ứng dụng kỹ thuật multiplex – pcr để phát hiện một số gen độc lực của nhóm escherichia coli sản sinh độc tố shiga (stec) phân lập được từ phân bò, heo tiêu chảy và thịt bò

ứng dụng kỹ thuật multiplex – pcr để phát hiện một số gen độc lực của nhóm escherichia coli sản sinh độc tố shiga (stec) phân lập được từ phân bò, heo tiêu chảy và thịt bò

Phần 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Escherichia coli (E coli) là một trong những vi khuẩn phổ biến trong đường tiêuhóa của người và động vật máu nóng Hầu hết các dòng E coli tồn tại một cách tự

nhiên và không gây hại trong đường tiêu hóa Tuy nhiên, trong một số trường hợp,

nhất là khi sinh lý cơ thể thay đổi, stress, loạn khuẩn xảy ra, …thì một số dòng E coli

độc có thể gây bệnh trên người và một số loài động vật

Dựa vào đặc điểm gây bệnh, người ta chia E coli thành nhiều nhóm Mỗi nhóm

đều có những yếu tố độc lực khác nhau và được quy định bởi những gen độc lực khác

nhau Một số gen độc lực quan trọng của E coli như: gen ehxA, stx1, stx2, và uid củanhóm STEC (Shiga toxigenic E coli); gen eae của nhóm STEC và EPEC(Enteropathogenic E coli); …

Nhìn chung, E coli có thể được phân lập dễ dàng ở khắp nơi trong môi trường ônhiễm phân Ngoài ra, E coli còn có thể phân lập được từ những vùng nước ấm,

không bị ô nhiễm hữu cơ; vi sinh vật này có thể tồn tại và phát triển rất lâu trong môi

trường Với sự phân bố rộng rãi như vậy, E coli dễ dàng vấy nhiễm vào nguyên liệu

thức ăn hay nguồn nước nếu quy trình sản xuất không đảm bảo vệ sinh nghiêm ngặt.Từ đó, có thể gây nên các bệnh rối loạn đường tiêu hóa, và nhiễm trùng đường tiếtniệu, có trường hợp gây tử vong cho người và gia súc.

Do vậy, việc xác định các gen độc lực của E coli trong phân gia súc bình

thường hoặc tiêu chảy là cần thiết, góp phần trong việc chẩn đoán bệnh trên động vậtvà đánh giá nguy cơ truyền lây sang người qua con đường thực phẩm Từ đó, có nhữngbiện pháp phòng ngừa hữu hiệu nhằm bảo vệ sức khỏe cho con người và vật nuôi.Những tiến bộ của công nghệ sinh học hiện nay với phương pháp PCR sẽ giúp chúngta chẩn đoán chính xác, hiệu quả trong thời gian ngắn hơn so với phương pháp truyềnthống (nuôi cấy, phân lập, …) Vì vậy, đề tài tiến hành sử dụng kỹ thuật multiplex –

PCR để phát hiện đồng thời các gen độc: stx1, stx2, eae, ehxA, và uid của E coli phân

lập được từ phân bò, heo tiêu chảy và thịt bò Hy vọng trong tương lai, đề tài sẽ đượcứng dụng vào thực tiễn chẩn đoán và tầm soát bệnh cho gia súc cũng như cho conngười qua con đường thực phẩm.

1.2 Mục tiêu – yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu

- Phát hiện gen độc lực stx1, stx2, eae, ehxA và uid của E coli, đặc biệt là nhóm

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vi khuẩn E coli

Vi khuẩn E coli sống bình thường trong ruột người và động vật, nhiều nhất

trong ruột già Vi khuẩn theo phân ra môi trường bên ngoài gây ô nhiễm cho nước, đất,không khí, dụng cụ giết mổ, các nguyên liệu sử dụng trong chế biến thực phẩm, …

2.1.1 Đặc điểm sinh học

Phân loại: vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia.

Hình thái: là trực khuẩn, gram âm, di động, không bào tử, giáp mô, có lôngtơ xung quanh.

Kích thước: khoảng 0,5 m  2 – 3 m.

Đặc tính nuôi cấy: vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi Có thể sinhtrưởng ở nhiệt độ 15 - 400C nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 370C, pH từ 6,4 – 7,4.Mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạctròn, ướt, trắng đục, khoảng 2 – 3 mm

Đặc tính sinh hóa: E coli lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitratethành nitrite Để phân biệt E coli với vi khuẩn đường ruột khác, người ta thường sửdụng thử nghiệm IMViC E coli cho kết quả IMViC là: + + - - hay - + - - (FAO,

2.1.2 Yếu tố kháng nguyên

Vi khuẩn đường ruột E coli có cấu trúc kháng nguyên phức tạp Dựa vào tính

chất kháng nguyên, người ta phân chia các vi khuẩn cùng loại thành các tuýp huyếtthanh (serotype) khác nhau (Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp Hồ ChíMinh, 1996):

Kháng nguyên thân O (somatic antigen) là kháng nguyên của vách tế bào,cấu tạo bởi lipopolysaccharide, có trên 150 loại khác nhau Đặc tính của kháng nguyênO là:

 Chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100oC trong 2 giờ. Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%.

 Bị hủy bởi formol 5%.

 Rất độc, chỉ cần 0,05 mg đủ để giết chuột nhắt sau 24 giờ.

Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứngngưng kết O Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh củadòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ.

Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có trên 50 loại khác nhau, cấu tạobởi protein và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase,không bị hủy bởi formol 5% Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy rahiện tượng ngưng kết H.

Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): có hơn 100 loại khác nhau vànằm ngoài kháng nguyên O Kháng nguyên K là polysaccharide hay là protein Nếukháng nguyên K che phủ hoàn toàn thân vi khuẩn thì sẽ ngăn cản phản ứng ngưng kết

O Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen) giúp E coli bám vào tế bào biểu mô

trước khi xâm lấn đường tiêu hóa hay đường tiết niệu

Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): có dạng hình sợi, dài khoảng 4m, thẳng hay xoắn, đường kính 2,1 – 7 nm, giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạcruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn

Hiện nay có hơn 700 tuýp huyết thanh của E coli từ sự tổ hợp các nhóm kháng

nguyên O, H, K, F Dựa vào đó, người ta có thể định danh vi khuẩn.

2.1.3 Phân loại E coli

Để phân loại E coli gây bệnh, người ta dựa vào đặc điểm sinh bệnh như: gen

độc lực mã hóa các protein gây bệnh cho vật chủ, sự tác động khác nhau lên màng

nhầy ruột, hội chứng lâm sàng và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh Có 5 nhóm E.coli gây bệnh (Keskimaki, 2001):

(1) E coli sinh độc tố Shiga (STEC- Shiga toxigenic E coli hay Verotoxigenic E coli và EHEC Enterohemorrhagic E coli ).

VTEC-(2) E coli gây bệnh đường ruột (EPEC- Enteropathogenic E coli).

(3) E coli sinh độc tố đường ruột (ETEC- Enterotoxigenic E coli).

(4) E coli bám dính kết tập ở ruột (EAEC hay EaggEC- Enteroaggregative E.coli).

(5) E coli tấn công hay xâm lấn đường ruột (EIEC- Enteroinvasive E coli).

2.2 Shiga toxigenic E coli (STEC)

Nhóm STEC được kết tội là liên quan đến nhiều đợt dịch bệnh viêm dạ dày, đãvà đang đe dọa sức khỏe cộng đồng Vào những năm đầu thập niên 1980, các dòngSTEC gây ra những đợt dịch liên quan đến hội chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC)và hội chứng huyết niệu (HUS) HUS biểu hiện ba triệu chứng điển hình là suy thậncấp, giảm tiểu cầu và thiếu máu tan huyết do tổn thương mao mạch Bao gồm nhiềuserotype khác nhau như O26, O111, O113, O124, O145, O157, … (Bộ môn vi sinh,Khoa Y, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh, 1996) Hiện nay, người ta công nhận cácdòng STEC gây bệnh nghiêm trọng cho con người, đặc biệt O157:H7 là serotype chínhcủa STEC gây nhiều ổ dịch lớn trên khắp thế giới (Smith và ctv, 1988)

2.2.1 Thuật ngữ

Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những thuật ngữ khác nhau

để gọi tên cho nhóm E coli này Thuật ngữ Verotoxigenic E coli hayVerocytotoxigenic E coli (VTEC) được Konowalchuk và ctv (1977) đặt cho nhóm

này khi phát hiện việc sản xuất độc tố gây độc dòng tế bào Vero (ở thận khỉ mặt xanh

châu Phi) Thuật ngữ Enterohemorrhagic E coli ( EHEC) chỉ những dòng E coli gâyHC và HUS (Nataro và Kaper, 1998) Và thuật ngữ Shiga toxin-producing E coli(STEC) chỉ những serotype E coli sản sinh độc tố gây độc tế bào giống như độc tố củavi khuẩn Shigella (Calderwood và ctv, 1996).

STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau, và cả hai đều đề cập đến E.coli sản sinh một hay nhiều độc tố gây độc tế bào Tuy nhiên, không phải chỉ có gen

sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có các yếu tố độc lực khác Những dòng

E coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe mạnh với số

lượng rất ít, nhưng những dòng này thiếu một hay vài yếu tố độc lực khác của STEC(Beutin và ctv, 1995) Do đó, không phải tất cả STEC đều có khả năng gây bệnh(Nataro và Kaper, 1998)

2.2.2 Các yếu tố liên quan đến đặc tính gây bệnh của STEC 2.2.2.1 Độc tố Shiga (Stx)

Shigella dysenteriae do Kiyoshi Shiga phát hiện năm 1897, sản sinh độc tố

thường được gọi là Shiga Và sau này người ta phát hiện ở STEC cũng sản xuất độc tốtác động tương tự như Shiga (Shiga-like toxin) (Nataro và Kaper, 1998)

Stx là một ngoại độc tố không bền với nhiệt, tác động lên ruột lẫn hệ thần kinh

trung ương Ở ruột, E coli gây tiêu chảy, đồng thời ức chế hấp thu đường và các axit

amin ở ruột non Ở hệ thần kinh, nó gây biểu hiện lâm sàng trầm trọng có thể tử vong(Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh, 1996) Trong số hơn 200

serotype E coli có thể sản sinh độc tố Stx thì có hơn 50 serotype gây HC hay HUS ở

người (Nataro và Kaper, 1998)

Cấu trúc và tổ chức các gen stx: họ độc tố Stx ở STEC gồm hai nhóm chínhkhông phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2 Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thìStx2 rất thay đổi về trình tự, tạo ra nhiều biến chủng như Stx2c, Stx2hp, Stx2e Mộtdòng STEC có thể sản sinh Stx1 hay Stx2, hoặc cả Stx1 lẫn Stx2, và thậm chí nhiềudạng của Stx2.

