nếu dịng STEC sản sinh cả Stx1
Trang 8Enterohemolysin tơn tại 6 nhiéu dang (a, B và .) trong các E coi¡ xâm lẫn hay sinh độc tố đường ruột (Manil và Daube, 2005) Độc tố này được tìm thấy ở hầu hết các địng O157:H7 và các dịng STEC khơng phải O157:H7 Enterohemolysin thuộc nhĩm độc tố
RTX (Repeats in toxin), gây dung giải tế bào tạo thành lỗ như chân lơng (RTX family
of pore-forming cytolysin) (Paton va Paton, 1998) Va RTX hién dién trong E coli gay bệnh đường huyết niệu (uropathogenic E coli), Pasteurella haemolytica va cac tac
nhân khác gây bệnh cho người, động vật (Bauer và Welch, 1996)
Haemolysin do gen ebx4 nằm trên plasmid 60 MDa pO157 mã hĩa Gen ehx4 cĩ 60% tương đồng với »jy4; hiyA cũng là gen câu trúc mã hĩa haemolysin 6 E coli gây bệnh đường huyết niệu và cho kiểu dung huyết œ-haemolysin (œ-Hly) Ngồi ra,
gen cau tric ehx4 cĩ nhiều biến thể, được chia thành hai nhĩm: nhĩm 1 gồm nhiều
loại EHEC phố biến như 0157:H7, 026, O111; trong khi đĩ, nhĩm 2 gồm nhiều
serotype khác cịn lại cũng cĩ tính chất gây bệnh Gần đây, các nghiên cứu về di truyền hoc da chi ra rang gen ehxA của những dịng STEC cĩ trình tự giống nhau trên 98%,
nhưng vẫn cĩ sự khác nhau lớn ở một số đoạn trình tự chuyên biệt (Feng và Monday,
2000)
Beutin và ctv (1989) đã khảo sát và khẳng định răng đa số các dịng STEC đều
cho kiểu dung huyết alpha (œ-Hly) Các dịng sản sinh độc tố này thì khơng gây dung huyết trên thạch máu nhưng tạo thành vịng dung huyết nhỏ, mờ trên thạch máu cừu
(cĩ bố sung Ca”) sau khi ủ qua đêm Hiện tại, phương thức tham gia gây bệnh của
enterohaemolysin vẫn chưa được biết rõ Chính sự dung huyết trở thành nguồn cung cấp Fe kích thích sự phát triển STEC trong ống tiêu hố (Law và Kelly, 1995)
2.2.2.3 Yếu tố bám dính
Yếu tố bám dính của STEC đã được chứng minh đĩng vai trị quan trọng trong sự định vị vi khuẩn ở ruột Đĩ là intimin, một protein màng ngồi cĩ trọng lượng phân tử 94-97 kDa Intimm được mã hĩa boi gen eae (E coli attaching and effacing) Intimin gây tơn thương dạng bám dính và phá hủy, gọi là bénh tich A/E (attaching and effacing) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mơ (Donnerberg và ctv,
Trang 9người và chĩ
" B-intimin cĩ ở những dịng È coj¡ thuộc nhĩm EPEC và EHEC ở người và
thỏ
m z-intimin chủ yếu ở nhĩm STEC của người và động vật, ở EPEC của người
" ¢-intimin hién diện trong nhitng dong E coli thuộc nhĩm EHEC ở bị và người (Oswald và ctv, 2000)
Cĩ sự liên quan chặt chẽ giữa gen eze và khả năng gây bệnh trầm trọng của các dịng STEC trên người như HC và HUS Nhiều nghiên cứu chỉ ra răng tỉ lệ của các dong mang gen eze ở bệnh phẩm người cao hơn trên gia súc Hơn nữa, sự hiện diện dịng STEC mang gen eze trên gia súc thường liên quan đến các dịng vi khuẩn E coli
độc lực trên người mà khoa học đã từng biết, chung thudc serotype 0157, 026, O111,
(Sandhu va ctv, 1996)
Ngồi ra cịn cĩ các yếu tơ liên quan đến sự bám dính của các tác nhân khác gây bệnh đường ruột bao gồm fimbriae, OMPs (outer membrance proteins) va LPS (lipopolysaccharide)
2.2.3 Cách sinh bệnh
Cách sinh bệnh là một quá trình gồm nhiều bước, liên quan đến sự tương tác
phức tạp giữa số lượng vi khuẩn và các yếu tố của vật chủ Cấp STEC qua đường
miệng (chỉ cần liều rất thấp) thì vi khuân phải sống sĩt trong điều kiện mơi trường khắc nghiệt của dạ dày và chúng phải cạnh tranh với các vi khuân khác ở đường ruột
để thiết lập sự định cư Vi khuân STEC sống sĩt trong đường ruột, nhân lên và sản sinh Stx rồi được hấp thu qua tế bào biêu mơ ruột, dẫn truyền vào dịng máu Điều này cho phép toxin đặc hiệu đến bề mặt tế bào đích gồm cả tế bào ruột lẫn các nội quan
khác (Paton và Paton, 1998)
+ Định cư vào ống tiêu hố: vi khuẩn cĩ khả năng bám vào tế bào biểu mơ ruột và định cư trong ống tiêu hố người là một trong những yếu tố quyết định độc lực Người ta ước tính liều gây nhiễm của vài dịng STEC (O111:H- và O157:H7) khoảng
Trang 10% Sức đề kháng acid của STEC: Nét đặc trưng của các dịng STEC là khả năng định cư ở Ống tiêu hĩa người, với số lượng cảm nhiễm thấp STEC đề kháng được pH acid của dạ dày Do đĩ, dịng STEC O157:H7 vẫn cịn sống sĩt trong các thực pham
acid cao (Leyer va ctv, 1995) Tinh trang nay duoc diéu hoa béi gen rpoS Gen nay cé
khả năng giúp vi khuẩn Z cọi kéo dài thời gian sống sĩt ở pH dưới 2,5 (Paton và
Paton, 1998) Gần đây, Waterman và Smail (1996) báo cáo tình trạng đột biến của gen này Điều này gĩp phần giải thích những dịng STEC cĩ khả năng gây cảm nhiễm khác nhau
* Kiểu bám vào tế bào biểu mơ ruột: STEC cĩ khả năng sống sĩt trong điều
kiện khắc nghiệt của dạ dày Chúng phải thiết lập sự định cư này bằng cách bám vào các tế bào biểu mơ ruột STEC định cư được ở đoạn kết tràng (colon) và cĩ lẽ cũng ở
đoạn xa ruột non người; mặc dù hiện tượng này chưa được chứng minh trực tiếp Ngay
cả những dịng trong serotype O157:H7 vẫn cĩ sự bám dính khác nhau, điều này phản ánh nhiều cơ chế bám khác nhau
$% Vai trị của plasmid 60 MDa (pO157) cho STEC bám dính: Hầu hết các dịng
STEC đều chứa pO157 nay Nhiéu nghiên cứu đã phát hiện sự hiện diện của plasmid liên quan đến yếu tổ bám (đmbriae) và sự bám dính với tế bào Henle 407 nhưng khơng bám vào tế bào HEp-2 Theo Tzipori và ctv (1987), cĩ hiện diện plasmid hay khơng cĩ đều khơng ảnh hưởng đến khả năng định cư ở kết tràng của STEC và khả năng gây bệnh tích A/E trên heo con sinh ra bằng cách mồ lẫy thai
2.2.4 Khía cạnh lâm sàng
Ngày nay, người ta cơng nhận rằng cĩ sự phân bố rất rộng về bệnh ở người liên quan đến các vi khuẩn sản sinh độc tố Stx Những bệnh liên quan tới STEC thường
