Ứng dụng kỹ thuật multiplex pcr str xác định chimerism nhằm theo dõi tiến triển của việc mọc mảnh ghép trên bệnh nhân dị ghép tế bào gốc tạo máu

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR STR XÁC ĐỊNH CHIMERISM NHẰM THEO DÕI TIẾN TRIỂN CỦA VIỆC MỌC MẢNH GHÉP TRÊN BỆNH NHÂN DỊ GHÉP TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU NGUYỄN TRẦN NAM AN NGUYỄN THỊ MINH YÊN CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/ 2016 MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i TÓM TẮT iv ABSTRACT v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ viii PHẦN MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: Tổng Quan Tài Liệu 1.1 Ghép tế bào gốc tạo máu 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Ứng dụng ghép tế bào gốc tạo máu 1.2 Xác định chimerism sau ghép 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Các phương pháp xác định chimerism sau ghép 1.2.2.1 Kỹ thuật phenotype hồng cầu 1.2.2.2 Phân tích nhiễm sắc thể đồ 1.2.2.3 Kỹ thuật lai chỗ phát huỳnh quang FISH 1.2.24 Kỹ thuật RFLP 1.2.2.5 Kỹ thuật PCR khuếch đại SNP 1.2.2.6 Kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn STR 1.3 Tình hình nghiên cứu 12 1.3.1 Trên giới 12 1.3.2 Trong nước 15 Chương 2: Đối Tượng - Phương Pháp Nghiên Cứu 15 2.1 Thiết kế nghiên cứu 16 2.2 Đối tượng nghiên cứu 16 i 2.2.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu 16 2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ 16 2.3 Cỡ mẫu 16 2.4 Địa điểm nghiên cứu 16 2.5 Thời gian nghiên cứu 16 2.6 Phương pháp tiến hành 16 2.6.1 Trang thiết bị 16 2.6.2 Hóa chất 17 2.6.3 Y dụng cụ 17 2.6.4 Các bước tiến hành 17 2.6.4.1 Thu thập kết Multiplex PCR STR 100 cặp cha-con mẹ-con có liên hệ huyết thống 17 2.6.4.2 Thu thập mẫu cặp người cho người nhận 18 2.6.4.3 Ly trích DNA 18 2.6.4.4 Thực phản ứng multiplex PCR điện di sản phẩm máy điện di mao quản 18 2.6.4.5 Khảo sát lượng DNA sử dụng cho phản ứng multiplex PCR vàlượng sản phẩm PCR sử dụng cho điện di mao quản 20 2.6.4.6 Đánh giá độ nhạy, độ lặp lại độ xác kết chimerism 20 2.6.4.7 Phân tích kết điện di mao quản 20 2.6.4.8 So sánh với kỹ thuật FISH 21 Chương 3: Kết Quả 20 3.1 Kết phân tích 18 dấu ấn STR 100 cặp cha-conhoặc mẹ-con có liên hệ huyết thống 22 3.2 Kết ứng dụng quy trình kỹ thuật multiplex PCR STR xác định chimerism 26 3.2.1 Khảo sát lượng DNA sử dụng cho phản ứng multiplex PCR 26 3.2.2 Kết multiplex PCR STR xác định chimerism BN dị ghép TBGTM 27 3.2.3 Đánh giá độ nhạy, độ lặp lại độ xác 31 ii 3.2.4 So sánh kết chimerism với kết FISH trường hợp người cho – người nhận khác giới tính 32 Chương 4: Bàn luận 34 4.1 Kết phân tích 18 dấu ấn STR 100 cặp cha-con mẹ-con có liên hệ huyết thống 34 4.2 Kết ứng dụng quy trình kỹ thuật multiplex PCR STR xác định chimerism 35 Chương 5: Kết luận – Kiến nghị 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC 45 PHỤ LỤC 46 PHỤ LỤC 47 PHỤ LỤC 48 iii TĨM TẮT Mục đích nghiên cứu: Ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR STR để xác định chimerism sau ghép bệnh nhândị ghép tế bào gốc tạo máu Đối tƣợng phƣơng pháp nghiên cứu:Thu thậpdữ liệu 100 cặp cha-con mẹ-con có liên hệ huyết thống khảo sát kít PowerPlex 18D system Mẫu máu/tủy BN trước sau ghép, mẫu máu