PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC MÃ HÓA CÁC PROTEIN GÂY ĐỘC CỦA E.COLI BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR

Báo cáo CNSH ĐỀ TÀI: PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC MÃ HÓA CÁC PROTEIN GÂY ĐỘC CỦA E.COLI BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR Nhóm: Nguyễn Thị Ngọc Hương Nguyễn Minh Hoài Trần Thị Kim Hoàn Phan Thị Hồng Nhung Nội dung báo cáo Giới thiệu Tổng quan Phương pháp Kết - Thảo luận Giới thiệu Tổng quan Vi khuẩn E.Coli:  Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia E coli trực khuẩn Gram (-), di động, kích thước khoảng – x 0,5 ìm, khơng hình thành bào tử có giáp mơ E coli có mặt thường xun chiếm ưu ruột người động vật máu nóng, phần cuối ruột non ruột già, xem vi khuẩn danh ô nhiễm thực phẩm nước đánh giá dựa số lượng chúng   Tổng quan Nuôi cấy đặc điểm sinh hóa :  E coli vi khuẩn hiếu khí yếm khí tùy ý  T op = 35 – 370C, pHop = 6.4 – 7,5  Sau 24 mọc môi trường thạch dinh dưỡng hình thành khuẩn lạc dạng S màu xám trắng, trịn, ướt, bề mặt bóng, kích thước khoảng – mm Mt EMB: E coli cho khuẩn lạc tím ánh kim Mt MacConkey: E coli cho khuẩn lạc đỏ hồng Mt thạch nghiêng TSI: E coli tạo acid / acid (vàng / vàng) E.Coli môi trường EMB E.Coli môi trường thạch MacConkey Tổng quan Yếu tố kháng nguyên :  Kháng nguyên thân O (somatic antigen):  Kháng nguyên lông H (flagellar antigen):  Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen):  Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): Tổng quan Phân loại E.Coli :  STEC (Shiga toxin-producing E coli) VTEC (Verotoxigenic E coli) EHEC (Enterohaemorrhagic E coli)  EPEC (Enteropathogenic E coli)  ETEC (Enterotoxigenic E coli)  EAggEC hay EAEC (Enteroaggregative E coli)  EIEC (Enteroinvasive E coli) Tổng quan Cơ chế chung khả gây tiêu chảy E coli:  Yếu     tố gây bệnh : Cư trú màng nhầy Kháng sư phòng vệ vật chủ Nhân lên Gây tổn hại cho vật chủ  Cơ chế gây bệnh :  Sản xuất độc tố (ETEC, EAEC, STEC)  Tấn công / xâm lấn (EIEC)  Bám dính, truyền tín hiệu qua màng (EPEC EHEC) Kết Kết  Tổng số vk E coli trung bình thịt bị 14,8*104 ± 4,2*104 MPN/g biến thiên từ 1,1*104 đến 35*104 MPN/g Tổng số E coli trung bình thịt heo 0,4*104 ± 1,1*104 MPN/g, biến thiên từ 0,4*102 đến 4,5*104 MPN/g  Tiêu chuẩn TCVN 7046 – 2002 : gam thịt tươi có ≤ 100 vk ☺ khơng có mẫu thịt bị đạt TCVN ☺ 6/23 mẫu thị heo đạt TCVN> Kết Trên thị bò : Kết Trên thịt heo : Thảo luận  Qui trình định lượng E coli có giai đoạn ni cấy 44,50C khơng thích hợp cho nhóm E coli gây bệnh phát triển nên khơng phát gen độc lực 31 mẫu thịt bị, heo  Mơi trường tăng sinh chọn lọc CT-SMAC tạo điều kiện cho nhóm STEC/EHEC thịt phát triển tốt, trợ giúp cho việc chọn khuẩn lạc để phát gen độc lực Tỉ lệ phát gen độc lực