săn liền với những ơ dịch nhỏ rải rác lẫn những ơ dịch lớn cĩ nguồn gốc ngộ độc thực phẩm
Nhiều bệnh nhân nhiễm STEC với triệu chứng đầu tiên là tiêu chảy, một số
trường hợp thì sau một hay hai ngày thì tiêu chảy lẫn máu và HC Đau bụng dữ dội cũng thường xảy ra Đối với những bệnh nhân nhiễm STEC gây tình trạng HUS thì dễ để lại di chứng do sự tơn thương cấp tính ở thận, sự thiếu máu do dung huyết và giảm
tiểu cầu Vài cá thể bị HUS thì cĩ triệu chứng thần kinh như bơ phờ, nhức đầu dữ dội,
Trang 11do STEC ở trẻ em và người già thường cao hơn, điều này cĩ thể do sự đáp ứng miễn dịch kém ở hai lứa tuơi này Sự cải thiện trong kiểm sốt lâm sàng và kỹ thuật thấm tách thận đã làm giảm tỉ lệ chết do HUS từ 50% xuống hơn 10% trong hai — ba thập niên vừa qua Tuy nhiên, số lượng người sống sĩt (khoảng 30%) phải chịu đựng ốm yếu triền miên, bao gồm suy thận mãn tính, tăng huyết áp và suy yếu hệ thần kinh
Tiến trình bệnh do STEC gây ra cĩ hay khơng cĩ biến chứng tùy thuộc vào sự
tác động qua lại giữa vi khuẩn và vật chủ Trong một Ơ dịch, tuơi của người bệnh ảnh
hưởng đến tỉ lệ mắc cũng như tỉ lệ chết Những nghiên cứu gần đây về các ơ dịch lớn
gây ra bởi STEC thuộc serotype O157:H7 cho thấy khoảng 5 —- 10% bệnh nhân tiêu
chảy tiến triển để hình thành HUS do STEC (Paton và Paton, 1998) 2.2.5 Dịch tế học
Trong nhiều năm qua, người ta thừa nhận rằng những dịng STEC gây bệnh trên người thuộc các tuýp huyết thanh O:H phổ rộng Karmali (1989) đã liệt kê 32 serogroup O (tương đương với 60 tuýp O:H khác nhau) Trên khắp thế giới, các dịng STEC thuộc serotype O157:H- là nguyên nhân chính gây bệnh cho người Việc phân lập các serotype này thường dựa vào khả năng khơng lên men sorbitol nên đã gĩp phần
đánh giá quá cao tỉ lệ mắc phải nhĩm này so với các serotype khác Khi một tuýp được phân lập là O157, cĩ lẽ cĩ khuynh hướng bỏ qua tầm quan trọng tiềm năng gây bệnh
của các tuýp khác Trong khi đĩ, các serotype STEC khơng thuộc O157:H7 cũng là nguyên nhân nơi bật gây bệnh cho người
Nguồn lây nhiễm: Nhiều cuộc điều tra dịch tế đã chứng minh rằng các dịng STEC hiện diện trong đường ruột của nhiều lồi vật nuơi như bị, cừu, heo, dê, chĩ, mèo (Beutin va ctv, 1995) va cả ngựa (Chalmer và ctv, 1997) Do đĩ, STEC tồn lưu trong gia súc chính là nguồn quan trọng gây bệnh cho người, và nguồn quan trọng nhất là từ trâu bị
STEC lây truyền qua người chủ yếu bằng con đường thực phẩm, nước và từ
Trang 12Truyền lây STEC giữa người và người xảy ra trong các đợt bộc phát bệnh Thời gian bài thải O157 qua phân là 2 — 4 tuần, nhưng khoảng 13% bệnh nhân thải O157 hơn một tháng và triệu chứng bệnh khơng biểu hiện trong giai đoạn sau Như vậy nguy cơ truyền lây giữa người — người là cao (Keene và ctv, 1994),
2.2.6 Chân đốn
Cĩ những khĩ khăn liên quan đến chân đốn cảm nhiễm do STEC Trong giai
đoạn đầu, STEC tồn tại nhiều trong phân; cĩ nhiều trường hợp, STEC chiếm trên 90%
quan thé vi sinh vật hiếu khí (Paton và ctv, 1996) Tuy nhiên, lúc bệnh thuyên giảm, số
lượng này giảm nhanh cực kỳ Đối với những bệnh nhân HUS, triệu chứng đạ dày ruột
cĩ thê chỉ xuất hiện một tuần hoặc nhiều tuần, và ở thời điểm này số lượng STEC hiện
điện trong phân rất ít Trong vài trường hợp, tiêu chảy khơng kéo dài và nếu lẫy bệnh
phẩm qua trực tràng thì số lượng sẽ hạn chế Vì những lí do này, yêu cầu của phương pháp chân đốn thích hợp phải nhạy, nhanh và địi hỏi khối lượng mẫu tối thiểu Các
qui trình chân đốn thường tập trung vào việc phát hiện Stx, đặc biệt là Stx trong phân Do các qui trình khác nhau về tính phức tạp, thời gian, độ nhạy, tính chuyên biệt và giá thành, vì vậy phải cĩ chiến lược chân đốn thích hợp tùy hồn cảnh và nguồn mẫu (Paton và Paton, 1998)
2.2.7 Phịng ngừa
E coli gây bệnh theo phân ra ngồi và phát tán trong đất, nước, khơng khí Ngồi ra, bệnh cĩ thể lây truyền từ người sang người do tay bân, thực phẩm và nước uống bị nhiễm Do đĩ, bệnh cĩ thê gây thành dịch, đặc biệt ở nhà trẻ, khoa nhi của bệnh viện và người già
Vì vậy, phịng bệnh chủ yếu là tuân thủ nghiêm ngặt qui chế vệ sinh, chú ý xử lý phân và dụng cụ của bệnh nhân Khơng nên ăn những loại thực phẩm khơng đảm
bảo chất lượng, đặc biệt là sản phẩm từ thịt chưa nấu chín vì chúng cĩ thê là nguồn
truyền nhiễm STEC Cĩ thê xác định chỉ số E coj¡ trong nước dé xem nước cĩ nhiễm
ban hay khơng
2.3 Serotype 0157:H7
Theo thống kê về tình hình các ơ dịch bệnh do nhiễm phải STEC thì hầu hết các
Trang 13thay serotype nay nguy hiểm hơn, để lây lan bệnh hơn so với các serotype khác Lần
đầu tiên, serotype Ol57:H7 được phân lập và định danh vào năm 1982 E coli O157:H7 ngày càng cĩ tác động lớn ở Mỹ và châu Âu Hàng năm, ở Mỹ cĩ trên 73000
ca ngộ độc thực phẩm do nhiễm phải O157:H7, trong đĩ cĩ 61 trường hợp tử vong Nguyên nhân do ăn phải thịt bị chưa nấu chín hay đã bị vấy nhiễm, do uống sữa tươi hay do truyền lây giữa người và người sau khi đi bơi trong các hồ đã bị nhiễm (USA Department of Agriculture’s Food safety and Inspection Service, 2004) Tir do, nguo1 ta xem O157:H7 là nguyên nhân phổ biến nhất cho HC và HUS
Serotype này cĩ một sơ đặc điêm khác biệt so với các serotype FE coj khác: - Nhạy cảm với nhiệt độ, khơng phát triển được ở nhiệt độ 44 — 44,5°C (ay,
2000)
- Khơng cĩ khả năng lên men D-sorbifol trong 24 giờ Trong khi đĩ cĩ đến 75 — 94% những dịng Z coj¡ khác lại lên men sorbitol Do đĩ, người ta thay thế mơi trường MacConkey cĩ lactose bằng SMAC chọn lọc chứa 1% sorbitol dé phan lap (Smith va Scotland, 1993)
- Khơng biểu hiện hoạt tính B-D-glucuronidase (GUD): Điểm khác biệt về sinh