Những nghiên cứu đầu thập niên 80 đã xác định Stx1 và Stx2 được mã hóa trên

thực khuẩn thể và thực khuẩn thể này chèn vào nhiễm sắc thể của E coli (O’Brien và

ctv, 1984)

Bảng 2.1 Danh pháp các thành viên trong họ Stx

Tên gọi trước đâyGenTên gọi hiện nayProtein

Tất cả độc tố Stx đều gồm hai thành phần cấu tạo (Paton và Paton, 1998): - Tiểu đơn vị A , 32 kDa, gồm peptide A1 28 kDa và peptide A2 4 kDa nối vớinhau bằng cầu nối disulfit Peptide A1 có hoạt tính enzyme và peptide A2 có nhiệm vụgắn kết tiểu đơn vị A vào những tiểu đơn vị B.

- Năm tiểu đơn vị B, có trọng lượng phân tử là 7,7 kDa Các tiểu đơn vị B giúpđộc tố kết hợp với thụ thể đặc hiệu của nó.

Vai trò của Stx trong sinh bệnh: Để gây bệnh, trước tiên Stx phải được tiếpnhận bởi các thụ thể đặc hiệu Các nghiên cứu cho thấy rằng Stx có tính chất gây độctrực tiếp lên tế bào ruột do chúng nhắm đến thụ thể Gb3 (globotriaosylceramide), dạngthụ thể glycolipid, trên nhung mao của tế bào biểu mô ruột ở động vật (Stx2e có thụthể là Gb4) Gb3 hoặc Gb4 còn tìm thấy ở tế bào nội mô thận, tế bào Vero, tế bào Hela Nhờ tính đặc hiệu của tương tác này và sự phân bố của các thụ thể thay đổi theo loại tếbào đã ảnh hưởng chính đến cách sinh bệnh (Lingwood, 1996)

Sau khi làm hư hại các tế bào biểu mô, Stx xuyên qua hàng rào biểu mô, xâmnhập vào dòng máu và tiến đến các mô đích khác nhau có chứa thụ thể glycolipid, gâytổn thương tế bào nội mạch, tế bào thận … Cụ thể là những tiểu đơn vị B sẽ giúp độctố kết hợp với các thụ thể đặc hiệu này Sau khi được chuyển vào bên trong tế bào, tiểuđơn vị A đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome, rồi cắt một gốcadenin khỏi rRNA 28S của ribosome, do đó gây trở ngại cho sự tổng hợp protein Vìkhông tổng hợp được protein, những tế bào bị Stx tác động sẽ chết Hậu quả là gâytiêu chảy, viêm kết tràng xuất huyết (HC) và hội chứng huyết niệu (HUS) Trong khiđó, hậu quả do Stx2e là hiện tượng phù thủng ở heo sau cai sữa (trích dẫn của Lê ThịMai Khanh, 2004)

Ảnh hưởng của các loại Stx trong sinh bệnh: Các nghiên cứu dịch tễ đã chỉ rarằng những dòng STEC chỉ sản sinh Stx2 thì gây bệnh trầm trọng hơn so với nhữngdòng STEC chỉ sản sinh Stx1, bệnh càng nặng hơn nếu dòng STEC sản sinh cả Stx1lẫn Stx2, chẳng hạn như HUS (Paton và Paton, 1998)

2.2.2.2 Enterohemolysin (haemolysin)

Enterohemolysin tồn tại ở nhiều dạng (,  và …) trong các E coli xâm lấn hay

sinh độc tố đường ruột (Manil và Daube, 2005) Độc tố này được tìm thấy ở hầu hết cácdòng O157:H7 và các dòng STEC không phải O157:H7 Enterohemolysin thuộc nhóm độc tốRTX (Repeats in toxin), gây dung giải tế bào tạo thành lỗ như chân lông (RTX family

of pore-forming cytolysin) (Paton và Paton, 1998) Và RTX hiện diện trong E coli gâybệnh đường huyết niệu (uropathogenic E coli), Pasteurella haemolytica và các tác

nhân khác gây bệnh cho người, động vật (Bauer và Welch, 1996)

Haemolysin do gen ehxA nằm trên plasmid 60 MDa pO157 mã hóa Gen ehxAcó 60% tương đồng với hlyA; hlyA cũng là gen cấu trúc mã hóa haemolysin ở E coli

gây bệnh đường huyết niệu và cho kiểu dung huyết -haemolysin (-Hly) Ngoài ra,gen cấu trúc ehxA có nhiều biến thể, được chia thành hai nhóm: nhóm 1 gồm nhiềuloại EHEC phổ biến như O157:H7, O26, O111; trong khi đó, nhóm 2 gồm nhiềuserotype khác còn lại cũng có tính chất gây bệnh Gần đây, các nghiên cứu về di truyền

học đã chỉ ra rằng gen ehxA của những dòng STEC có trình tự giống nhau trên 98%,

nhưng vẫn có sự khác nhau lớn ở một số đoạn trình tự chuyên biệt (Feng và Monday,2000)

Beutin và ctv (1989) đã khảo sát và khẳng định rằng đa số các dòng STEC đềucho kiểu dung huyết alpha (-Hly) Các dòng sản sinh độc tố này thì không gây dunghuyết trên thạch máu nhưng tạo thành vòng dung huyết nhỏ, mờ trên thạch máu cừu(có bổ sung Ca2+) sau khi ủ qua đêm Hiện tại, phương thức tham gia gây bệnh củaenterohaemolysin vẫn chưa được biết rõ Chính sự dung huyết trở thành nguồn cungcấp Fe kích thích sự phát triển STEC trong ống tiêu hoá (Law và Kelly, 1995)

2.2.2.3 Yếu tố bám dính

Yếu tố bám dính của STEC đã được chứng minh đóng vai trò quan trọng trongsự định vị vi khuẩn ở ruột Đó là intimin, một protein màng ngoài có trọng lượng phân

tử 94-97 kDa Intimin được mã hóa bởi gen eae (E coli attaching and effacing).

Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy, gọi là bệnh tích A/E (attaching andeffacing) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv,1993) Có 4 loại intimin, được kí hiệu là , , , và  Trong đó:

 -intimin thường được tìm thấy ở những dòng E coli thuộc nhóm EPEC ở người và chó.

 -intimin có ở những dòng E coli thuộc nhóm EPEC và EHEC ở người và thỏ.

 -intimin chủ yếu ở nhóm STEC của người và động vật, ở EPEC của người. -intimin hiện diện trong những dòng E coli thuộc nhóm EHEC ở bò và người(Oswald và ctv, 2000).

Có sự liên quan chặt chẽ giữa gen eae và khả năng gây bệnh trầm trọng của các

dòng STEC trên người như HC và HUS Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng tỉ lệ của các

dòng mang gen eae ở bệnh phẩm người cao hơn trên gia súc Hơn nữa, sự hiện diệndòng STEC mang gen eae trên gia súc thường liên quan đến các dòng vi khuẩn E coli

độc lực trên người mà khoa học đã từng biết, chúng thuộc serotype O157, O26, O111,… (Sandhu và ctv, 1996)

Ngoài ra còn có các yếu tố liên quan đến sự bám dính của các tác nhân khác

gây bệnh đường ruột bao gồm fimbriae, OMPs (outer membrance proteins) và LPS(lipopolysaccharide)

2.2.3 Cách sinh bệnh

Cách sinh bệnh là một quá trình gồm nhiều bước, liên quan đến sự tương tácphức tạp giữa số lượng vi khuẩn và các yếu tố của vật chủ Cấp STEC qua đườngmiệng (chỉ cần liều rất thấp) thì vi khuẩn phải sống sót trong điều kiện môi trườngkhắc nghiệt của dạ dày và chúng phải cạnh tranh với các vi khuẩn khác ở đường ruộtđể thiết lập sự định cư Vi khuẩn STEC sống sót trong đường ruột, nhân lên và sảnsinh Stx rồi được hấp thu qua tế bào biểu mô ruột, dẫn truyền vào dòng máu Điều nàycho phép toxin đặc hiệu đến bề mặt tế bào đích gồm cả tế bào ruột lẫn các nội quankhác (Paton và Paton, 1998).

Định cư vào ống tiêu hoá: vi khuẩn có khả năng bám vào tế bào biểu mô ruộtvà định cư trong ống tiêu hoá người là một trong những yếu tố quyết định độc lực.Người ta ước tính liều gây nhiễm của vài dòng STEC (O111:H- và O157:H7) khoảng1–100 CFU (colony forming unit) (Paton và ctv, 1996)

Sức đề kháng acid của STEC: Nét đặc trưng của các dòng STEC là khả năngđịnh cư ở ống tiêu hóa người, với số lượng cảm nhiễm thấp STEC đề kháng được pHacid của dạ dày Do đó, dòng STEC O157:H7 vẫn còn sống sót trong các thực phẩm

acid cao (Leyer và ctv, 1995) Tính trạng này được điều hòa bởi gen rpoS Gen này cókhả năng giúp vi khuẩn E coli kéo dài thời gian sống sót ở pH dưới 2,5 (Paton và

Paton, 1998) Gần đây, Waterman và Small (1996) báo cáo tình trạng đột biến của gennày Điều này góp phần giải thích những dòng STEC có khả năng gây cảm nhiễm khácnhau.

Kiểu bám vào tế bào biểu mô ruột: STEC có khả năng sống sót trong điềukiện khắc nghiệt của dạ dày Chúng phải thiết lập sự định cư này bằng cách bám vàocác tế bào biểu mô ruột STEC định cư được ở đoạn kết tràng (colon) và có lẽ cũng ởđoạn xa ruột non người; mặc dù hiện tượng này chưa được chứng minh trực tiếp Ngaycả những dòng trong serotype O157:H7 vẫn có sự bám dính khác nhau, điều này phảnánh nhiều cơ chế bám khác nhau

Vai trò của plasmid 60 MDa (pO157) cho STEC bám dính: Hầu hết các dòng

STEC đều chứa pO157 này Nhiều nghiên cứu đã phát hiện sự hiện diện của plasmid

liên quan đến yếu tố bám (fimbriae) và sự bám dính với tế bào Henle 407 nhưngkhông bám vào tế bào HEp-2 Theo Tzipori và ctv (1987), có hiện diện plasmid haykhông có đều không ảnh hưởng đến khả năng định cư ở kết tràng của STEC và khảnăng gây bệnh tích A/E trên heo con sinh ra bằng cách mổ lấy thai

2.2.4 Khía cạnh lâm sàng

Ngày nay, người ta công nhận rằng có sự phân bố rất rộng về bệnh ở người liênquan đến các vi khuẩn sản sinh độc tố Stx Những bệnh liên quan tới STEC thườnggắn liền với những ổ dịch nhỏ rải rác lẫn những ổ dịch lớn có nguồn gốc ngộ độc thựcphẩm