người cho TBGTM tương ứng thu thập, thực phản ứng multiplex PCR điện di sản phẩm máy điện di mao quản Khảo sát lượng DNA sử dụng cho phản ứng multiplex PCR, đánh giá độ nhạy, độ lặp lại độ xác kỹ thuật dựa vào pha hỗn hợp DNA người cho người nhận trước ghép với tỷ lệ DNA người cho khác Kết quả: Phân tích 100 trường hợp cha/mẹ xác nhận có liên hệ huyết thống, tỷ lệ STR có giá trị phân tích chimerism thay đổi đa dạng (10-63%), Penta E chiếm tỷ lệ cao (63%) Có 48 cặp diện ≥ dấu ấn STR 19 cặp có dấu ấn STR có giá trị phân tích chimerism Kết thực kỹ thuật multiplex PCR STR với kít PowerPlex 18D systemxác định lượng DNA thích hợp ban đầu cho vào phản ứng 10 ng Kết phân tích chimerism cho thấy dấu ấn STR Penta E, D8S1179, D19S433 sử dụng cho theo dõi chimerism với tần suất nhiều (42%), dấu ấn STR D3S1358, D13S317, D7S820 sử dụng (17%) Đa số BN theo dõi chimerism thời điểm 21 ngày sau ghép đạt tỷ lệ 100% tế bào người cho thể người nhận dựa vào dấu ấn STR phát hoàn toàn người cho Độ nhạy kỹ thuật multiplex PCR STR phịng xét nghiệm chúng tơi xác định 6% Kết luận: Chúng ứng dụng thành cơng quy trình xác định chimerism kỹ thuật multiplex PCR STR sử dụng kít PowerPlex 18D systemđể theo dõi mọc mảnh ghép BNdị ghép TBGTM,giúp hỗ trợ kịp thời cho bác sĩ lâm sàng định điều trị cho BN Từ khóa: Chimerism, Multiplex PCR STR, dị ghép tế bào gốc tạo máu iv ABSTRACT Purposes: Detection of chimerism after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation(allo HSCT) in leukemia patients using multiplex PCR STR technique Materials and Methods: The data of 100 pairs related parent/child identifying by DNA paternity test using PowerPlex 18D system kit were analyzed The peripheral blood (PB) or bone marrow samples before and after transplantation from patients, and PB samples from donors were collected and carried out mutiplex PCR The optimal DNA concentration was determined by analyzing the results with ng, 10 ng and 15 ng DNA The sensitivity, repeatability and accuracy of this technique were estimated by preparing serial dilution of recipient DNA and donor DNA Results:The result of 100 pairs related parent/child according to criteria of chimerism analysis showed that the frequency of suitable STR markers for recognizing chimerism are changed in many levels (10-63%) In particular, Penta E was occupied highest rate with 63% There are 48 cases with ≥ informative STR markers and 19 cases with informative STR markers The procedure of multiplex PCR STR technique with PowerPlex 18D system kit showed that the optimal DNA concentration using PCR is 10 ng The STR loci of Penta E, D8S1179, D19S433 are used with the highest incident (42%), whereas the STR loci of D3S1358, D13S317, D7S820 with the lowest rate (17%) Most of patients are monitored at the day 21 after graft, achieving complete donor chimerism The detection limit of this technique in this study is 6% Conclusion: The multiplex STR PCR using PowerPlex 18D system kit is applied succesfully for monitoring post bone marrow transplantation, helping medical doctor to determine suitable therapy regimens Keywords: Chimerism, Multiplex PCR STR, Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT TBGTM: Tế bào gốc tạo máu