hĩa của dịng O157:H7 là khơng cho GUD dương tính, trong khi đĩ khoảng 90 — 95% chủng Z coi cho GUD dương tính Và người ta dựa vào đặc tính này để phân biệt O157:H7 vai cac dong E coli khac (Monday va ctv, 2001)
GUD là enzyme xúc tác sự thủy phan B-D-glucuronide thành rượu và glucuronate Mac dù khơng biểu hiện GUD nhưng các serotype O157:H7 vẫn mang
đoạn gen ¿2 hồn chỉnh (gồm cả vùng điều hịa) trên nhiễm sắc thể Kiểu hình đặc trưng này là do đã xảy ra các đột biến trên gen z2 Hầu hết các đột biến trên z¿ ở O157:H7 là đột biến thối hĩa, ví dụ như đột biến điểm thay thế T băng G ở vị trí 92
so với E coli thuộc chủng hoang dại (wild-type) (Feng và Lampel, 1994) hay đột biến do sự chèn thêm hai base G-G ở vị trí +686 trên 2 ở serotype O157:H7 (Monday và
ctv, 2001) Tĩm lại, những đột biến này cĩ thé anh hưởng đến khả năng hoạt động của GUD, O157:H7 vẫn sản sinh GUD nhưng GUD bị bất hoạt, khơng thực hiện chức
Trang 14- Khang khang sinh: cefixime, sulfivoxazol, tetracycline, streptomycine va cac tác nhân ức chế khác như potassium tellurite (ức chế các VSV thơng thường) (Kim và
ctv, 1994),
- Tinh khang acid (acid resistance - AR) dong vai tro quan trong cho kha nang séng sot cua vi khuan trong méi truong acid E coli O157:H7 cé kha nang séng sot
trong mơi trường acid từ pH = 2 đến pH = 7 Chắng hạn, O157:H7 sống đến 56 ngày
ở pH >= 4 trong mơi trường TBS (Tryptic Soybean Broth), ngồi ra nĩ khơng phát triển ít nhất 5 giờ ở pH 3 -2,5 khi nhiệt độ 37°C trong mơi trường canh Luria cĩ điều chỉnh pH bằng HCI (trích dẫn bởi Jay, 2000) Đặc tính kháng acid này do gen rpøS qui định Cĩ 3 hệ thống AR khác nhau (Foster, 2004):
(1) Hệ thống AR1: chỉ hoạt động khi tế bào tăng trưởng trong mơi trường yếm
khí với sự văng mat cua glucose
(2) Hệ thống AR2: hoạt động phụ thuộc vào sự cĩ mặt cua glutamate
(3) Hệ thống AR3: hoạt động phụ thuộc vào sự cĩ mặt của arginine
Ba hệ thống này hoạt động suốt quá trình tăng trưởng ở pha cân bằng (stationery phase) của vi khuân
- Khả năng chịu mặn: Trong canh khuân 4,5% NaCl, vi khuân tăng số lượng gấp
3 lần khi tăng thời gian lên 2 lần, và khơng phát triển khi >8,5% NaCl (Jay, 2000) 2.4 Kỹ thuật PCR
2.4.1 Khái niệm
Phuong phap PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 đã và đang được sử dụng rộng rãi Đây là một phương pháp tạo
dịng in vifro, khơng cân sự hiện diện của tê bào
2.4.2 Nguyên tắc
Trang 15s* Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), nhiệt độ thường sử dụng là 94 —95°C s* Bước 2: là giai đoạn lai (hybridization), nhiệt độ dao động trong khoảng 40°C - 70°C s* Bước 3: là giai đoạn kéo dài (elongation hay extension), thường ở nhiệt độ 72"C
Một chu kì gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và sau mỗi lần lặp
lại sẽ làm tăng gấp đơi lượng DNA của lần trước Số chu kì thường theo kinh nghiệm
và cĩ thể trong khoảng 25 — 30 chu kì, tùy theo lượng của mẫu DNA lúc bắt đầu và độ
nhạy mong muơn
2.4.3 Các thành phân cần thiết của phần ứng PCR
- Dung dịch đệm: thành phần của dung dịch đệm cĩ thê thay đổi tùy loại enzyme sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg”” Nĩ hình thành một phức hợp hịa tan với đNTP, rất cần cho quá trình liên kết các đNTP, xúc tác cho enzyme polymerase, làm tăng nhiệt độ nĩng chảy (Tm) của DNA mạch đơi Nồng độ MgCI; trong hỗn hợp phản ứng
cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 —- 5 mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)
- Các dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA
- Mỗi (primer): là những oligonucleotide mạch đơn, cĩ trình tự bố sung với trình tu base cua hai đầu mạch khuơn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA Các chuỗi primer nên được thiết kế để nhân một đoạn DNA sao cho đạt chiều dài tối hảo là 100 —- 1000 bp mặc dù trong vài trường hợp sản phẩm chỉ 10 bp
- Taq polymerase: 14 DNA polymerase chịu nhiệt, được chiết tách từ vi khuân Thermus aquaficus ở suỗi nước nĩng Taa khơng bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác tong hop tir đầu đến cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg” Hoạt lực của Taq bị ảnh hưởng tất lớn bởi nồng độ Mg”” Nơng độ tối hảo Mg thường 1a 1,5 mM
(Trần Thị Dân, 2001)
Trang 162.4.4 Phân tích kết quả PCR
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, tùy vào mục đích mà người ta sử dụng nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau để phân tích sản phẩm của phản ứng PCR như
đọc trình tự sản phẩm PCR, tạo dịng sản phẩm PCR Tuy nhiên, cơng việc đầu tiên
sau khi thực hiện phản ứng PCR là phát hiện sản phẩm PCR bang phương pháp điện d1
Sau khi điện di, các DNA trong gel sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide, chat nay cé kha nang gắn xen vào các base của các nucleotide và
phát huỳnh quang dưới tắc dụng của tia UV
Và để ước lượng kích thước DNA trên gel, người ta sử dụng một “yếu tơ đánh dẫu trọng lượng phân tử “ (molecular weight marker - MWN) hay cịn gọi DNA ladder
(thang chuẩn)
2.4.5 Multiplex — PCR
Là phán ứng PCR sử dụng đồng thời nhiều cặp mơi để khuếch đại nhiều đoạn DNA trong cùng một phản ứng PCR Phương pháp này được thử nghiệm thành cơng vào năm 1988 và được áp dụng vào nhiều cơng trình nghiên cứu Cho đến nay, vẫn chưa cĩ nguyên tắc chung hay thành phần chuẩn nào cho việc tơi ưu hĩa phản ứng multiplex —- PCR Do vậy, ứng với mỗi một điều kiện phản ứng, cần phải điều chỉnh cho phù hợp với mục đích mong muốn
2.4.6 Ứng dụng
Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với
nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nơng nghiệp, khảo cơ, pháp y và hình sự Trong nghiên cứu genome, PCR được ứng dụng trong nhân bản vơ tính, multiplex PCR, cloning cDNA bang PCR đảo (inverse PCR), recombinant PCR,