E coli từ thịt bò thịt heo 61,8% 24,5%  Chưa phát gen lt-I E coli 34 thịt bò, 49 thịt heo Đề nghị  Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán bệnh kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm  Vệ sinh quản lý tốt sở chăn nuôi nhằm ngăn ngừa bệnh tiêu chảy, phù thủng heo  Tuân thủ nghiêm ngặt qui định vệ sinh trình giết mổ gia súc Hóa chất điện di TBE (0,5 X) Tris HCl 3,94 mg Acid Boric 1,39 g Na2EDTA 93,06 mg Nước cất vừa đủ 500 ml pH = 8,3 với NaOH 0,1N Agarose (2%) Loading dye Bromophenol blue 0,25% Sucrose 40% TE 1X vừa đủ 100% Hóa chất điện di  TBE (0,5 X)  Tris HCl 3,94 mg  Acid Boric 1,39 g  Na2EDTA 93,06 mg  Nước cất vừa đủ 500 ml  pH = 8,3 với NaOH 0,1N  Agarose (2%)  Loading dye  Bromophenol blue 0,25%  Sucrose 40%  TE 1X vừa đủ 100% Các môi trường thuốc thử  LTB  Trypticase/ Tryptone  EC  Tryptone 20 g  Lactose 5g  Bile salt mixture 1,5g  Dipotassium phosphate g  Monopotassium phosphate 20g  NaCl 5g  Lactose 5g  K2HPO4 2,75g  KH2PO4 2,75g 1,5g  Sodium lauryl sulphate  Sodium chloride 5g 0,1g  Nước cất vừa đủ 1.000 ml  Nước cất vừa đủ 1.000  PH = 6,9 ± 0,2 (25oC) ml  pH = 6,8 ± 0,1 Các môi trường thuốc thử  EMB  Peptone 10 g  Lactose g  Sucrose 5g  Dipotassium phosphate 2g  Agar 13,5g  Methyl blue 0,065g  Eosin Y 0,4 g  Nước cất vừa đủ 1.000 ml  pH = 7,2± 0,2 (25oC) Các môi trường thuốc thử  NA  Peptone 5g  Sodium chloride 5g  Beef Extract 1,5g  Yeast Extract 1,5g  Agar 15g  Nước cất vừa đủ 1.000 ml  pH = 7,4 ± 0,2 (25oC)  Nước peptone đệm  Peptone 10 g  Sodium chloride 5g  Disodium hydrogen phosphate g  Potassium dihydrogen phosphate 1,5g  Nước cất vừa đủ 1.000 ml  pH = Các môi trường thuốc thử  SIMMON CITRAT  Na citrate g  NaCl g  K2HPO4 g  NH4H2PO4 g  MgSO4 0,2 g  Bromothymol blue 0,08 g  Agar 15 g  Nước cất vừa đủ 1.000 ml  MR – VP  Peptone g  Glucose g  K2HPO4 g  Nước cất vừa đủ 800 ml  Ph = 6,9 ± 0,2 Các môi trường thuốc thử  Thuốc Thử  VP (Voges Proskauer) • Dung dịch A:  Alpha naphthol 5g  Ethanol tuyệt đối 100 ml • Dung dịch B:  Potassium hydroxyde 40 g  Nước cất 100 ml  MR (Methyl red)  Methyl red 0,1 g  Alcohol 300 ml  Nước cất vừa đủ 500 ml   ... Kháng nguyên thân O (somatic antigen):  Kháng nguyên lông H (flagellar antigen):  Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen):  Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): Tổng quan Phân loại E.Coli... STEC (Shiga toxin-producing E coli) VTEC (Verotoxigenic E coli) EHEC (Enterohaemorrhagic E coli)  EPEC (Enteropathogenic E coli)  ETEC (Enterotoxigenic E coli)  EAggEC hay EAEC (Enteroaggregative... gen độc lực 31 mẫu thịt bị, heo  Mơi trường tăng sinh chọn lọc CT-SMAC tạo điều kiện cho nhóm STEC/EHEC thịt phát triển tốt, trợ giúp cho việc chọn khuẩn lạc để phát gen độc lực Tỉ lệ phát gen