Nhiều bệnh nhân nhiễm STEC với triệu chứng đầu tiên là tiêu chảy, một sốtrường hợp thì sau một hay hai ngày thì tiêu chảy lẫn máu và HC Đau bụng dữ dộicũng thường xảy ra Đối với những bệnh nhân nhiễm STEC gây tình trạng HUS thì dễđể lại di chứng do sự tổn thương cấp tính ở thận, sự thiếu máu do dung huyết và giảmtiểu cầu Vài cá thể bị HUS thì có triệu chứng thần kinh như bơ phờ, nhức đầu dữ dội,co giật và đau não Mặc dù HUS xảy ra trên tất cả các nhóm tuổi nhưng tỉ lệ mắc bệnh

do STEC ở trẻ em và người già thường cao hơn, điều này có thể do sự đáp ứng miễndịch kém ở hai lứa tuổi này Sự cải thiện trong kiểm soát lâm sàng và kỹ thuật thẩmtách thận đã làm giảm tỉ lệ chết do HUS từ 50% xuống hơn 10% trong hai – ba thậpniên vừa qua Tuy nhiên, số lượng người sống sót (khoảng 30%) phải chịu đựng ốmyếu triền miên, bao gồm suy thận mãn tính, tăng huyết áp và suy yếu hệ thần kinh

Tiến trình bệnh do STEC gây ra có hay không có biến chứng tùy thuộc vào sựtác động qua lại giữa vi khuẩn và vật chủ Trong một ổ dịch, tuổi của người bệnh ảnhhưởng đến tỉ lệ mắc cũng như tỉ lệ chết Những nghiên cứu gần đây về các ổ dịch lớngây ra bởi STEC thuộc serotype O157:H7 cho thấy khoảng 5 – 10% bệnh nhân tiêuchảy tiến triển để hình thành HUS do STEC (Paton và Paton, 1998).

2.2.5 Dịch tễ học

Trong nhiều năm qua, người ta thừa nhận rằng những dòng STEC gây bệnh trênngười thuộc các tuýp huyết thanh O:H phổ rộng Karmali (1989) đã liệt kê 32serogroup O (tương đương với 60 tuýp O:H khác nhau) Trên khắp thế giới, các dòngSTEC thuộc serotype O157:H- là nguyên nhân chính gây bệnh cho người Việc phânlập các serotype này thường dựa vào khả năng không lên men sorbitol nên đã góp phầnđánh giá quá cao tỉ lệ mắc phải nhóm này so với các serotype khác Khi một tuýp đượcphân lập là O157, có lẽ có khuynh hướng bỏ qua tầm quan trọng tiềm năng gây bệnhcủa các tuýp khác Trong khi đó, các serotype STEC không thuộc O157:H7 cũng lànguyên nhân nổi bật gây bệnh cho người

Nguồn lây nhiễm: Nhiều cuộc điều tra dịch tễ đã chứng minh rằng các dòng

STEC hiện diện trong đường ruột của nhiều loài vật nuôi như bò, cừu, heo, dê, chó,mèo (Beutin và ctv, 1995) và cả ngựa (Chalmer và ctv, 1997) Do đó, STEC tồn lưutrong gia súc chính là nguồn quan trọng gây bệnh cho người, và nguồn quan trọng nhấtlà từ trâu bò.

STEC lây truyền qua người chủ yếu bằng con đường thực phẩm, nước và từngười qua người Cụ thể, STEC có thể xâm nhập vào chuỗi sản xuất thực phẩm chocon người từ nguồn gốc vật nuôi, vấy nhiễm thông thường nhất cho thịt là phân hoặccác thành phần trong ruột sau khi hạ thịt (Paton và Paton, 1998)

Truyền lây STEC giữa người và người xảy ra trong các đợt bộc phát bệnh Thờigian bài thải O157 qua phân là 2 – 4 tuần, nhưng khoảng 13% bệnh nhân thải O157hơn một tháng và triệu chứng bệnh không biểu hiện trong giai đoạn sau Như vậy nguycơ truyền lây giữa người – người là cao (Keene và ctv, 1994).

2.2.6 Chẩn đoán

Có những khó khăn liên quan đến chẩn đoán cảm nhiễm do STEC Trong giaiđoạn đầu, STEC tồn tại nhiều trong phân; có nhiều trường hợp, STEC chiếm trên 90%quần thể vi sinh vật hiếu khí (Paton và ctv, 1996) Tuy nhiên, lúc bệnh thuyên giảm, sốlượng này giảm nhanh cực kỳ Đối với những bệnh nhân HUS, triệu chứng dạ dày ruộtcó thể chỉ xuất hiện một tuần hoặc nhiều tuần, và ở thời điểm này số lượng STEC hiệndiện trong phân rất ít Trong vài trường hợp, tiêu chảy không kéo dài và nếu lấy bệnhphẩm qua trực tràng thì số lượng sẽ hạn chế Vì những lí do này, yêu cầu của phươngpháp chẩn đoán thích hợp phải nhạy, nhanh và đòi hỏi khối lượng mẫu tối thiểu Cácqui trình chẩn đoán thường tập trung vào việc phát hiện Stx, đặc biệt là Stx trong phân.Do các qui trình khác nhau về tính phức tạp, thời gian, độ nhạy, tính chuyên biệt và giáthành, vì vậy phải có chiến lược chẩn đoán thích hợp tùy hoàn cảnh và nguồn mẫu(Paton và Paton, 1998).

2.2.7 Phòng ngừa

E coli gây bệnh theo phân ra ngoài và phát tán trong đất, nước, không khí.