STR: Short Tandem Reapeat SNP: Single Nucleotide Polymorphism FISH: Florescence In Situ Hybridization PCR: Polymerase chain reaction DNA: Deoxyribonucleic Acid NST: Nhiễm sắc thể BN: Bệnh nhân FL: Fluorescein TMR-ET: Carboxy-tetramethylrhodamine - energy transfer JOE: 6-carboxy-4´,5´-dichloro-2´,7´-dimethoxyfluorescein CXR-ET: CarboxyX-rhodamine - energy transfer 5-FAM: 5-Carboxyfluorescein 6-FAM: 6-Carboxyfluorescein NED: 2'-chloro-5'-fluoro-7',8'-benzol ,4-dichloro-6carboxyfluorescein BCCDT Bạch cầu cấp dòng tủy BCCDL Bạch cầu cấp dòng lympho RQ-PCR real-time quantitative RT-PCR RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các bệnh thường điều trị ghép TBGTM Bảng 1.2: Danh sách 10 dấu ấn STR Kit ChimerXplain, Bergisch-Gladbach, Germany 12 Bảng 1.3: Danh sách 16 dấu ấn STR kít PowerPlex 16D system 13 Bảng 1.4: Danh sách 11 dấu ấn STR Kit SGM Plus® Kit 14 Bảng 1.5: Danh sách dấu ấn STR Kit Triplex AFS kit 14 Bảng 1.6: Danh sách 12 dấu ấn STR kít Beckman Coulter GeXP™ GenomeLab Human STR Primer Set 15 Bảng 2.1: Danh sách 18 dấu ấn STR PowerPlex 18D system kit 19 Bảng 3.1: Kết điện di mao quản cặp cha/mẹ thứ 22 Bảng 3.2: Kết điện di maoquản cặp cha/mẹ thứ hai 23 Bảng 3.3: Tỷ lệ dấu ấn STR mang thông tin khác biệt 100 cặp cha/mẹ 24 Bảng 3.4: Số lượng dấu ấn STR có giá trị phân tích chimerism 25 Bảng 3.5: Phân loại số peak theo chiều cao 26 Bảng 3.6: Số lượng dấu ấn STR thông tin sử dụng để theo dõi sau ghép 24 cặp người cho người nhận 27 Bảng 3.7: Tỷ lệ lồi dấu ấn STR thơng tin sử dụng để theo dõi chimerism sau ghép 28 Bảng 3.8: Kết chimerism BN BCCDT sau dị ghép TBGTM 29 Bảng 3.9: Kết chimerism sau ghép ngày BN mã CMR-05 30 Bảng 3.10: So sánh tỷ lệ chimerism dựa dấu ấn STR độ pha loãng thực tế 32 Bảng 3.11: Kết chimerism PCR STR FISH sau dị ghép TBGTM 32 Bảng 4.1 Diễn tiến tình trạng lâm sàng 24 BN ghép TBGTM 37 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Phân tích chimerism dấu ấn STR 11 Hình 3.1: Kết điện di mao quản số dấu ấn STR mẫu BN CMR-09: Nồng độ DNA cho phản ứng multiplex PCR: a) ng, b)10 ng, c) 15 ng 27 Hình 3.2: Kết điện di dấu ấn STR người cho – người nhận trước sau ghép ngày BN CMR-05: Các dấu ấn STR D13S317 D16S539 STR thông tin 31 viii Đề tài vườn ươm 2014 Báo cáo nghiệm thu PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài/dự án: Ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR STR xác định chimerism nhằm theo dõi tiến triển việc mọc mảnh ghép bệnh nhân dị ghép tế bào gốc tạo máu Chủ nhiệm đề tài/dự án: Nguyễn Trần Nam An, Nguyễn Thị Minh Yên Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học Cơng nghệ Trẻ Thời gian thực hiện:12/2014 – 12/2015 Kinh phí đƣợc duyệt: 80.000.000 VN Đồng Kinh phí cấp:40.000.000 đồngtheo Thơng báo số /TB-SKHCN Mục tiêu: 2.1 Mục tiêu tổng quát Ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR STR theo dõi việc mọc mảnh ghép sau ghép bệnh nhân dị ghép tế bào gốc tạo máu 2.2 Mục tiêu cụ thể 2.2.1 Phân tích giá trị chẩn đốn chimerism 18 dấu ấn STR kít thương mại PowerPlex 18D system hãng Promega 2.2.2 Hồn thiện quy trình kỹ thuật multiplex PCR STR 2.2.3 Xác định tỷ lệ chimerism, tỷ lệ tế bào người cho/tổng tế bào người cho người nhận có thể bệnh nhân dị ghép tế bào gốc