Trong y khoa và thú y, PCR được sử dụng để chân đốn các mầm bệnh virus, vi khuan, protozoa lan ky sinh trùng đa bào
Trang 18Phan 3 NOI DUNG VA PHUONG PHAP TIEN HANH
3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian Đề tài được thực hiện từ ngày 1/03/2005 đến ngày 30/07/2005 3.1.2 Địa điểm - Mẫu phân được lay từ các hộ hoặc trại chăn nuơi ở Đơng Nai, TP HCM và Tiền Giang
- Mẫu bề mặt thịt bị được lấy ở lị mơ Dĩ An-Bình Dương
- Nuơi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại Phịng thực hành Kiểm nghiệm
thú sản và Mơi trường sức khỏe vật nuơi, Khoa Chăn nuơi — Thú y, Trường Dai hoc
Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh
- Xác định các gen độc lực của È coi được thực hiện tại Trung tâm Phân tích
Thí nghiệm Hĩa sinh, Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh
3.2 Nội dung thực hiện
- Phân lập vi khuẩn Z co/¡ trong phân bị, heo và bề mặt thịt bị
- Li trich DNA cua E£ coli phan lap dugc
- Thuc hién phan img multiplex — PCR dé phat hién cac gen eae, ehxA, stx1, stx2
va uid cua E coli
3.3 Phương pháp thực hiện
3.3.1 Vật liệu thí nghiệm cơ bản
Dụng cụ lẫy mẫu: tăm bơng, đèn cồn, chai cồn, mơi tường chuyên chở Carry Blair,
Trang 193.3.2 Cách lẫy mẫu và bảo quản mẫu
- Dùng muỗng vơ trùng lẫy phần giữa cục phân (khoảng 10 -12 g) mà bị, heo vừa mới thải ra, cho vào túi nylon vơ trùng, buộc kỹ, bảo quản 4 - 8°C và chuyển về phịng thí nghiệm càng nhanh càng tốt Phân tiêu chảy cĩ thể được lẫy bằng cách dùng tăm bơng, cho vào mơi trường chuyên chở Carry Blair, chuyên về phịng thí nghiệm
- Quét bề mặt thịt bị bằng gạc hoặc tăm bơng vơ trùng, cho vào ống nghiệm
chứa sẵn nước pepton đệm
3.3.2 Nuơi cấy và phân lap E coli
3.3.2.1 Mơi trường nuơi cấy
s* Mơi trường tăng sinh
Do số lượng #.coi nhĩm STEC, đặc biệt là # co?¡ gây bệnh hiện diện trong
thực phẩm rất ít, cho nên trước khi phân lập chúng tơi sử dụng mơi trường tăng sinh pepton đệm cĩ bố sung khang sinh cefixime (0,0125mg/L) va vancomycin (8mg/L)
(FDA, 2002) dé irc ché cdc vi khuan gram duong va vi khuan séng hoai sinh khac s* Mơi trường phân lập
Để xác định mơi trường nào cho kết quả tốt khi phân lập Z coi nhĩm STEC
mang gen độc lực, chúng tơi sử dụng 3 loại mơi trường MAC, SMAC và CT - SMAC Mơi trường phân lập là mơi trường MacConkey (MAC), Sorbitol MacConkey (SMAC), và Sorbitol MacConkey (CT - SMAC) cĩ bổ sung kháng sinh cefxime (0,05mg/L) va tellurite (2,5mg/L) (FDA, 2002) Khoảng 90% E coi đều lên men đường lactose, trên mơi trường MAC, Z coi điển hình cĩ khuẩn lạc màu đỏ hồng Trên mơi trường SMAC và CT - SMAC, # coj¡ khơng lên men đường sorbitol nên cho khuẩn lạc màu trắng, những địng Z coii lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu hồng
Việc tầm sốt Z coii nhĩm STEC trên phân, bệnh phẩm trên thạch SMAC, CT -
SMAC là cơng cụ ban đầu phát hiện serotype O157 thuộc nhĩm STEC
3.3.2.2 Qui trình phân lập, định tính
(1) Nuơi cấy và phân lập
Trang 20dia MAC va SMAC, t 37°C trong 1§ - 24giờ, chọn và thu khuẩn lạc điển hình, giữ gốc Li trích DNA rồi thực hiện multplex — PCR dé phát hiện các gen độc lực
Riêng đối với mẫu bề mặt thịt, do lượng Z co hiện diện trên bề mặt thịt thường
thấp so với mẫu phân, ngồi ra những dịng Z coj¡ gây bệnh hiện diện trong phân, thực
phâm với tần số thấp hơn nhiều so với nhĩm Z coi STEC khơng thuộc O157 (Paton
và Paton, 1998) Đây chính là trở ngại cho việc phát hiện # coi; O157:H7, nên việc
phết và ria trực tiếp trên mơi trường MAC, SMAC thường gặp nhiều khĩ khăn Vì vậy,
để cải thiện khả năng phát hiện STEC cĩ mang gen độc lực từ thịt, sử dụng mơi trường pepton đệm cĩ bé sung vancomycin va cefixime (PVC) nham han chế sự cạnh tranh
phát triển của những vi khuân khác để STEC cĩ cơ hội tăng sinh tốt hơn Sau khi ủ
37°C trong 24h, canh khuẩn này được cay ria trở lại trên mơi trường thạch CT - SMAC
để chọn lọc chuyên biệt nhĩm STEC
(2) Chon khuan lac E coli
Trên từng loại mơi trường MAC, SMAC, CT - SMAC, chọn ngẫu nhiên 6 — 10
khuẩn lạc rời rạc đại diện cho mỗi nhĩm hình thái:
o Khuẩn lạc hồng trên mơi trường MAC được kí hiệu HM
o Khuân lạc hồng hoặc trắng trên mơi trường SMAC được kí hiệu lần lượt là
HS hoặc TS
o Khuân lạc trắng hoặc hồng trên mơi trường CT - SMAC kí hiệu lần lượt là TCT hoặc HCT
Dùng que cây chạm nhẹ trên từng khuẩn lạc rời rạc rồi chuyển vào từng ống NA riêng biệt để giữ gốc riêng lẻ Thu phần khuân lạc cịn lại của mỗi nhĩm, gom chung
vào 1 eppendorf chứa sẵn 0,4 — 0,5 ml nước cất khử ion vơ trùng
(3) Thử sinh hĩa
Sử dụng nghiệm pháp IMViC (FAO, 1992) cho từng khuẩn lạc riêng lẻ thuộc
nhĩm đĩ đề xác định E coli
3.3.3, Li trích DNA
Trang 21phút Dé yên và hút phần dung dich ở phía trên làm DNA khuơn mẫu (DNA xét nghiệm) Mẫu Phân Thịt MAC SMAC Pepton (vancomycin, (37°C/24h) (37°C/24h) cefixime) (37°C/24h) CT - SMAC (37°C/24h) Chọn 6- 10 khuẩn lạc Chọn 6 - 10 khuẩn lạc theo đỏ hồng từng nhĩm riêng: trắng hoặc đỏ hồng hoặc ca hai Cây từng khuẩn lạc được chọn vào từng ống thạch nghiêng NA (37°C/24h) Thu tất cả phần cịn lại của những khuân lạc đã Thử IMVIC (1/-;+;-;-)
chọn theo từng nhĩm riêng và mỗi nhĩm cho
Trang 223.3.4 Qui trinh multiplex - PCR
(1) Trình tự các đoạn mỗi sử dụng trong multiplex — PCR
Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mơi sử dụng trong phản ứng multiplex - PCR Kích cố DNA Mii (primer) Trinh ty oligonucleotide (5’3”) được khuếch đại (bp) Eae — F ATTACCATCCACACAGACGGT 397 Eae—R ACAGCGTGGTTGGATCAACCT EhxA - F GTTTATTCTGGGGCAGGCTC 158 EhxA —R CTTCACGTCACCATACATAT Stx1 -E CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG 348 Stx1 -R CACCAGACAATGTAACCGCTG Stx2 - F ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG 584 Stx2 -R GCGTCATCGTATACACAGGAGC Uid - F GCGAAAACTGTGGAATTGGG 252 Uid - R TGATGCTCCATCACTTCCTG (Feng va Monday, 2000)