Ngoài ra, bệnh có thể lây truyền từ người sang người do tay bẩn, thực phẩm và nướcuống bị nhiễm Do đó, bệnh có thể gây thành dịch, đặc biệt ở nhà trẻ, khoa nhi củabệnh viện và người già

Vì vậy, phòng bệnh chủ yếu là tuân thủ nghiêm ngặt qui chế vệ sinh, chú ý xửlý phân và dụng cụ của bệnh nhân Không nên ăn những loại thực phẩm không đảmbảo chất lượng, đặc biệt là sản phẩm từ thịt chưa nấu chín vì chúng có thể là nguồn

truyền nhiễm STEC Có thể xác định chỉ số E coli trong nước để xem nước có nhiễm

bẩn hay không

2.3 Serotype O157:H7

Theo thống kê về tình hình các ổ dịch bệnh do nhiễm phải STEC thì hầu hết cáctrường hợp đều do serotype O157:H7 gây ra (Nataro và Kaper, 1998) Điều này cho

thấy serotype này nguy hiểm hơn, dễ lây lan bệnh hơn so với các serotype khác Lần

đầu tiên, serotype O157:H7 được phân lập và định danh vào năm 1982 E coli

O157:H7 ngày càng có tác động lớn ở Mỹ và châu Âu Hàng năm, ở Mỹ có trên 73000ca ngộ độc thực phẩm do nhiễm phải O157:H7, trong đó có 61 trường hợp tử vong.Nguyên nhân do ăn phải thịt bò chưa nấu chín hay đã bị vấy nhiễm, do uống sữa tươihay do truyền lây giữa người và người sau khi đi bơi trong các hồ đã bị nhiễm (USADepartment of Agriculture’s Food safety and Inspection Service, 2004) Từ đó, ngườita xem O157:H7 là nguyên nhân phổ biến nhất cho HC và HUS.

Serotype này có một số đặc điểm khác biệt so với các serotype E coli khác:

- Nhạy cảm với nhiệt độ, không phát triển được ở nhiệt độ 44 – 44,50C (Jay,2000)

- Không có khả năng lên men D-sorbitol trong 24 giờ Trong khi đó có đến 75 –

94% những dòng E coli khác lại lên men sorbitol Do đó, người ta thay thế môi trường

MacConkey có lactose bằng SMAC chọn lọc chứa 1% sorbitol để phân lập (Smith vàScotland, 1993)

- Không biểu hiện hoạt tính -D-glucuronidase (GUD): Điểm khác biệt về sinhhóa của dòng O157:H7 là không cho GUD dương tính, trong khi đó khoảng 90 – 95%

chủng E coli cho GUD dương tính Và người ta dựa vào đặc tính này để phân biệtO157:H7 với các dòng E coli khác (Monday và ctv, 2001)

GUD là enzyme xúc tác sự thủy phân -D-glucuronide thành rượu vàglucuronate Mặc dù không biểu hiện GUD nhưng các serotype O157:H7 vẫn mang

đoạn gen uid hoàn chỉnh (gồm cả vùng điều hòa) trên nhiễm sắc thể Kiểu hình đặctrưng này là do đã xảy ra các đột biến trên gen uid Hầu hết các đột biến trên uid ở

O157:H7 là đột biến thoái hóa, ví dụ như đột biến điểm thay thế T bằng G ở vị trí 92

so với E coli thuộc chủng hoang dại (wild-type) (Feng và Lampel, 1994) hay đột biến

do sự chèn thêm hai base G-G ở vị trí +686 trên uid ở serotype O157:H7 (Monday và

ctv, 2001) Tóm lại, những đột biến này có thể ảnh hưởng đến khả năng hoạt động củaGUD, O157:H7 vẫn sản sinh GUD nhưng GUD bị bất hoạt, không thực hiện chứcnăng thủy phân của nó được Và điều này vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn

- Kháng kháng sinh: cefixime, sulfivoxazol, tetracycline, streptomycine và cáctác nhân ức chế khác như potassium tellurite (ức chế các VSV thông thường) (Kim vàctv, 1994).

- Tính kháng acid (acid resistance - AR) đóng vai trò quan trọng cho khả năng

sống sót của vi khuẩn trong môi trường acid E coli O157:H7 có khả năng sống sót

trong môi trường acid từ pH = 2 đến pH = 7 Chẳng hạn, O157:H7 sống đến 56 ngàyở pH >= 4 trong môi trường TBS (Tryptic Soybean Broth), ngoài ra nó không pháttriển ít nhất 5 giờ ở pH 3 -2,5 khi nhiệt độ 37oC trong môi trường canh Luria có điều

chỉnh pH bằng HCl (trích dẫn bởi Jay, 2000) Đặc tính kháng acid này do gen rpoS qui

định Có 3 hệ thống AR khác nhau (Foster, 2004):

(1) Hệ thống AR1: chỉ hoạt động khi tế bào tăng trưởng trong môi trường yếmkhí với sự vắng mặt của glucose.

(2) Hệ thống AR2: hoạt động phụ thuộc vào sự có mặt của glutamate.

(3) Hệ thống AR3: hoạt động phụ thuộc vào sự có mặt của arginine.

Ba hệ thống này hoạt động suốt quá trình tăng trưởng ở pha cân bằng (stationeryphase) của vi khuẩn

- Khả năng chịu mặn: Trong canh khuẩn 4,5% NaCl, vi khuẩn tăng số lượng gấp3 lần khi tăng thời gian lên 2 lần, và không phát triển khi 8,5% NaCl (Jay, 2000).

2.4 Kỹ thuật PCR2.4.1 Khái niệm

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis và cộng sựphát minh năm 1985 đã và đang được sử dụng rộng rãi Đây là một phương pháp tạo

dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào

2.4.2 Nguyên tắc

Phản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA, là phảnứng gồm nhiều chu kì nối tiếp nhau Mỗi chu kì gồm 3 bước:

Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), nhiệt độ thường sử dụng là94 – 950C

Bước 2: là giai đoạn lai (hybridization), nhiệt độ dao động trong khoảng400C – 700C

Bước 3: là giai đoạn kéo dài (elongation hay extension), thường ở nhiệtđộ 720C.