tạo máu, cho đánh giá tình trạng mọc mảnh ghép Nội dung: 3.1 Nội dung thực giai đoạn (đối chiếu với hợp đồng ký): Công việc dự kiến Công việc thực Thu thập phân tích kết 18 dấu ấn Thu thập phân tích kết 18 dấu STR 100 cặp cha-con mẹ-con ấn STR 100 cặp cha-con mẹcó liên hệ huyết thống khảo sát có liên hệ huyết thống khảo sát kít PowerPlex 18D system theo tiêu kít PowerPlex 18D system chuẩn chẩn đốn chimerism theo tiêu chuẩn chẩn đoán chimerism Đề tài vườn ươm 2014 Báo cáo nghiệm thu thành cơng quy trình kỹ thuật multiplex PCR STR kít PowerPlex 18D system (Promega) cho theo dõi chimerism cho BN sau ghép Theo nghiên cứu Dodero A cộng sự, tỷ lệ chimerism máu ngoại vi sau ghép 30 ngày hầu hết BN đạt mứclớn 95% [13] Tương tự, nghiên cứu khác Doney KC cộng đánh giá chimerism ngày 28 sau ghép 45/47 BN có tỷ lệ chimerism tủy > 90% [14] Do đó, kết chimerism sau ghép của21/24 BN đưa nhận định bước đầu mảnh ghép mọc tốt thể BN sau ghép.Cụ thể trường hợp dị ghép TBGTM nửa thuận hợp HLA, kết chimerism Bảng 3.8 cho thấy tỷ lệ tế bào người cho thể người nhận tăng dần theo thời gian theo dõi từ ngày đến 21 Ví dụ BN CMR-02 sau ghép ngày, tỷ lệ chimerism 58,45%, tới ngày 14 tỷ lệ 95,5% đến ngày 21 đạt 100% tương tự trường hợp CMR-05 CMR-21 Trường hợp ngoại lệ CMR-03, người cha cho tế bào gốc để ghép haplo cho BN, nhiên, sau theo dõi chimerism từ ngày đến 28, tỷ lệ chimerism người cho 0,00% Điều cho thấy mảnh ghép không mọc thể người nhận bác sĩ lâm sàng chuyển qua ghép haplo lần cho BN tế bào gốc người mẹ mảnh ghép không mọc BN Đối với trường hợp dị ghép TBGTM thuận hợp HLA hoàn toàn, tỷ lệ chimerism tế bào người cho thể người nhận 100% thời điểm sau ghép ngày 21 Ngoại trừ CMR-23 có tỷ lệ chimerism ngày 21 70,24% BN ghép tủy tình trạng bệnh chưa lui hồn toàn Tỷ lệ tế bào người cho sau ghép BN CMR-23 giảm dần đến mức thấp ngày 66 lúc BN truyền tế bào lympho người cho để phát huy hiệu mảnh ghép chống tế bào ung thư Kết Bảng 3.8 cho thấy tỷ lệ chimerism BN CMR-23 tăng dần lên đến 100% vào ngày 81 sau ghép.BN CMR-14 có kết theo dõi chimerism ngày 77 với tỷ lệ 0,00% truyền tế bào lympho người cho với tỷ lệ chimerism tăng lên 12,68% ngày 91 sau ghép Vậy, kết chimerism phản ánh tình trạng mọc mảnh ghép thành cơng sau ghép nguy cơthải ghép BN xảy rado tăng lên tế bào BN, từ đó, giúp bác sĩ lâm sàng can thiệp liệu pháp phù hợp Bên cạnh việc thải ghép, tượng GvHD hay mảnh ghép chống vật chủcũng gây tổn 36 Đề tài vườn ươm 2014 Báo cáo nghiệm thu thương quan BN, góp phần làm tình trạng bệnh xấu đi.Hiện nay, diễn tiến lâm sàng BN ghi nhận Bảng 4.1 Bảng 4.1 Diễn tiến tình trạng lâm sàng 24 BN ghép TBGTM STT MÃ BN Diễn tiến bệnh Tình trạng CMR-01 GvHD mạn lan rộng, nhiễm trùng nhiễm nấm lan tỏa Tử vong CMR-02 CMR-03 CMR-04 CMR-05 CMR-06 CMR-07 GvHD cấp nặng Ổn Do tái phát bệnh GVHD mạn lan rộng Do tái phát bệnh Do tái phát bệnh Tử vong Còn sống Tử vong Còn sống Tử vong Tử vong CMR-08 GvHD mạn mức độ giới hạn Còn sống 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 CMR-09 CMR-10 CMR-11 CMR-12 CMR-13 CMR-14 CMR-15 CMR-16 CMR-17 CMR-18 CMR-19 CMR-20 CMR-21 CMR-22 CMR-23 CMR-24 Ổn Ổn Ổn Ổn Ổn Do tái phát bệnh Ổn Ổn Ổn Ổn Ổn Ổn Do xuất huyết não Ổn Do nhiễm nấm não Ổn Còn sống