(2) Các thành phân của phản ứng PCR: (Feng va Monday, 2000)
Mỗi phan tng 1a 25 ul, gồm các thành phần sau: PCR buffer 1,1X; MgCl, 3mM;
m6i dNTP 200 uM; méi loai primer 7,5 pmol; Tag 2,5 wl; DNA 2 ul; va nuée cat vira
da 25 ul
(3) Chu ky nhiét (Feng va Monday, 2000)
- Tiền biến tính 95°C/5 phut - Biến tính 94”C/1 phút
-Ubat cap 61°C/1 phat | 25 chuky - Kéo đài 72°C/1 phut
Trang 233.3.5 Dién di, doc két qua
Lay 10 ul san pham PCR cing voi 2 ul loading dye được điện di trên gel agarose 1,6% trong TBE Thang chuẩn (ladder) cũng được điện di đồng thời Thời
gian điện di 30 — 35 phút ở 90 V và 250 mA
Sau khi điện di, gel được ngâm trong dung dịch cthidtum bromide khoảng 30
phút Sau đĩ rửa sạch bằng nước và chụp hình gel với tia UV bằng máy chụp gel (phần
Trang 24Phan 4 KET QUA VA THAO LUAN
4.1 Kết quả phát hiện các gen độc lực của E cø# phân lập được từ phân bị tiêu chảy
Kết quả phát hiện gen độc lực của Z coi trong từng nhĩm khuẩn lạc phân lập
được từ phân bị tiêu chảy được ghi nhận ở bảng 4.1
Trong 10 mẫu phân bị tiêu chảy cĩ 5/10 mẫu (50%) phát hiện Z coi mang gen
độc lực thuộc nhĩm stx Gen ehxA được phát hiện với tỉ lệ cao nhất (100%); kế đến là
síx2 (4/10 mẫu - 40%), sx7 (1/10 mẫu — 10%); va khơng phát hiện được gen uid va
eae Như vậy, phân bị tiêu chảy là nguồn lưu cữu STEC mang gen s/x2 Theo Paton và Paton (1998) đã nhận định rằng những dịng STEC mang síx2 thì thường liên kết bệnh nặng hơn so với những dịng STEC chỉ mang s/x7
Do kinh phí hạn chế, mỗi loại mơi trường phân lập chúng tơi chỉ chọn 2 khuân
lạc riêng lẻ nhưng cĩ kiểu hình giống nhau để xác định gen độc lực (li trích DNA từ
gốc khuẩn lạc riêng lẻ đã nhân và giữ gốc trên thạch NA), kết quả được trình bày ở bảng 4.2
Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy:
(1) Ở mẫu số 1, chọn 2 khuẩn lạc hồng roi rac (khuan lạc được đánh số thứ tự số 6 — HM6 va khuan lạc số 8 - HM8 trong nhĩm khuẩn lạc HM) trén thach MAC,
multiplex - PCR déu phat hién duoc gen stx2 Tuong ty, 2 khuẩn lạc hồng trên thạch
SMAC và 2 khuẩn lạc trắng trên thạch SMAC cũng đều mang gen s/x2 Tương tự, đối
với gen ehx⁄4 đều hiện diện cho mỗi khuẩn lạc riêng lẻ này
(2) Ở mẫu số 2, chọn 2 khuẩn lạc hồng TỜI rạc trên thạch MAC, multiplex - PCR đều phát hiện được gen ex4 nhưng khơng phát hiện được gen síz Tương tự, 2 khuẩn lạc trắng trên thạch SMAC chỉ phát hiện một mẫu mang gen ehxA lẫn síx2
(3) Đối với mẫu phân số 3, chọn 2 khuẩn lạc hồng rời rạc trên mơi trường MAC, 2 khuẩn lạc trắng trên SMAC, multiplex — PCR phat hién 100% E coli mang gen ehxA nhưng khơng cĩ gen s⁄x
Tĩm lại, nhĩm khuân lạc (gồm 6 — 10 khuẩn lạc) cĩ mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ đều mang gen độc lực đĩ Cho nên chọn từng khuẩn lạc
Trang 25được Nếu mục tiêu này khơng được đề cập thì việc thu hết các loại khuẩn lạc với các
kiểu hình khác nhau để phát hiện sự hiện diện các gen độc lực của Z coii trong mẫu
khảo sát là bước đi thích hợp
Trang 26Bảng 4.2 Kết quả phát hiện gen độc lực E cø# từng khuẩn lạc riêng lề ở phân bị tiêu chảy x Loai khuan lac, Gen độc lực Mau mơi trường eae | ehxA | stxl | stx2 | uid HM6 HM8 1 HS4 HS6 TS4 TS5 HMI 2 HM3 TSI TS2 HMI 3 HM3 TS3 TS7 + + 4+ 4+ + + + + + + + + + + + + + +.+
4.2 Kết quả phát hiện gen độc lực của E coi phân lập được từ phân heo con cai sữa tiêu chảy
Kết quả phát hiện gen độc lực của Z coii từ 9 mẫu phân heo cai sữa tiêu chảy được trình bày ở bảng 4.3
Bang 4.3 cho ta thay co 4/9 mau (44.4%) mang gen s/z, trong đĩ cĩ 1⁄2 mẫu mang gen s/x/ (25%) và 3⁄4 mẫu mang gen síx2 (75%), khơng cĩ mẫu nào mang gen uid va eae, 9/9 mau (100%) mang gen ehxA Blanco va ctv (1997) két lun rang gen
stxl thuong hién dién tỉ lệ thap trén heo
Cĩ 6/25 (24%) nhĩm khuẩn lạc được phân lập từ 9 mẫu phân heo cai sữa tiêu
chảy, cùng lúc mang 2 gen độc lực (ehx4 và sfx1 hoặc ehx4 và síx2) Điều này sẽ làm
tăng khả năng gây bệnh của Z cọi đơi với heo Người ở mọi lứa tuổi đều cĩ thể bị
Trang 284.3 Kết quả phát hiện các gen độc lực của Z cøii phân lập được từ phân bê tiêu chảy
Ban đầu, đề tài chỉ tiến hành cay T1a trực tiếp mẫu phân heo hoặc bị lên hai loại mơi trường MAC và SMAC để thu các nhĩm khuẩn lạc và phát hiện gen Hướng phân
lập E coli cĩ sử dụng PVC và CT - SMAC chỉ để áp dụng đối với mẫu bề mặt thịt
Tuy nhiên, qua thực tế khảo sát (9 mẫu phân heo tiêu chảy và 10 mẫu phân bị tiêu
chảy) cho thấy tần số phát hiện Z coi mang gen síx/ hiện diện với tỉ lệ thấp (10% ở
bị tiêu chảy và 11,1% ở phân heo cai sữa tiêu chảy), và chưa cĩ mẫu phân heo hay bị
tiêu chảy nào được tìm thấy eae và i4 Theo Paton và Paton (1998) thi E coli STEC địng O157 ít hơn 1% trong quan thé E coli Mat khac, ngoai E coli, trong phan con
cĩ sự hiện diện của nhiều lồi vi khuẩn khdc nhu Salmonella, Shigella,
Campylobacter, Staphylococcus aureus, Proteus Vi vay, dé tang kha nang phat hién những dịng E coli STEC mang gen gây độc từ phân bê tiêu chảy, chúng tơi tiến hành phân lập theo hướng cĩ sử dụng mơi trường tăng sinh chọn lọc và mơi trường thạch
chọn lọc chuyên biệt CT - SMAC Kết quả phát hiện gen độc lực được ghi nhận cụ thé
ở bảng 4.4
Trong 8 mẫu phân bê tiêu chảy, cĩ 8/8 mau (100%) phát hiện được Z coii
mang ít nhất 1 gen độc lực, cĩ mẫu phát hiện Z coii mang 2 -3 gen độc lực Gen ejx4
được phát hiện với tỉ lệ cao nhất (8/8 mẫu — 100%), ké dén 1a gen st, (7/8 mau —
87,5%), gen s/x2 (1/8 mẫu - 12,5%) Trong khi đĩ, khơng phát hiện được gen uid