Một chu kì gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và sau mỗi lần lặplại sẽ làm tăng gấp đôi lượng DNA của lần trước Số chu kì thường theo kinh nghiệmvà có thể trong khoảng 25 – 30 chu kì, tùy theo lượng của mẫu DNA lúc bắt đầu và độnhạy mong muốn

2.4.3 Các thành phần cần thiết của phản ứng PCR

- Dung dịch đệm: thành phần của dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại enzymesử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+ Nó hình thành một phức hợp hòa tan với dNTP,rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme polymerase, làm tăngnhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi Nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứngcuối cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5 mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

- Các dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại dATP, dTTP,dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA

- Mồi (primer): là những oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung với trìnhtự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA Các chuỗiprimer nên được thiết kế để nhân một đoạn DNA sao cho đạt chiều dài tối hảo là 100– 1000 bp mặc dù trong vài trường hợp sản phẩm chỉ 10 bp.

- Taq polymerase: là DNA polymerase chịu nhiệt, được chiết tách từ vi khuẩnThermus aquaticus ở suối nước nóng Taq không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác

tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg2+ Hoạt lực của

Taq bị ảnh hưởng rất lớn bởi nồng độ Mg2+ Nồng độ tối hảo Mg thường là 1,5 mM(Trần Thị Dân, 2001).

- DNA mẫu xét nghiệm.

2.4.4 Phân tích kết quả PCR

Sau khi thực hiện phản ứng PCR, tùy vào mục đích mà người ta sử dụng nhiềukỹ thuật sinh học phân tử khác nhau để phân tích sản phẩm của phản ứng PCR nhưđọc trình tự sản phẩm PCR, tạo dòng sản phẩm PCR … Tuy nhiên, công việc đầu tiênsau khi thực hiện phản ứng PCR là phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điệndi.

Sau khi điện di, các DNA trong gel sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờethidium bromide, chất này có khả năng gắn xen vào các base của các nucleotide vàphát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV.

Và để ước lượng kích thước DNA trên gel, người ta sử dụng một “yếu tố đánhdấu trọng lượng phân tử “ (molecular weight marker - MWN) hay còn gọi DNA ladder(thang chuẩn).

2.4.5 Multiplex – PCR

Là phản ứng PCR sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi để khuếch đại nhiều đoạnDNA trong cùng một phản ứng PCR Phương pháp này được thử nghiệm thành côngvào năm 1988 và được áp dụng vào nhiều công trình nghiên cứu Cho đến nay, vẫnchưa có nguyên tắc chung hay thành phần chuẩn nào cho việc tối ưu hóa phản ứngmultiplex – PCR Do vậy, ứng với mỗi một điều kiện phản ứng, cần phải điều chỉnhcho phù hợp với mục đích mong muốn

2.4.6 Ứng dụng

Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, vớinhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, khảo cổ, pháp y và hình sự.

Trong nghiên cứu genome, PCR được ứng dụng trong nhân bản vô tính,

multiplex PCR, cloning cDNA bằng PCR đảo (inverse PCR), recombinant PCR,

Trong y khoa và thú y, PCR được sử dụng để chẩn đoán các mầm bệnh virus, vikhuẩn, protozoa lẫn ký sinh trùng đa bào.

Trong nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, sử dụng PCR để phát hiện genhalothan, gen thụ thể estrogen, gen thụ thể prolactin … trong công tác chọn giống vật

nuôi, phát hiện các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm : E coli, Salmonella,Staphylococcus aureus, Campylobacter,

Phần 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian

Đề tài được thực hiện từ ngày 1/03/2005 đến ngày 30/07/2005.

3.1.2 Địa điểm

- Mẫu phân được lấy từ các hộ hoặc trại chăn nuôi ở Đồng Nai, TP HCM vàTiền Giang.

- Mẫu bề mặt thịt bò được lấy ở lò mổ Dĩ An-Bình Dương.

- Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại Phòng thực hành Kiểm nghiệmthú sản và Môi trường sức khỏe vật nuôi, Khoa Chăn nuôi – Thú y, Trường Đại họcNông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.

- Xác định các gen độc lực của E coli được thực hiện tại Trung tâm Phân tích

Thí nghiệm Hóa sinh, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.

3.2 Nội dung thực hiện

- Phân lập vi khuẩn E coli trong phân bò, heo và bề mặt thịt bò.

- Li trích DNA của E coli phân lập được

- Thực hiện phản ứng multiplex – PCR để phát hiện các gen eae, ehxA, stx1, stx2 và uid của E coli

3.3 Phương pháp thực hiện3.3.1 Vật liệu thí nghiệm cơ bản

Dụng cụ lấy mẫu: tăm bông, đèn cồn, chai cồn, môi trường chuyên chở Carry Blair, Mẫu vi khuẩn đối chứng dương: EDL933.

3.3.2 Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu

- Dùng muỗng vô trùng lấy phần giữa cục phân (khoảng 10 -12 g) mà bò, heovừa mới thải ra, cho vào túi nylon vô trùng, buộc kỹ, bảo quản 4 - 80C và chuyển vềphòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt Phân tiêu chảy có thể được lấy bằng cách dùngtăm bông, cho vào môi trường chuyên chở Carry Blair, chuyển về phòng thí nghiệm.

- Quét bề mặt thịt bò bằng gạc hoặc tăm bông vô trùng, cho vào ống nghiệmchứa sẵn nước pepton đệm

3.3.2 Nuôi cấy và phân lập E coli

3.3.2.1 Môi trường nuôi cấy

 Môi trường tăng sinh

Do số lượng E.coli nhóm STEC, đặc biệt là E coli gây bệnh hiện diện trong

thực phẩm rất ít, cho nên trước khi phân lập chúng tôi sử dụng môi trường tăng sinhpepton đệm có bổ sung kháng sinh cefixime (0,0125mg/L) và vancomycin (8mg/L)(FDA, 2002) để ức chế các vi khuẩn gram dương và vi khuẩn sống hoại sinh khác

 Môi trường phân lập

Để xác định môi trường nào cho kết quả tốt khi phân lập E coli nhóm STEC

mang gen độc lực, chúng tôi sử dụng 3 loại môi trường MAC, SMAC và CT - SMAC.Môi trường phân lập là môi trường MacConkey (MAC), Sorbitol MacConkey(SMAC), và Sorbitol MacConkey (CT - SMAC) có bổ sung kháng sinh cefixime

(0,05mg/L) và tellurite (2,5mg/L) (FDA, 2002) Khoảng 90% E coli đều lên menđường lactose, trên môi trường MAC, E coli điển hình có khuẩn lạc màu đỏ hồng.Trên môi trường SMAC và CT - SMAC, E coli không lên men đường sorbitol nêncho khuẩn lạc màu trắng, những dòng E coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu

hồng

Việc tầm soát E coli nhóm STEC trên phân, bệnh phẩm trên thạch SMAC, CT

-SMAC là công cụ ban đầu phát hiện serotype O157 thuộc nhóm STEC

3.3.2.2 Qui trình phân lập, định tính

(1) Nuôi cấy và phân lập

E coli hiện diện trong phân với số lượng lớn, nên phân heo hoặc bò sau khi thu

thập và chuyển về phòng thí nghiệm được tiến hành ria trực tiếp trên môi trường thạch

đĩa MAC và SMAC, ủ 370C trong 18 - 24giờ, chọn và thu khuẩn lạc điển hình, giữgốc Li trích DNA rồi thực hiện multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực

Riêng đối với mẫu bề mặt thịt, do lượng E coli hiện diện trên bề mặt thịt thườngthấp so với mẫu phân, ngoài ra những dòng E coli gây bệnh hiện diện trong phân, thựcphẩm với tần số thấp hơn nhiều so với nhóm E coli STEC không thuộc O157 (Patonvà Paton, 1998) Đây chính là trở ngại cho việc phát hiện E coli O157:H7, nên việc

phết và ria trực tiếp trên môi trường MAC, SMAC thường gặp nhiều khó khăn Vì vậy,

để cải thiện khả năng phát hiện STEC có mang gen độc lực từ thịt, sử dụng môi trường

pepton đệm có bổ sung vancomycin và cefixime (PVC) nhằm hạn chế sự cạnh tranhphát triển của những vi khuẩn khác để STEC có cơ hội tăng sinh tốt hơn Sau khi ủ370C trong 24h, canh khuẩn này được cấy ria trở lại trên môi trường thạch CT - SMACđể chọn lọc chuyên biệt nhóm STEC.

(2) Chọn khuẩn lạc E coli

Trên từng loại môi trường MAC, SMAC, CT - SMAC, chọn ngẫu nhiên 6 – 10khuẩn lạc rời rạc đại diện cho mỗi nhóm hình thái:

o Khuẩn lạc hồng trên môi trường MAC được kí hiệu HM.

o Khuẩn lạc hồng hoặc trắng trên môi trường SMAC được kí hiệu lần lượt làHS hoặc TS.

o Khuẩn lạc trắng hoặc hồng trên môi trường CT - SMAC kí hiệu lần lượt làTCT hoặc HCT.

Dùng que cấy chạm nhẹ trên từng khuẩn lạc rời rạc rồi chuyển vào từng ống NAriêng biệt để giữ gốc riêng lẻ Thu phần khuẩn lạc còn lại của mỗi nhóm, gom chungvào 1 eppendorf chứa sẵn 0,4 – 0,5 ml nước cất khử ion vô trùng

(3) Thử sinh hóa

Sử dụng nghiệm pháp IMViC (FAO, 1992) cho từng khuẩn lạc riêng lẻ thuộc

nhóm đó để xác định E coli

3.3.3 Li trích DNA

Theo Cebula và ctv (1995), kết hợp với ý kiến của Cerna (2003) và Botteldoorn

(2003), việc ly trích DNA được thực hiện như sau: thu khoảng 6 -10 khuẩn lạc E coli

trên môi trường thạch (MAC hoặc SMAC hoặc CT - SMAC hoặc NA) cho vào eppendorfđựng sẵn 0,4 - 0,5 ml nước cất hai lần vô trùng, đun sôi 10 phút, lấy ra và chuyển vàotủ âm -700C giữ trong 10 phút Sau khi rã đông hoàn toàn, ly tâm 13000 vòng trong 3

phút Để yên và hút phần dung dịch ở phía trên làm DNA khuôn mẫu (DNA xétnghiệm).

Sơ đồ 3.1 Qui trình phân lập, định tính và phát hiện gen độc lực E coli

Chọn 6 - 10 khuẩn lạcđỏ hồng

Thu tất cả phần còn lại của những khuẩn lạc đãchọn theo từng nhóm riêng và mỗi nhóm chovào mỗi eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5 ml H2O

cất khử ion 2 lần

CT - SMAC(37oC/24h)MAC

Chọn 6 - 10 khuẩn lạc theotừng nhóm riêng: trắng hoặc

đỏ hồng hoặc cả haiSMAC

Thử IMViC (+/-;+;-;-)Cấy từng khuẩn lạc được chọn vào từng ống thạch nghiêng NA (37oC/24h)

Pepton (vancomycin,cefixime) (37oC/24h)