Còn sống Còn sống Còn sống Còn sống Tử vong Còn sống Còn sống Còn sống Còn sống Còn sống Còn sống Tử vong Còn sống Tử vong Còn sống Kết Bảng 3.10 cho thấy tỷ lệ chimerism dựa dấu ấn STR độ pha loãng thực tế có độ chênh lệch tối đa khoảng 5% Độ chênh lệch giảm dần theo độ pha 37 Đề tài vườn ươm 2014 Báo cáo nghiệm thu loãng với tỷ lệ người cho tăng dần Chẳng hạn, độ pha lỗng 50% D có độ chênh lệch cao 8,84%, độ pha lỗng 98,5% D có độ chênh lệch thấp 0,37% Như vậy, với tỷ lệ chimerism cao độ chênh lệch tỷ lệ chimerism dựa dấu ấn STR độ pha loãng thực tế thấp Độ nhạy hay giới hạn phát kỹ thuật xác định mức pha lỗngcó tỷ lệ DNAngười cho cao nhấtmà kỹ thuật xác định chimerismcó thể phát DNA người nhận [24] Kết Bảng 3.10 cho thấytại mức pha loãng 98,5% hay 97%, kết chimerism cho thấy có diện DNA người nhận mẫu CMR-08 CMR-11, đó, mức pha lỗng 94% DNA người cho (tức có 6% DNA người nhận), phương pháp phát DNA người nhận mẫu thử nghiệm Vậy, độ nhạy kỹ thuật xác định 6%, tức phát mức thấp 6% tế bào người nhận cịn sót lại sau ghép So sánh với kỹ thuật FISH, kết chimerism từ kỹ thuật PCR dấu ấn STR (Bảng 3.11) cho thấy có tương đồng tỷ lệ tế bào người cho thể người nhận sau ghép kỹ thuật Đối với ca CMR-02, tỷ lệ chimerism sau ghép ngày 14 xác định kỹ thuật mutiplex PCR STR 95,5% tương ứng với kết FISH 95,5% Tiếp tục sau ghép ngày 21 ngày 35, kỹ thuật cho kết 100% tế bào người cho mọc thể người nhận Tương tự, kết chimerism ca CMR-05 sau ghép ngày 14, kỹ thuật mutiplex PCR STR FISH cho kết tương ứng, 100% 98%; sau ghép ngày 21 98,10% 97,50% Trong trường hợp CMR-03, hai phương pháp cho kết 0% cho thấy mảnh ghép người cho không mọc thể người nhận ngày thứ 14 21 Tỷ lệ 0,00% ngày 28 sau ghép theo dõi với kỹ thuật PCR STR (bảng 3.8) Vậy, việc so sánh kết với kỹ thuật FISH cho thấy kỹ thuật mutiplex PCR STR xác định chimerism kỹ thuật đáng tin cậy dùng để theo dõi việc mọc mảnh ghép BN BCCDT dị ghép TBGTM Hơn nữa, kỹ thuật mutiplex PCR STR cịn có ưu điểm theo dõi sau ghép mà không cần quan tâm người cho người nhận giới hay khác giới, từ cho thấy khả ứng dụng rộng dấu ấn STR giá trị kỹ thuật mutiplex PCR STR chẩn đốn chimerism.Quy trình kỹ thuật xác định tỷ lệ chimerism kỹ thuật mutiplex PCR STR đơn giản thời gian thực ngắn 38 Đề tài vườn ươm 2014 Báo cáo nghiệm thu kỹ thuật FISH, cho kết nhanh hơn, hỗ trợ cho lâm sàng nhanh chóng để đánh giá tiến triển việc mọc mảnh ghép dự đoán khả thải ghép hiệu 39 Đề tài vườn ươm 2014 Báo cáo nghiệm thu CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN –KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Bộ dấu ấn STR kít PowerPlex 18D system (Promega) sử dụng phân tích chimerism BNdị ghép TBGTM, hỗ trợ bác sĩ lâm sàng đánh giá kết sau ghép theo dõi tái phát nhằm can thiệp điều trị kịp thời - Chúng ứng dụng thành cơng quy trình xác định chimerism kỹ thuật multiplex PCR STR để theo dõi mọc mảnh ghép BN dị ghép TBGTM BVTMHH TP.HCM - Độ nhạy kỹ thuật multiplex PCR STR phòng xét nghiệm chúng tơi 6%, tức phát 6% tế bào người nhận cịn sót lại sau ghép - Xác định tỷ lệ chimerism trước ghép sau ghép nhiều thời điểm khác nhau, kết tương đồng với kết xác định kỹ thuật FISH trường hợp người cho người nhận khác giới tính, giúp hỗ trợ cho lâm sàng nhanh chóng đánh giá tiến triển việc mọc mảnh ghép dự đoán khả thải ghép BN dị ghép TBGTM hiệu 5.2 Kiến nghị Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu việc phân tích dấu ấn STR để lựa chọn dấu ấn đủ tiêu chuẩn cho mục đích xác định chimerism.Với trường hợp dị ghép TBGTM có xu hướng ngày tăng, kiến nghị nên xây dựng dấu ấn STR riêng cho người Việt Nam để sử dụng phân tích chimerism nhằm giảm chi phí xét nghiệm 40 Đề tài vườn ươm 2014 Báo cáo nghiệm thu TÀI LIỆU THAM KHẢO AFS Mentype Triplex AFS User Manual Dresden: Biotype AG,2002, 1–2 AmpFlSTR Profiler SGM kit AmpFlSTR SGM Plus PCR Amplification Kit User’s Manual Foster City, CA: Applied Biosystems, 1999, 1–16 Bader P, Niethammer D, Willasch A, et al How and when should we monitor chimerism after allogeneic stem cell transplantation.Bone Marrow Transplantation 2005; 35, 107–119 Beckman Coulter GenomeLab™ Human STR Primer Set (PN A20100), 2009 Brookes AJ The essence of SNPs Gene, 1999;234(2):177-86 Bo I, Nava P, Simón A, et al A comparison of fluorescent in situ hybridization and multiplex short tandem repeat polymerase chain reaction for quantifying chimerism after stem cell transplantation Haematologica 2005;90(10):1373-9 Butler JM (2001) Biology of STRs: stutter products, non-template addition, microvariants, null alleles, and mutation rates In: Butler JM (ed) Forensic DNA typing- Biology & Technology behind STR markers London: Academic Press, 81– 98 Christian Thiede Quantitative analysis of chimerism after allogeneic stem cell transplantation usingmultiplex PCR amplification of short tandem repeat markers and fluorescencedetection Leukemia (2001) 15, 303–306 Collins JR, Stephens RM, Gold B, et al An exhaustive DNA micro-satellite map of the human genome using high performance computing Genomics 2003; 82, 10-19 10 Copelan EA Hematopoietic stem-cell transplantation.N Engl J Med, 2006;354(17):1813-26 11 D Kristt, B Gesundheit, J Stein, MY Shapira, R Or, A Amar, I Yaniv, B Garty, R Itah, M Israeli1 and T Klein, 2010, Quantitative monitoring of multi-donor chimerism: a systematic, validated framework for routine analysis, Bone Marrow Transplantation 45, 137–147 41 Đề tài vườn ươm 2014 Báo cáo nghiệm thu 12 Dewald GW, Schad CR, Christensen ER, et al Fluorescence in situ hybridization with X and Y chromosome probes for cytogenetic studies on bone marrow cells after opposite sex transplantation Bone Marrow Transplant 1993; 12: 149–154 13 Dodero A, Carniti C, Raganato A, et al (2009), Haploidentical stem cell transplantation after a reduced-intensity conditioning regimen for the treatment of advanced hematologic malignancies: posttransplantation CD8-depleted donor lymphocyte infusions contribute to improve T-cell recovery, Blood, 113, 4771-4779 14 Doney KC, Loken MR, Bryant EM, et al (2008), Lack of utility of chimerism studies obtained two to three months after myeloablative haematopoietic cell transplantation for acute lymphocytic leukaemia, Bone Marrow Transplant, 42, 271–274 15 Grimwade D, Hills RK (2009), “Independent prognostic factors for AML outcome”,Hematology Am SocHematolEduc Program, pp 385-95 16 H Kreyenberg, W Ho ălle, S Mo ăhrle Quantitative analysis of chimerism