trong bất kì mau nao Smith va Scotland (1988) va Gyles (1992) cho rằng nhiều loại
gia súc mang STEC khơng cĩ biểu hiện triệu chứng, một vài dịng STEC cĩ khả năng
gây tiêu chảy cho bị, đặc biệt là bê Và 7/8 (87,5%) mẫu đều hiện diện cá gen ejx4 và
stx Theo Barrett và ctv (1992), độc tố Stx là điều kiện cần chứ chưa phải là điều kiện
đủ để gây bệnh tiêu chảy trên vật nuơi Do đĩ, sự xuất hiện đồng thời các gen ehx4 và
síx cĩ thể gĩp phần giải thích ly do tiêu chảy trên bê Feng và Monday (2000) cho biết
Trang 29Bang 4.4 Kết quả phát hiện gen độc lực của £ coli trong tirng nhĩm khuẩn lạc ở phân bê tiêu chảy x Loại khuẩn lạc, Gen độc lực Mau 7 mơi trường eae | chxA | sứxl | síx2 | mỉd 1 HM _ + _ _ _ TS _ + _ _ _ HM _ _ _ _ _ 2 HS _ + _ _ _ HCT _ — + _ _ HM _ _ _ _ _ 3 HS _ + + _ _ TCT _ _ _ _ _ HM _ + _ _ _ 4 HS _ + + _ _ HCT _ _ + _ _ HM _ _ _ _ _ 5 HS _ + + _ _ TCT _ _ _ _ _ HM _ + _ _ _ 6 HS _ + + _ _ HCT _ _ + _ _ 7 HCT _ + + + _ 8 HM _ + + _ _ HS _ + + _ _
4.4 Két qua phat hién gen doc luc cia E coli phan lap dugc tir bé mat thit bd Trong quá trình giết mồ, Z coj¡ từ phân đễ dàng vấy nhiễm lên nền sàn, dụng cu giết mơ, nước sử dụng, phương tiện vận chuyên Do đĩ, nếu qui trình giết mo gia
súc, vận chuyên và phân phối thịt khơng tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện vệ sinh thì
nguy cơ vay nhiễm Z cọ¡ từ phân vào thịt đễ dàng xảy ra Phân gia súc là nguồn chủ
yếu chứa E coli O157:H7, và thịt heo cũng cĩ thể là một nguồn lay nhiém (Doyle,
Trang 30nên cảm nhiễm do ăn phải thức ăn bị nhiễm STEC trong do tiếp xúc trực tiếp với STEC tir déng vat (Renwick va ctv, 1993) Người bị nhiễm STEC cĩ thể tiêu chảy
trong trầm trọng hơn như HC và HUS (Karmali, 1989)
Và dé bước đầu tầm sốt các gen độc lực của E coi STEC trong thực phẩm,
chúng tơi tiến hành khảo sát bề mặt thịt bị, vì hầu hết các trường hợp ngộ độc thực
phẩm là do người ăn phải thịt bị trong các sản phẩm cĩ nguồn gốc từ thịt bị bị nhiễm
E coli nhom STEC (Keskimaki, 2001)
Kết quả phát hiện các gen độc lực của 9 mẫu E coli phan lap tir thit bd duge
ghi nhận ở bảng 4.5
Trong 9 mẫu bề mặt thịt bị khảo sát, khơng cĩ mẫu nào phát hiện được E coli cĩ mang gen độc lực Nếu nĩi về khía cạnh ngộ độc thực phẩm thì kết quả này thật sự đáng mừng Điều này hồn tồn hợp với luật pháp khơng cho phép STEC hiện diện trong thực phẩm (Paton và Paton, 1998) Tuy nhiên, nguyên nhân của sự vắng mặt những dịng È col¡ mang gen độc lực được phân lập từ thịt bị cĩ thê đo:
" Số mẫu khảo sát cịn ít nên chưa đủ để phát hiện các gen độc lực
Trang 314.5 Tơng kết kết quả phát hiện gen độc lực của E cøii trên các mẫu khảo sát cĩ nguồn gốc từ bị và heo
Tĩm lại, trong khảo sát này, 2 đối tượng gia súc được chọn khảo sát là bị và heo Ở bị, chúng tơi khảo sát trên ba loại mẫu: phân bê tiêu chảy, phân bị tiêu chảy và
bề mặt thịt bị vì như Beutin và ctv (1995) đã nhận định rằng những dịng STEC
thường hiện diện trong phân của lồi nhai lại Trên heo, phân heo cai sữa tiêu chảy được tập trung khảo sát vì tính nhạy cảm của lứa tuổi này với nhĩm STEC
Khảo sát 36 mẫu, gồm 8 mẫu phân bê tiêu chảy, 10 mẫu phân bị tiêu chảy, 9
mẫu phân heo tiêu chảy và 9 mẫu bề mặt thịt bị, kết quả phát hiện gen độc lực của È
coli tir các mẫu khảo sát trên được tổng hợp ở bảng 4.6
Như vậy, trong 36 mẫu khao sat cé 16 mau phat hién E coli mang gen độc lực
của nhĩm STEC, chiếm tỉ lệ 44,4%
Gen ehx4 được phát hiện với tỉ lệ rat cao (75%) Hau hét cdc dong STEC 0157 và các dịng STEC khơng thuộc O157 đều sản sinh độc tố gây dung huyết EhxA
(Paton và Paton, 1998) Theo Stephan và Hoelzle (2000), STEC mà khơng mang gen
ehxA thì độc lực sẽ giảm và thậm chí khơng độc đối với người
Tần số hiện diện gen s/x/ và s/x2 lần lượt là 9/36 mẫu (25%) và 8/36 mau (22.2%)
Khơng phát hiện được gen eae va i2 trong các mẫu khảo sát Điều này cĩ thể được giải thích do các primer Eae chỉ gắn vào đoạn gen eae chuyên biệt tạo dạng protein y-intimin (Feng và Monday, 2000) Protein này cĩ chủ yếu ở các serotype O157:H7 và O55:H7 mà thơi Các serotype này hiện diện rất ít trong mẫu phân cũng như thực phẩm Beutin và ctv (1995) đã nghiên cứu và kết luận rằng chỉ cĩ 3/208 (1,4%) khuẩn lạc STEC cĩ nguồn gốc từ phân của động vật đương tính với eze Theo Wang va ctv (2002), gen ehx4 cĩ khả năng gây bệnh cao hơn Và lại, theo Jerse va ctv
(1990), intimin do gen eae mã hĩa là điều kiện cần chứ khơng phải là điều kiện đủ để
gây sự tốn thương kiểu A/E
Tĩm lại, tuy đã phát hiện một số Z coii thuộc nhĩm STEC nhưng vẫn chưa phát hiện bất kì dịng FE coli O157:H7 Boi vì, những vụ bộc phát bệnh do STEC khơng
Trang 32Bang 4.6 Tống kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E coi nhĩm STEC
trên 36 mẫu khảo sát Gen độc lực Nguồn gốc N (+) eae | ehxA | stxl | stx2 uid Phan bo 10 5 0 10 1 4 0 tiêu chảy (%) 50,0 0,0 100,0 | 10,0 40,0 0,0
Phân heo cai 9 4 0 9 1 3 0
sữa tiêu chảy | (%) 44,4 0,0 100,0 | 11,1 33,3 0,0 Phân bê 8 7 0 8 7 1 0 tiêu chảy (%) 87,5 0,0 100,0 | 87,5 12,5 0,0 ` 9 0 0 0 0 0 0 Bé mat thit bo (%) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2 7 36 16 0 27 9 8 0 Tong cong (%) 44,4 0 75 25 22,2 0
N: sơ lượng mẫu khảo sát
(+): số lượng mẫu phát hiện cĩ mang gen độc lực của £ coli nhĩm STEC Tỉ lệ (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ede ehxA stxl 'Gen độc lực stx2 ui
OB Phan bé tiéu chay Phân heo cai sữa tiêu chảy
El Phân bị tiêu chảy
H Thịt bị
Trang 33
Tl PBI Laddsr Pb7 EDL933 Phi six2 (S84 bạ) eae (397 bn} ‘stxl (348 bp) id (252 bp) ehxA (158 bp)
Hinh 4.1 Két qua dién di san pham multiplex - PCR