after allogeneic stem cell transplantation by PCRamplification of microsatellite markers and capillary electrophoresis withfluorescence detection: the Tuebingen experience Leukemia (2003) 17, 237–240 17 http://phonglinh.com.vn/1488/news-detail/839430/tin-tuc/hoi-thao-khoa-hoc-ungdung-te-bao-goc-25-10-2013-.html 18 http://www.nihbt.org.vn/tin-hoat-dong/cac-de-tai-tham-gia-hoi-thao-cua-vien-deugianh-giai-cao/p114i8383.html 19 Khan F, Agarwal A, Agrawal S Significance of chimerism in hematopoietic stem cell transplantation: new variations on an old theme Bone Marrow Transplant 2004; 34(1):1-12 20 Lander ES, Linton LM, Birren B, et al Initial sequencing and analysis of the human genome Nature 2001; 409, 860-921 21 Lawler M, Humphries P, McCann SR Evaluation of mixed chimerism by in vitro amplification of dinucleotide repeat sequences using the polymerase chain reaction Blood 1991; 77,2504–2514 42 Đề tài vườn ươm 2014 Báo cáo nghiệm thu 22 Lazaruk K, Wallin J, Holt C, Nguyen T, Walsh PS (2001) Sequence variation in humans and other primates at six short tandem repeat loci used in forensic identity testing Forensic Sci Int; 119: 1–10 23 Liesveld JL and Lichtman MA (2010), “Acute Myelogenous Leukemia”, Williams Hematology, The Mc-Graw Hill Companies, 8, pp 1559-1632 24 Lion T, Watzinger F, Preuner S, et al The EuroChimerism concept for a standardized approach to chimerism analysis after allogeneic stem cell transplantation Leukemia 2012; 26, 1821 – 1828 25 Mrózek K, Heinonen K, Bloomfield CD (2001), “Clinical importance of cytogenetics in acute myeloid leukaemia”,Best Pract Res ClinHaematol, 14(1), pp 19-47 26 Oliver DH1, Thompson RE, Griffin CA, Eshleman JR Use of single nucleotide polymorphisms (SNP) and real-time polymerase chain reaction for bone marrowengraftmentanalysis J Mol Diagn, 2000;2(4):202-8 27 Powerplex 16 System Technical Manual No D012 Madison, WI:Promega Corporation, 2002, 3–7 28 Schaap N, Schattenberg A, Bar B, et al Red blood cell phenotyping is a sensitive technique for monitoring chronic myeloid leukaemia patients after T-cell-depleted bone marrow transplantation and after donor leucocyte infusion Br J Haematol 2000; 108: 116–125 29 Seong CM, GiraltS, Kantarjian H, et al Early detection of relapse by hypermetaphase fluorescence in situ hybridization after allogeneic bone marrow transplantation for chronic myeloid leukemia J Clin Oncol 2000; 18: 1831–1836 30 Thiede C, Bornhauser M, Ehninger G Evaluation of STR informativity for chimerism testing - comparative analysis of 27 STR systems in 203 matched related donor recipient pairs Leukemia 2004; 18, 248–254 31 Thiede C, Florek M, Bornhauser M, et al Rapid quantification of mixed chimerism using multiplex amplification of short tandem repeat and fluorescence detection Bone Marrow Transplant 1999; 23, 1055–1060 43 Đề tài vườn ươm 2014 Báo cáo nghiệm thu 32 Trần Văn Bé, “Bệnh leukemia cấp”, Lâm sàng Huyết học, Nhà xuất Y học,1998, tr 153-164 33 Walsh PS, Fildes NJ, Reynolds R Sequence analysis and characterization of stutter products at the tetranucleotide repeat locus vWA.Nucleic Acids Res; 1996, 24: 2807– 2812 44 Đề tài vườn ươm 2014 Báo cáo nghiệm thu PHỤ LỤC 1: CHUYÊN ĐỀ: “Đánh giá mặt