T1: mẫu thịt s6 1; P.B1: mau phan bo tiéu chay s6 1; Ladder: thang chuan; P.b7: mau phan bé tiéu chay s6 7; EDL933: đối chứng dương; P.h1: mẫu phân heo cai sữa tiêu
Trang 34Phan 5 KET LUAN VA DE NGHI
5.1 Két luan
Từ những kết quả thu nhận được trong quá trình thực hiện đề tai, chúng tơi rút ra những kết luận sau:
(1) E coli trên mơi trường thạch MAC chỉ xuất hiện 1 loại khuẩn lạc hồng (HM),
trên mơi trường thạch SMAC xuất hiện 2 loại khuân lạc trắng (TS) và hồng (HS), trên mơi trường thạch CT - SMAC cũng xuất hiện 2 loại khuẩn lạc trắng
(TCT) và hồng (HCT)
(2) Nhĩm khuẩn lạc cĩ mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ cĩ mang gen độc lực đĩ
(3)100% mẫu phân tiêu chảy đều cĩ E coli mang gen dung huyết ehx4 Tần số
phát hiện gen stx của E coj¡ phân lập được trong mẫu phân bị, heo và bê tiêu chảy lần lượt là: 50%; 44,4% và 100%
(4) 9 mẫu bề mặt thịt bị chưa phát hiện được gen độc lực của E coli
(5) Chưa phát hiện được gen wid va eae trong 27 mau phan tiéu chay cia bo, bé va
heo; và 9 mẫu bề mặt thịt 5.2 Tồn tại và đề nghị
s* TỒn tại
Do điều kiện thời gian và kinh phí cĩ hạn, dé tài cịn cĩ một số tỒn tại sau: (1) Chưa phát hiện và phân lap dugc serotype E coli O0157:H7
(2) Chưa tơ chức khảo sát được việc phát hiện các gen độc lực cua E coli trén cac
mơi trường phân lập MAC, SMAC, CT - SMAC
% Đề nghị
(1) Cĩ thể ứng dụng kỹ thuật multiplex - PCR để phát hiện gen độc lực của những
địng E coi gây bệnh trong chân đốn bệnh và kiểm tra vệ sinh an tồn thực phẩm, đặc biệt trong các trường hợp xảy ra dịch bệnh
(2) Tăng số lượng mẫu khảo sát, định serotype các khuẩn lạc riêng lẻ bằng kháng
huyết thanh chuẩn
(3) Thay đối mơi trường tăng sinh để tăng khả năng phát hiện E coi O157:H7
Trang 36TAI LIEU THAM KHAO
PHAN TIENG VIET
1 Bộ mơn vi sinh — Khoa Y - Đại học Y Dược TP.HCM, 1996 ƒ¡ khuẩn học Trang 123 - 130 Tran Thi Dan, 2001 Lieu y về PCR Tài liệu giảng dạy Trường Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh Hé Huynh Thuy Duong, 1998 Sinh hoc phân f Nhà xuất bản giáo dục TP HCM 30]1trang
Lé Thi Mai Khanh, 2004 Phat hién một số gen déc luc cua Escherichia coli phan lap dugc tu phan va thit bd, heo bang kf thuat multiplex - PCR Luan van Thac sỹ Nơng nghiệp Trường Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh
PHAN TIENG NUOC NGOAI 5
10
Barrett T J Kaper L P., Jerse A E., and Wachsmuth I K., 1992 Virulence factors in Shiga-like toxin producing Escherichia coli isolated from humans and cattle J Infect Dis 165: 970 - 980
Bauer M E., and Welch R A., 1996 Characterization of an RTX toxin from enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Infect Immun 64: 167 - 175 Beutin L., Montenegro M A., Orskov I., Orskov F., Prada J., Zimmermann S.,
and Stephan R., 1989 Close association of verotoxin (Shiga-like toxin) production with enterohemolysin production in strains of Escherichia coli J Clin Microbiol, 27: 2559 - 2564
Beutin L., Geier D., Zimmermann S., and Karch H., 1995 Virulence markers of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli strains originating from healthy domestic animals of different species J Clin Microbiol 33: 631- 635
Blanco M., Blanco J E., Gonzalez E A., Mora A., Jansen W., Gomez T A T., Zerbini L F., Yano T., de Castro A F P., and Blanco J., 1997 Note: Genes coding for enterotoxins and verotoxins in porcine Escherichia coli strains belonging to different O:K:H serotypes: relationship with phenotype J Clin Microbiol 35: 2958 - 2963
Botteldoorn N., Heyndrick M., Rijpens N., Herman L., 2003 Detection and
characterization of verotoxigenic Escherichia coli by a VTEC/EHEC multiplex
PCR in porcine faeces and pig carcass swabs Research in Microbiology 154:
Trang 3711 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Calderwood S B., Acheson D W K., Keusch G T., Barret T J., Griffin P M., Strockbine N A et al, 1996 Proposed new nomenclature for SLT (VT) family
ASM News 62: 118 - 119
Cebula T A., Payne W L., and Feng P., 1995 Simultaneous Identification of Strains of Escherichia coli Serotype 0157:H7 and Their Shiga — Like toxin Type by Mismatch Amplification Mutation Assay — Multiplex PCR J Clin Microbiol 33: 248 - 250
Cerna J F., Nataro J P., and Teresa Estrada Garcia, 2003 Multiplex PCR for
detection of three plasmide borne genes of enteroaggregative Escherichia coli strains J Clin Microbiol 41: 2138 - 2140
Chalmer R M., Salmon R L., Willshaw G A., Cheasty T., Looker N., Davies I.,
and Wray C., 1997 Verocytotoxin-producing E coli O157 in a farmer handing horses Lancet 349: 1816
Dogan H B., Kluleasan H., Cakin I., va Hallemam A K., 2003 Evaluation of increased incubation temperature va cefixime — telluride treatment for the isolation of Escherichia coli O0157:H7 from minced beef J Food Microbiology 87:29 -34,
Donnenberg M S., Tzipori S., McKee M L., O’Brien A D., Alroy J., and Kaper
J B., 1993 The role of the eae gen of enterohemorrhagic Escherichia coli in intimate attachment in vitro and in a porcine model J Clin Invest 92: 1418 -
1424
Doyle M P., 1991 Escherichia coli O157:H7 and its significance in foods International J of Food Mic 12: 289 - 302
FAO, 1992 Microbiological analysis in the food control laboratory
FDA, 2002 “Diarrheagenic Escherichia coli’, Bacteriological Analytical manual Online, CFSAN September 2002
<http:// vm.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-4a.htmÌl>
Feng P., Lample KA, 1994 Genetic analysis of widA expression in enterohaemorrhagic Escherichia coli serotype O157:H7 Microbiology 140: 2101- 2107