phân tử sau dị ghép tế bào gốc tạo máu” 45 Đề tài vườn ươm 2014 Báo cáo nghiệm thu PHỤ LỤC 2: BÀI BÁO “Khảo sát dấu ấn STR sử dụng cho phân tích chimerism bệnh nhân dị ghép tế bào gốc tạo máu” 46 Đề tài vườn ươm 2014 Báo cáo nghiệm thu PHỤ LỤC 3: PHỤ LỤC QUẢN LÝ  Quyết định phê duyệt kinh phí;  Hợp đồng;  Thuyết minh đề cương phê duyệt 47 Đề tài vườn ươm 2014 Báo cáo nghiệm thu PHỤ LỤC Quy trình kỹ thuật multiplex PCR STR xác định chimerism sau ghép Mẫu người cho mẫu BN trước ghép sau ghép Ly trích DNA Kiểm tra nồng độ độ tinh máy đo quang phổ Multiplex PCR với 18 cặp mồi Phân tích kết điện di phần mềm GeneMapper Điện di sản phẩm PCR 48 Đề tài vườn ươm 2014 Báo cáo nghiệm thu Thu thập mẫu tủy xƣơng/ máu ngoại vi - Đối với mẫu trước ghép: thu thập mL máu ngoại vi người cho TBGTM BN dị ghép TBGTM - Đối với mẫu sau ghép: mL tủy máu ngoại vi BN thu thập Ly trích DNA Mẫu tủy xương máu ngoại vi ly trích GenElute blood genomic DNA kit (Sigma, Mỹ) Sản phẩm DNA sau ly trích kiểm tra nồng độ độ tinh máy đo quang phổ hai bước sóng 260 nm 280 nm.Pha lỗng sản phẩm DNA từ nồng độ sản phẩm tách chiết DNA thành 10 ng/µL Thực phản ứng multiplex PCR điện di sản phẩm máy điện di mao quản - Phản ứng multiplex PCR với 18 cặp mồi khuếch đại 18 dấu ấn STR phản ứng PCR (Bảng 2.1) kít thương mại PowerPlex 18D system (Promega, Mỹ) Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: 14 µL H2O Amplification Grade, µL Power Plex D5S X Master Mix, µL Power Plex 18D 5X Primer Mix, µL DNA (10 ng/µL) Tổng thể tích phản ứng PCR 25 µL - Chương trình ln nhiệt máy GeneAmp PCR System 2720 (Applied Biosystems, Mỹ) sau: 96oC 94oC phút 10 giây 60oC phút 49 60oC 20 phút 2x25 Đề tài vườn ươm 2014 Báo cáo nghiệm thu Điện di sản phẩm PCR - Hỗn hợp điện di gồm: 10 μl Hi-Di, μl ILS500 μl sản phẩm multiplex PCR Hỗn hợp điện di biến tính 960 C phút sốc nhiệt 00 C phút trước tiến hành điện di mao quản máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-4 polymer capillary 36 cm (Applied Biosystems) Điện di với hỗn hợp điện di mẫu chứng dương gồm: 10 μl Hi-Di, μl ILS500 μl chứng dương để kiểm chứng Phân tích kết điện di mao quản - Phân tích kết điện dimao quản phần mềm GeneMapper 3.1 (Applied Biosystems, Mỹ) Chuyển liệu sang phần mềm Excel để tính tốn tỷ lệ chimerism - Kết điện di mẫu DNA người cho TBGTM BN trước ghép phân tích để chọn dấu ấn STR mang thơng tin, có giá trị theo dõi điều trị sau ghép Đối với kết điện di mẫu DNA BN sau ghép, diện tích vùng đỉnh dấu ấn STR sử dụng để xác định tỷ lệ chimerism.Mỗi dấu ấn STR thơng tin sử dụng để tính tỷ lệ chimerism tương ứng.Tỷ lệ chimerism BN sau ghép giá trị trung bình tỷ lệ chimerism dấu ấn STR - Các dấu ấn STR thông tin thỏa mãn tiêu chuẩn (1) có allele khác kích thước người cho người nhận (2) khoảng cách allel phải tối thiểu đơn vị lặp lại Đồng thời, chiều cao đỉnh STR điện di phải > 50 RFU không vượt thang đo RFU [24] - Tính tỷ lệ chimerism loại dấu ấn STR thông tin theo công thức sau: ∑D CMR = x 100 ∑D + ∑R Trong đó: + ∑D: tổng diện tích vùng đỉnh dấu ấn mang thơng tin người cho + ∑R: tổng diện tích vùng đỉnh dấu ấn mang thông tin người nhận - Tỷ lệ chimerism trung bình bệnh nhân sau ghép: Trung bình tỷ lệ chimersm dấu ấn STR thông tin 50