Feng P and Monday S., 2000 Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes Molecular and Cellular Probes 14: 333 - 337
Fujisawa T., Sata S., and Aikawa K., 2002 Evaluation of sorbitol-salicin
Trang 3823 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 for isolation of Escherichia coli O157:H7 from raw vegetables J Food Mic 74: 161 - 163
Gyles C L 1992, Escherichia coli cytotoxins and enterotoxins Can J Microbiol 38: 734 - 746 Jay J M., 2000 Modern food Microbiology An Aspen publication, Maryland p
531 - 543,
Jerse A E., Yu J., Tall B D., and Kaper J B., 1990 A genetic locus of
enteropathogenic Escherichia coli necessary for the production of attaching and effacing lesions on tissue culture cells Proc Natl Acad Sci USA 87: 7839 — 7843 Foster J W., 2004 Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile http://www.southalabama.edu/microbiology/foster.html Karmali M A 1989 Infection by verotoxin-producing Escherichia coli Clin Microbiol Rev 2: 15 - 38
Keene W E., McAnulty J M., Hoesly L P., Williams Jr., Hedberg K., Oxman G
L., Barrett T J., Pfaller M A., and Fleming D W., 1994 A swimmuing-
associated outbreak of hemorrhagic colitis caused by Escherichia coli 0157:H7 and Shigella sonnei N Engl J Med 331: 579 - 584
Keskimaki M., 2001 Shiga toxin-producing and other diarrhoeagenic Escherichia coli in Finland: pheno- and genotypic epidemiology Academic dissertation The Faculty of Agriculture and Forestry of the University of Helsinky, Finland p 15 - 18
Kim H H., 1994 Characteristics of antibiotic-resistant Escherichia coli 0157:H7 in Washington State, 1984-1991 J Infect Dis 170: 1606-1609
Konowalchuk J., Speirs J I., and Stavric S., 1977 Vero response to a cytotoxin of
Escherichia coli Infect Immu 18: 775 - 779
Law D., and Kelly J., 1995 Use of heme and hemoglobin by Escherichia coli O157 and other Shiga-like-toxin-producing E coli serogroups Infect Immun 63: 700 - 702
Levine M M., Xu J., Kaper J B., Lior H., Prado V., Tall B., Nataro J., Karch H., and Wachsmuth I K., 1987 A DNA probe to identify enterohemorrhagic
Trang 3934 35 36 37 38 39 40 41 42 43 AA
Leyer G J., Wang L., and Johnson E A., 1995 Acid adaptation of Escherichia coli O157:H7 increases survival in acidic foods Appl Environ Microbiol 61: 3752 - 3755
Lingwood C A 1996 Role of verotoxin receptors in pathogenesis Trends Microbiol 4: 147 - 153
Mainil J G., and Daube G., 2005 Verotoxigenic Escherichia coli from animals,
humans and foods: who’s who ? Joumal of Applied Microbiology Rev 98: 1332 - 1344
Monday S., Whittam T., and Feng P., 2001 Genetic and Evolutionary Analysis of Mutations in the gusA Gene That Cause the Absence of béta-Glucuronidase Activity in Escherichia coli 0157:H7 The Journal of Infectious Diseases 184: 918 -21
Nataro J P and Kaper J P., 1998 Diarrheagenic Escherichia coli Clin Microbiol Rev 11: 142 — 201
O’Brien A D., Newland J W., Miller S F., Holmes R K., Smith H W., and
Formal S B., 1984 Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli
strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea Science 226:694-696
Oswald E., Schmidt H., Morabito S., Karch H., Marches O., va Caprioli A., 2000
Typing of Intimin Genes in Human and Animal Enterohemorrhagic and Enteropathogenic Escherichia coli : characterization of a New Intimin Variant
Infection and Immunity 68: 64 - 71
Paton A W., Ratcliff R., Doyle R M., Seymour-Murray J., Davos D., Lanser J
A., and Paton J C., 1996 Molecular microbiological investigation of an outbreak of hemolytic uremic syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin-producing Escherichia coli J Clin Microbiol 34: 1622 — 1627
Paton J C And Paton A W., 1998 Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-
producing Escherichia coli infection Clin Microbiol Rev 11: 450 - 479
Renwick S A., Wilson J B., Clarke R C., Lior H., Borcyk A A., Spika J., Rahn K., McFadden K., Brouwer A., Anderson N G., Alves D., and Karmali M A., 1993 Evidence of direct transmission of Escherichia coli O157:H7 infection between calves and a human J Infect Dis 168: 792 — 793
Sandhu K S., Clarke R C., McFadden K., Brouwer A., Louie M., Wilson J., Lior
H., and Gyles C L., 1996 Prevalence of the eaeA gene in verotoxigenic Escherichia coli strains from dairy cattle in Southwest Ontario Epidemiol
Trang 4045 46 47 48 49 50 51
Smith H R., and Scotland S M., 1988 Vero cytotoxin-producing strains of Escherichia coli J Med Microbiol 26:77 - 85
Smith H R., and Scotland S M., 1993 Isolation and identification methods for Escherichia coli O157 and other Vero cytotoxin producing strains J Clin Pathol 46: 10 - 17
Stephan R., and Hoelzle L E., 2000 Characterzation of shiga toxin type 2 variant B-subunit in Escherichia coli strains from asymptomatic human carriers by PCR-RFLP Lett Appl Mic 31: 139 - 142
Tzipori S., Karch H., Wachsmuth I K., Robins-Browne R M., O’Brien A D.,
Lior H., Cohen M L., Smithers J., and Levine M M., 1987 Role of a 60-MDa
plasmid and Shiga-like toxins in the pathogenesis of infection caused by
enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 in gnotobiotic piglets Infect Immun 55; 3117 - 3125
USA Department of Agriculture’s Food safety and Inspection Service, 2004
http://www fsis.usda.gov
Wang G., Clark C G., and Rodgerst F G., 2002 Detection in Escherichia coli of the genes defining the O157:H7 serotype, and components of the type 2 shiga toxin family by Multiplex PCR J Clin Microbiol 40: 3613 - 3619
Waterman S R., and Small P L., 1996 Characterization of the acid resistance
phenotype and rpoS alleles of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli