Đánh giá tình trạng mọc mảnh ghép trên người bệnh ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài tại bệnh viện truyền máu huyết học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ĐỒN THỊ TUYẾT THU ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG MỌC MẢNH GHÉP TRÊN NGƯỜI BỆNH GHÉP TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU ĐỒNG LOÀI TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ĐỒN THỊ TUYẾT THU ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG MỌC MẢNH GHÉP TRÊN NGƯỜI BỆNH GHÉP TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU ĐỒNG LOÀI TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC NGÀNH: KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC MÃ SỐ: 8720601 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS PHAN THỊ XINH TS BS PHAN NGUYỄN THANH VÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân tơi trực tiếp thực Bệnh viện Truyền máu Huyết học hướng dẫn của: - PGS TS Phan Thị Xinh, Trưởng khoa Di truyền học phân tử - Bệnh viện Truyền máu Huyết học, Phó chủ nhiệm môn Huyết học – Đại học Y Dược TP HCM - TS BS Phan Nguyễn Thanh Vân, Phó Hiệu trưởng trường Đại học Y Phạm Ngọc Thạch Cơng trình không trùng lắp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu, kết thông tin luận văn trung thực khách quan Tác giả luận văn ĐOÀN THỊ TUYẾT THU MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Danh mục chữ viết tắt Tiếng Việt iv Danh mục chữ viết tắt Tiếng Anh v Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Danh mục biểu đồ sơ đồ ix ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài 1.1.1 Tế bào gốc tạo máu 1.1.2 Ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài 1.1.3 Biến chứng thường gặp sau ghép 1.1.4 Ứng dụng ghép tế bào gốc tạo máu 1.2 Theo dõi mọc mảnh ghép sau ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Các dạng chimerism sau ghép 1.2.3 Vai trò chimerism theo dõi sau ghép 10 1.2.4 Các kỹ thuật xác định chimerism sau ghép 11 1.3 Vòng nối thụ thể tế bào T (TREC) 16 1.3.1 Chức tế bào lympho T 16 1.3.2 Chức T cell receptor 18 1.3.3 Sự trưởng thành tế bào T hình thành TREC 19 1.3.4 Các kỹ thuật xác định tế bào T theo dõi ghép 21 1.4 Tình hình nghiên cứu 23 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.3 Trang thiết bị, hóa chất, y dụng cụ 27 2.4 Phương pháp tiến hành 28 2.4.1 Thu thập mẫu cặp người cho người nhận 28 2.4.2 Ly trích DNA 28 2.4.3 Đánh giá Chimerism 28 2.4.4 Định lượng TREC 32 2.4.5 Thu thập liệu 34 2.4.6 Xử lý số liệu 34 2.4.7 Đạo đức nghiên cứu 35 Chương KẾT QUẢ 36 3.1 Đặc điểm mẫu nghiên cứu 37 3.1.1 Đặc điểm chung người bệnh 37 3.1.2 Đặc điểm thể bệnh NB trước ghép 38 3.1.3 Đặc điểm người cho tế bào gốc 38 3.2 Tỷ lệ Chimerism NB sau ghép TBGTM đồng loài 39 3.2.1 Tỷ lệ STR sử dụng làm dấu ấn theo dõi sau ghép 39 3.2.2 Tỷ lệ Chimerism sau ghép 41 3.2.3 Kết chimerism sau ghép 43 3.3 Sự hồi phục tế bào T NB sau ghép TBGTM đồng loài 45 3.3.1 Kết định lượng TREC NB sau ghép N28±7, N60 N100 45 3.3.2 So sánh kết TREC nhóm ghép vào N60 46 3.3.3 So sánh kết TREC nhóm ghép vào N100 46 3.4 Mối liên quan chimerism, TREC đặc điểm ghép TBGTM đồng loài 48 3.4.1 Mối liên quan nhóm ghép thuận hợp HLA 10/10 48 3.4.2 Mối liên quan nhóm ghép Haplo 53 3.4.3 Mối liên quan tỷ lệ Chimerism hồi phục tế bào T 55 i Chương BÀN LUẬN 57 4.1 Đặc điểm mẫu nghiên cứu 57 4.1.1 Đặc điểm chung người bệnh 57 4.1.2 Đặc điểm thể bệnh người bệnh trước ghép 58 4.1.3 Đặc điểm người cho tế bào gốc 58 4.2 Tỷ lệ Chimerism NB sau ghép TBGTM đồng loài 60 4.2.1 Tỷ lệ STR sử dụng làm dấu ấn theo dõi sau ghép 60 4.2.2 Tỷ lệ Chimerism sau ghép 61 4.2.3 Kết chimerism sau ghép 61 4.3 Sự hồi phục tế bào T NB sau ghép TBGTM đồng loài 64 4.3.1 Kết định lượng TREC NB sau ghép N28±7, N60 N100 64 4.3.2 So sánh kết TREC nhóm ghép vào N60 N100 65 4.4 Mối liên quan chimerism, TREC đặc điểm ghép TBGTM đồng loài 67 4.4.1 Mối liên quan nhóm ghép thuận hợp HLA 10/10 68 4.4.2 Mối liên quan nhóm ghép haplo 69 4.4.3 Mối liên quan tỷ lệ Chimerism hồi phục tế bào T 69 KẾT LUẬN 72 KIẾN NGHỊ 74 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHIẾU THU THẬP MẪU PHỤ LỤC QUY TRÌNH THỰC HIỆN CHIMERISM VÀ ĐỊNH LƯỢNG VÒNG NỐI THỤ THỂ TẾ BÀO T (TREC) DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TIẾNG VIỆT BV TMHH Bệnh viện Truyền máu Huyết học NB Người bệnh CLS Cận lâm sàng cs Cộng ĐHT Đồng huyết thống MCR Máu cuống rốn MNV Máu ngoại vi N Ngày NST Nhiễm sắc thể GTBG Ghép tế bào gốc TBG Tế bào gốc TBGTM Tế bào gốc tạo máu TBM Tế bào máu TPHCM Thành phố Hồ Chí Minh DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TIẾNG ANH AA Aplastic Anemia (Thiếu máu bất sản tủy/ Suy tủy) ALL Acute lymphoblastic leukemia (Bạch cầu cấp dòng Lympho) AML Acute myelogenuos leukemia (Bạch cầu cấp dòng tủy) CC Complete Chimerism (chimerism hoàn toàn) CLL Chronic lymphocytic leukemia (Bạch cầu mãn tính dịng Lympho) CLP Common Lymphoid Progenitor (Tế bào tiền thân dòng lympho) CML Chronic myeloid leukemia (Bạch cầu mãn dòng tủy) CMML Chronic myelo-monocytic leukemia (Bạch cầu mãn dòng hạt Mono) CMP Common Myeloid Progenitor (Tế bào tiền thân dịng tủy) CR Complete Remission (Đáp ứng hốn toàn) DLI Donor Lympho Infusion (Truyền tế bào lympho từ người cho) DMC Decreasing Mixed Chimerism (Chimerism hỗn hợp giảm) DNA Deoxyribonucleic Acid (A xít Deoxyribonucleic) FISH Florescence In Situ Hybridization (Lai chỗ phát huỳnh quang) GVHD Graft versus host disease (Bệnh mảnh ghép chống ký chủ) GvL Graft versus Leukemia (Mảnh ghép chống bạch cầu) HLA Human leucocyte antigen (Kháng nguyên bạch cầu người) HT Haploidentical Transplantation (Ghép thuận hợp) IMC Increasing Mixed Chimerism (Chimerism hỗn hợp tăng) JMML Juvenile Myelomonocytic leukemia (bạch cầu đơn nhân thể thiếu niên) MC Mixed Chimerism (Chimerism hỗn hợp) MDS Myelodysplastic Syndrome (Hội chứng rối loạn sinh tủy) NK Natural Killer cell (Tế bào diệt tự nhiên) OS Overall Survival (Thời gian sống toàn bộ) i PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) RTE Recent Thymic Emigrant (Tế bào di cư tuyến ức) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RFS Free Survival Rates (Thời gian sống không tái phát bệnh) RFU Relative Fluorescence Units (Đơn vị huỳnh quang tương đối) SNP Single Nucleotide Polymorphism (Tính đa hình Nucleotide đơn) STR Short Tandem Repeat (Lặp lại song song đoạn ngắn) TCR T- Cell Receptor (Thụ thể tế bào T) TREC T- Cell Receptor Excision Circle (Vòng nối thụ thể tế bào T) i DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Chỉ định GTBG NB người lớn BV TMHH Bảng 1.2 Chỉ định GTBG NB trẻ em BV TMHH Bảng 1.3 So sánh kỹ thuật ứng dụng xác định chimerism 15 Bảng 2.1 Danh sách 18 dấu ấn STR PowerPlex 18D system kit 30 Bảng 2.2 Định nghĩa biến số nghiên cứu 34 Bảng 3.1 Đặc điểm NB trước ghép 37 Bảng 3.2 Đặc điểm thể bệnh 38 Bảng 3.3 Đặc điểm người cho tế bào gốc 38 Bảng 3.4 Tỷ lệ loại dấu ấn STR theo dõi chimerism sau ghép 39 Bảng 3.5 Số lượng STR sử dụng theo dõi sau ghép 40 Bảng 3.6 Chimerism hoàn toàn sau ghép với STR thông tin 41 Bảng 3.7 Chimerism hỗn hợp sau ghép với STR thông tin 42 Bảng 3.8 Kết TREC NB trước sau ghép 45 Bảng 3.9 Kết chimerism TREC (ghép thuận hợp HLA 10/10) 48 Bảng 3.10 Tỷ lệ Chimerism NB sau ghép N21 48 Bảng 3.11 Tỷ lệ Chimerism NB sau ghép N60 49 Bảng 3.12 Tỷ lệ Chimerism NB sau ghép N100 50 Bảng 3.13 Tỷ lệ TREC NB sau ghép N60 51 Bảng 3.14 Tỷ lệ TREC NB sau ghép N100 52 Bảng 3.15 Kết Chimerism TREC (ghép haplo) 53 Bảng 3.16 Tỷ lệ chimerism NB sau ghép haplo N100 53 Bảng 3.17 Tỷ lệ TREC NB sau ghép N100 (ghéo haplo) 54 Bảng 3.18 Thuận hợp HLA: TREC chimerism sau ghép N60 N100 55 Bảng 3.19 Ghép haplo: TREC chimerism sau ghép N60 N100 56 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN Đồn Thị Tuyết Thu, Cao Sỹ Luân, Vũ Quang Huy, Phan Nguyễn Thanh Vân, Phan Thị Xinh (2011), “Đánh giá tỷ lệ mọc mảnh ghép người bệnh ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài kỹ thuật multiplex PCR STR”, Tạp chí Y học Việt Nam, 496, tr 771-776 Bước đầu đánh giá hồi phục tế bào T phụ thuộc tuyến ức sau ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài (CS/TMHH/21/05) – Đề tài nghiên cứu khoa học cấp sở 2021, Quyết định công nhận nghiệm thu đề tài số 2399/QĐ-TMHH ngày 14/10/2021 Bệnh viện Truyền máu Huyết học Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Cao Sỹ Luân, Phan Thị Xinh (2013), "Bước đầu khảo sát Chimerism bệnh nhân dị ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài kỹ thuật multiplex PCR STR", 17(5): tr 167-172 Nguyễn Tấn Bỉnh (2016), Ghép tế bào gốc tạo máu - Nguyên lý thực hành, Nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Minh Yên (2016), Phân tích STR kỹ thuật Multiplex PCR để theo dõi Chimerism sau ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài, Luận văn thạc sĩ sinh học, Thành phố Hồ Chí Minh Phù Chí Dũng (2019), Phác đồ điều trị bệnh lý Huyết học, Nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh Trần Tuấn Anh, Vũ Thị Bích Hường, Võ Thị Thanh Bình, Dương Quốc Chính, Bạch Quốc Khánh, (2016), "Bước đầu ứng dụng thị phân tử indel để theo dõi mọc mảnh ghép tế bào gốc đồng loài Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương", 446: tr 927-936 Trần Văn Bé (2001), Ghép tủy xương, Nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh https://healthvietnam.vn/thu-vien/tai-lieu-tieng-viet/huyet-hoc-truyenmau/khang-nguyen-bach-cau-he-hla https://www.dieutri.vn/bgmiendich/te-bao-lympho-he-mien-dich Tiếng Anh https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technicalmanuals/101/powerplex-18d-system-protocol.pdf 10 Al-Harthi, L., et al (2000), "Detection of T cell receptor circles (TRECs) as biomarkers for de novo T cell synthesis using a quantitative polymerase chain reaction-enzyme linked immunosorbent assay (PCR-ELISA)", J Immunol Methods, 237(1-2): pp 187-97 11 Alizadeh, M., et al (2002), "Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerase chain reaction", Blood, 99(12): pp 4618-25 12 Antin, J.H., et al (2001), "Establishment of complete and mixed donor chimerism after allogeneic lymphohematopoietic transplantation: recommendations from a workshop at the 2001 Tandem Meetings of the International Bone Marrow Transplant Registry and the American Society of Blood and Marrow Transplantation", Biol Blood Marrow Transplant, 7(9): pp 47385 13 Ariffin, H., et al (2007), "Evaluation of two short tandem repeat multiplex systems for post-haematopoietic stem cell transplantation chimerism analysis", Singapore Med J, 48(4): pp 333-7 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 14 Bader P, K.H., Hoelle W, et al (2004), "Increasing mixed chimerism is an important prognostic factor for unfavorable outcome in children with acute lymphoblastic leukemia after allogeneic stem-cell transplantation: possible role for pre-emptive immunotherapy?", J Clin Oncol, 22(9): pp 1696-705 15 Bader, P., et al (2005), "How and when should we monitor chimerism after allogeneic stem cell transplantation?", Bone Marrow Transplant, 35(2): pp 107-19 16 Baron, F., et al (2004), "Kinetics of engraftment in patients with hematologic malignancies given allogeneic hematopoietic cell transplantation after nonmyeloablative conditioning", Blood, 104(8): pp 2254-62 17 Benito, A.I., et al (2001), "Allogeneic peripheral blood stem cell transplantation (PBSCT) from HLA-identical sibling donors in children with hematological diseases: a single center pilot study", Bone Marrow Transplant, 28(6): pp 537-43 18 Brookes, A.J (1999), "The essence of SNPs", Gene, 234(2): pp 177-86 19 Brown, J.A.S., K.; Kim, H.T.; Cutler, C.; Ballen, K.; McDonough, S.; Reynolds, C.; Herrera, M.; and D.H Liney, V (2010), "Clearance of CMV viremia and survival after double umbilical cord blood transplantation in adults depends on reconstitution of thymopoiesis", Blood 2010, 115: pp 4111–4119 20 Buño, I., et al (2005), "A comparison of fluorescent in situ hybridization and multiplex short tandem repeat polymerase chain reaction for quantifying chimerism after stem cell transplantation", Haematologica, 90(10): pp 1373-9 21 Cavazzana-Calvo, M., et al (2009), "Immune reconstitution after haematopoietic stem cell transplantation: obstacles and anticipated progress", Curr Opin Immunol, 21(5): pp 544-8 22 Chen, X., et al (2005), "Prediction of T-cell reconstitution by assessment of Tcell receptor excision circle before allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in pediatric patients", Blood, 105(2): pp 886-93 23 Clark, J.R., et al (2015), "Monitoring of chimerism following allogeneic haematopoietic stem cell transplantation (HSCT): technical recommendations for the use of short tandem repeat (STR) based techniques, on behalf of the United Kingdom National External Quality Assessment Service for Leucocyte Immunophenotyping Chimerism Working Group", Br J Haematol, 168(1): pp 26-37 24 Clave, E., et al (2009), "Acute graft-versus-host disease transiently impairs thymic output in young patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation", Blood, 113(25): pp 6477-84 25 Clave, E., et al (2005), "Prognostic value of pretransplantation host thymic function in HLA-identical sibling hematopoietic stem cell transplantation", Blood, 105(6): pp 2608-13 26 Copelan, E.A (2006), "Hematopoietic stem-cell transplantation", N Engl J Med, 354(17): pp 1813-26 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 27 Cruz, N.M., et al (2017), "Minimal residual disease in acute myelogenous leukemia", Int J Lab Hematol, 39 Suppl 1: pp 53-60 28 da Rocha, L.K.A., et al (2018), "Thymopoiesis in Pre- and Post-Hematopoietic Stem Cell Transplantation", Front Immunol, 9: pp 1889 29 Dewald, G.W., et al (1993), "Fluorescence in situ hybridization with X and Y chromosome probes for cytogenetic studies on bone marrow cells after opposite sex transplantation", Bone Marrow Transplant, 12(2): pp 149-54 30 Dion, M.L., et al (2004), "HIV infection rapidly induces and maintains a substantial suppression of thymocyte proliferation", Immunity, 21(6): pp 757-68 31 Doney, K., et al (2008), "Lack of utility of chimerism studies obtained 2-3 months after myeloablative hematopoietic cell transplantation for ALL", Bone Marrow Transplant, 42(4): pp 271-4 32 Doppelhammer, M., et al (2019), "Comparable outcome after haploidentical and HLA-matched allogeneic stem cell transplantation for high-risk acute myeloid leukemia following sequential conditioning-a matched pair analysis", Ann Hematol, 98(3): pp 753-762 33 Douek, D.C., et al (1998), "Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection", Nature, 396(6712): pp 690-5 34 Douek, D.C., et al (2000), "Assessment of thymic output in adults after haematopoietic stem-cell transplantation and prediction of T-cell reconstitution", Lancet, 355(9218): pp 1875-81 35 Eyrich, M., et al (2005), "Onset of thymic recovery and plateau of thymic output are differentially regulated after stem cell transplantation in children", Biol Blood Marrow Transplant, 11(3): pp 194-205 36 Fei, Y., et al (2019), "[Prognostic value of donor chimerism at +90 days after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in young patients with intermediate-risk acute myeloid leukemia]", Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi, 40(12): pp 990-995 37 Flowers, M.E., et al (2011), "Comparative analysis of risk factors for acute graftversus-host disease and for chronic graft-versus-host disease according to National Institutes of Health consensus criteria", Blood, 117(11): pp 32149 38 Fu, Y.W., et al (2007), "[Prediction of T-cell immune reconstitution by investigating T cell receptor excision circle and T-cell receptor beta-chain variable region clonal repertoire in leukemia patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation]", Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 87(32): pp 2265-7 39 Geenen, V., et al (2003), "Quantification of T cell receptor rearrangement excision circles to estimate thymic function: an important new tool for endocrine-immune physiology", J Endocrinol, 176(3): pp 305-11 40 Girgis, M., et al (2005), "Chimerism and clinical outcomes of 110 recipients of unrelated donor bone marrow transplants who underwent conditioning with Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 low-dose, single-exposure total body irradiation and cyclophosphamide", Blood, 105(8): pp 3035-41 Gluckman, E., et al (1975), "[Treatment of bone marrow aplasia by allogenic bone marrow grafts]", Nouv Presse Med, 4(16): pp 1177-82 Gonzalez-Vicent, M., et al (2017), "Donor age matters in T-cell depleted haploidentical hematopoietic stem cell transplantation in pediatric patients: Faster immune reconstitution using younger donors", Leuk Res, 57: pp 6064 Gratwohl, A., et al (2010), "Hematopoietic stem cell transplantation: a global perspective", JAMA, 303(16): pp 1617-24 Hahn, T., et al (2008), "Risk factors for acute graft-versus-host disease after human leukocyte antigen-identical sibling transplants for adults with leukemia", J Clin Oncol, 26(35): pp 5728-34 Hansen, G.S., et al (1977), "Lymphocyte chimerism after bone marrow transplantation Surface markers and in vitro function of donor and recipient lymphocyte subpopulations", Scand J Immunol, 6(4): pp 299-303 Hazenberg, M.D., et al (2000), "Increased cell division but not thymic dysfunction rapidly affects the T-cell receptor excision circle content of the naive T cell population in HIV-1 infection", Nat Med, 6(9): pp 1036-42 Jagasia, M., et al (2012), "Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation", Blood, 119(1): pp 296-307 Jimenez, M., et al (2005), "Reduced-intensity conditioning regimen preserves thymic function in the early period after hematopoietic stem cell transplantation", Exp Hematol, 33(10): pp 1240-8 Jiménez, M., et al (2006), "Clinical factors influencing T-cell receptor excision circle (TRECs) counts following allogeneic stem cell transplantation in adults", Transpl Immunol, 16(1): pp 52-9 Khan, F., A Agarwal, and S Agrawal (2004), "Significance of chimerism in hematopoietic stem cell transplantation: new variations on an old theme", Bone Marrow Transplant, 34(1): pp 1-12 Kreyenberg, H., et al (2003), "Quantitative analysis of chimerism after allogeneic stem cell transplantation by PCR amplification of microsatellite markers and capillary electrophoresis with fluorescence detection: the Tuebingen experience", Leukemia, 17(1): pp 237-40 Kristt, D., et al (2010), "Quantitative monitoring of multi-donor chimerism: a systematic, validated framework for routine analysis", Bone Marrow Transplant, 45(1): pp 137-47 Lawler, M., P Humphries, and S.R McCann (1991), "Evaluation of mixed chimerism by in vitro amplification of dinucleotide repeat sequences using the polymerase chain reaction", Blood, 77(11): pp 2504-14 Lewin, S.R., et al (2002), "Direct evidence for new T-cell generation by patients after either T-cell-depleted or unmodified allogeneic hematopoietic stem cell transplantations", Blood, 100(6): pp 2235-42 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 55 Lin, C.H., et al (2019), "Haploidentical allogeneic hematopoietic stem cell transplantation increases the risk of cytomegalovirus infection in adult patients with acute leukemia", Transpl Infect Dis, 21(4): pp e13096 56 Lion, T., et al (2012), "The EuroChimerism concept for a standardized approach to chimerism analysis after allogeneic stem cell transplantation", Leukemia, 26(8): pp 1821-8 57 Loeffler, J., et al (2002), "Quantification of T-cell receptor excision circle DNA using fluorescence resonance energy transfer and the LightCycler system", J Immunol Methods, 271(1-2): pp 167-75 58 Lorenzi, A.R., et al (2008), "Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method", J Immunol Methods, 339(2): pp 185-94 59 Lu, Y., et al (2020), "Unmanipulated haplo-identical donor transplantation compared with identical sibling donor had better anti-leukemia effect for refractory/relapsed acute myeloid leukemia not in remission status", Ann Hematol, 99(12): pp 2911-2925 60 Mikhael, N.L and M Elsorady (2019), "Clinical significance of T cell receptor excision circle (TREC) quantitation after allogenic HSCT", Blood Res, 54(4): pp 274-281 61 Mossallam, G.I., et al (2009), "Prognostic utility of routine chimerism testing at to months after allogeneic hematopoietic cell transplantation", Biol Blood Marrow Transplant, 15(3): pp 352-9 62 Nagler, A., et al (2021), "Outcome of haploidentical versus matched sibling donors in hematopoietic stem cell transplantation for adult patients with acute lymphoblastic leukemia: a study from the Acute Leukemia Working Party of the European Society for Blood and Marrow Transplantation", J Hematol Oncol, 14(1): pp 53 63 Niederwieser, D., et al (2016), "Hematopoietic stem cell transplantation activity worldwide in 2012 and a SWOT analysis of the Worldwide Network for Blood and Marrow Transplantation Group including the global survey", Bone Marrow Transplant, 51(6): pp 778-85 64 Nikolich-Zugich, J (2018), "The twilight of immunity: emerging concepts in aging of the immune system", Nat Immunol, 19(1): pp 10-19 65 Nollet, F., et al (2001), "Standardisation of multiplex fluorescent short tandem repeat analysis for chimerism testing", Bone Marrow Transplant, 28(5): pp 511-8 66 Odriozola, A., et al (2012), "Chimerism detection by short tandem repeat analysis when donor and recipient genotypes are not known", Clin Chim Acta, 413(5-6): pp 548-51 67 Okano, T., et al (2018), "Droplet Digital PCR-Based Chimerism Analysis for Primary Immunodeficiency Diseases", J Clin Immunol, 38(3): pp 300-306 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 68 Oliver, D.H., et al (2000), "Use of single nucleotide polymorphisms (SNP) and real-time polymerase chain reaction for bone marrow engraftment analysis", J Mol Diagn, 2(4): pp 202-8 69 Ozyurek, E., et al (2008), "Increasing mixed chimerism and the risk of graft loss in children undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation for non-malignant disorders", Bone Marrow Transplant, 42(2): pp 83-91 70 Park, M., et al (2011), "Clinical implications of chimerism after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in children with non-malignant diseases", Korean J Hematol, 46(4): pp 258-64 71 Przybylski, G.K., et al (2007), "No recovery of T-cell receptor excision circles (TRECs) after non-myeloablative allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is correlated with the onset of GvHD", J Appl Genet, 48(4): pp 397-404 72 Puck, J.M (2012), "Laboratory Technology for Population-Based Screening for Severe Combined Immunodeficiency in Neonates: The Winner Is T-Cell Receptor Excision Circles", Journal of Allergy and Clinical Immunology 129((3)): pp 607–16 73 Reshef, R., et al (2014), "Early donor chimerism levels predict relapse and survival after allogeneic stem cell transplantation with reduced-intensity conditioning", Biol Blood Marrow Transplant, 20(11): pp 1758-66 74 Robinson, T.M., et al (2016), "Haploidentical bone marrow and stem cell transplantation: experience with post-transplantation cyclophosphamide", Semin Hematol, 53(2): pp 90-7 75 Ruggeri, A., et al (2016), "Unrelated donor versus matched sibling donor in adults with acute myeloid leukemia in first relapse: an ALWP-EBMT study", J Hematol Oncol, 9(1): pp 89 76 Sairafi, D.M., J.; Uhlin, M.; Uzunel, M (2012), "Thymic function after allogeneic stem cell transplantation is dependent on graft source and predictive of long term survival", Clin Immunol, 142: pp 343–350 77 Schuster, J.A., et al (2012), "Expansion of hematopoietic stem cells for transplantation: current perspectives", Exp Hematol Oncol, 1(1): pp 12 78 Shah, D.K and J.C Zúñiga-Pflücker (2014), "An overview of the intrathymic intricacies of T cell development", J Immunol, 192(9): pp 4017-23 79 Stahl, T., et al (2015), "Digital PCR to assess hematopoietic chimerism after allogeneic stem cell transplantation", Exp Hematol, 43(6): pp 462-8 80 Stahl, T., et al (2016), "Digital PCR Panel for Sensitive Hematopoietic Chimerism Quantification after Allogeneic Stem Cell Transplantation", Int J Mol Sci, 17(9) 81 Steffens CM, A.-H.L., Shott S, et al (2000), "Evaluation of thymopoiesis using T cell receptor excision circles (TRECs): differential correlation between adult and pediatric TRECs and naïve phenotypes", Clin Immunol, (97): pp 95-101 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 82 Sugita, J., et al (2008), "T cell receptor excision circle levels in CD94-expressing CD8 T Cells during graft-versus-host disease", Leuk Lymphoma, 49(7): pp 1306-10 83 Sun DP, W.L., Ding CY, Liang JH, Zhu HY, Wu YJ, et al (2016), "Investigating fastors associated with thymic regeneration after chemotherapy in patients with lymphoma", Front Immunol, 7:654 84 Svaldi, M., et al (2003), "T-cell receptor excision circles: a novel prognostic parameter for the outcome of transplantation in multiple myeloma patients", Br J Haematol, 122(5): pp 795-801 85 Talvensaari, K., et al (2002), "A broad T-cell repertoire diversity and an efficient thymic function indicate a favorable long-term immune reconstitution after cord blood stem cell transplantation", Blood, 99(4): pp 1458-64 86 Talwar, S., et al (2007), "Chimerism monitoring following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation", Bone Marrow Transplant, 39(9): pp 529-35 87 Tanaka, J (2002), "Allogeneic peripheral blood stem cell transplantation (allo PBSCT) compared with allogeneic bone marrow transplantation (allo BMT)", Rinsho Ketsueki, 43(6): pp 442-6 88 Tang, X.W., et al (2004), "[Application of sequential and quantitative monitoring of chimerism in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation]", Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi, 25(2): pp 78-81 89 Thiede, C., M Bornhauser, and G Ehninger (2004), "Evaluation of STR informativity for chimerism testing comparative analysis of 27 STR systems in 203 matched related donor recipient pairs", Leukemia, 18(2): pp 248-54 90 Thiede, C., M Bornhauser, and G Ehninger (2004), "Strategies and clinical implications of chimerism diagnostics after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation", Acta Haematol, 112(1-2): pp 16-23 91 Thiede, C., et al (1999), "Rapid quantification of mixed chimerism using multiplex amplification of short tandem repeat markers and fluorescence detection", Bone Marrow Transplant, 23(10): pp 1055-60 92 Tiwari, A.K., et al (2015), "Probability of Finding Marrow Unrelated Donor (MUD) for an Indian patient in a Multi-national Human Leukocyte Antigen (HLA) Registry", Indian J Hematol Blood Transfus, 31(2): pp 186-95 93 Tong, Y., et al (2017), "Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation", Cell Physiol Biochem, 43(4): pp 1718-1730 94 Toubert, A., et al (2012), "Thymus and immune reconstitution after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in humans: never say never again", Tissue Antigens, 79(2): pp 83-9 95 Uzunel, M., et al (2014), "T-cell receptor excision circle levels after allogeneic stem cell transplantation are predictive of relapse in patients with acute Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome", Stem Cells Dev, 23(14): pp 1559-67 96 Valero-Garcia, J., et al (2019), "Earlier relapse detection after allogeneic haematopoietic stem cell transplantation by chimerism assays: Digital PCR versus quantitative real-time PCR of insertion/deletion polymorphisms", PLoS One, 14(2): pp e0212708 97 van den Brink, M.R., E Velardi, and M.A Perales (2015), "Immune reconstitution following stem cell transplantation", Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2015: pp 215-9 98 Vantourout, P and A Hayday (2013), "Six-of-the-best: unique contributions of γδ T cells to immunology", Nat Rev Immunol, 13(2): pp 88-100 99 Velardi, E., J.J Tsai, and M.R.M van den Brink (2021), "T cell regeneration after immunological injury", Nat Rev Immunol, 21(5): pp 277-291 100 Versluis, J., et al (2017), "Alternative donors for allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in poor-risk AML in CR1", Blood Adv, 1(7): pp 477485 101 Waterhouse, M., et al (2017), "Early mixed hematopoietic chimerism detection by digital droplet PCR in patients undergoing gender-mismatched hematopoietic stem cell transplantation", Clin Chem Lab Med, 55(8): pp 1115-1121 102 Weinberg, K., et al (2001), "Factors affecting thymic function after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation", Blood, 97(5): pp 1458-66 103 Weinberger, B., et al (2008), "Biology of immune responses to vaccines in elderly persons", Clin Infect Dis, 46(7): pp 1078-84 104 Weng, L., J Dyson, and F Dazzi (2007), "Low-intensity transplant regimens facilitate recruitment of donor-specific regulatory T cells that promote hematopoietic engraftment", Proc Natl Acad Sci U S A, 104(20): pp 841520 105 Yoshimi, A., et al (2010), "Hematopoietic SCT activity in Asia: a report from the Asia-Pacific Blood and Marrow Transplantation Group", Bone Marrow Transplant, 45(12): pp 1682-91 106 Yu, S., et al (2020), "Haploidentical versus HLA-matched sibling transplantation for refractory acute leukemia undergoing sequential intensified conditioning followed by DLI: an analysis from two prospective data", J Hematol Oncol, 13(1): pp 18 107 Zhang, L., et al (1999), "Measuring recent thymic emigrants in blood of normal and HIV-1-infected individuals before and after effective therapy", J Exp Med, 190(5): pp 725-32 108 Zhu, J and S.G Emerson (2002), "Hematopoietic cytokines, transcription factors and lineage commitment", Oncogene, 21(21): pp 3295-313 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC SỞ Y TẾ TP HỒ CHÍ MINH BV TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC KHOA DI TRUYỀN HỌC PHÂN TỬ PHIẾU THU THẬP MẪU Mã NB: Năm sinh: Giới: Họ tên NB: Số nhập viện: Thể bệnh: I TRƯỚC GHÉP Kết huyết đồ: CTBC: NEU % BC: K/µL LYM % HC: M/µL MONO % TC: K/µL EOS % BASO % BLAST % Kết tủy đồ: Kết dấu ấn miễn dịch: Phát đồ điều trị: Tình trạng lui bệnh MRD trước ghép: II QUÁ TRÌNH GHÉP: Kiểu ghép:  Haplo Sibling/ ĐHT Người cho tế bào gốc: Năm sinh: Unrelated/ Không ĐHT  Cùng giới  Khác giới Các biến chứng vào ngày đánh giá CMR (nếu có): Ngày mọc mảnh ghép Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Lưu ý: Kết quả: CMR TREC SLBC SLTC Tủy đồ Ghi (%D) N28 (±7 ngày) N60 (±15 ngày) N100 (±30 ngày) III TÌNH HÌNH HIỆN NAY: Triệu chứng lâm sàng: Kết huyết đồ: (ngày …tháng…năm….) BC: K/µL CTBC: NEU % HC: M/µL LYM .% TC: K/µL MONO % EOS % BASO % Kết tủy đồ: (ngày …tháng…năm….) BLAST % Kết dấu ấn miễn dịch (ngày …tháng…năm….) Ngày … tháng … năm …… Người thu thập Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC QUI TRÌNH THỰC HIỆN CHIMERISM VÀ ĐỊNH LƯỢNG VÒNG NỐI THỤ THỂ TẾ BÀO T (TREC) I Xử lí mẫu ➢ Thêm Red blood cell (RBC: tế bào hồng cầu) lysis buffer vào ống nghiệm Falcon 50 mL chứa mẫu máu cho đủ 50 mL (khoảng 30 mL RBC), trộn Ủ nhiệt độ phòng 10 phút ➢ Ly tâm 1.500 rpm phút nhiệt độ phòng máy ly tâm ống nghiệm 50 ml Hút bỏ dịch máy hút dịch pipette pasteur, thu cặn ➢ Thêm mL RBC lysis buffer vào ống nghiệm chứa cặn tế bào vừa thu được, trộn hút chuyển toàn sang ống nghiệm 1,5 mL ➢ Ly tâm 10.000 rpm khoảng 15 giây nhiệt độ phòng máy ly tâm ống nghiệm 1,5 mL Hút bỏ dịch dịch nổi, thu cặn tế bào ➢ Thêm mL Phosphate-Buffered Saline (PBS) (pH=7,4) vào ống nghiệm chứa tế bào, trộn ➢ Ly tâm với tốc độ nhanh khoảng 20 giây để lớp tế bào lắng máy ly tâm lạnh ống nghiệm 1,5 ml Hút bỏ dịch nổi, lấy lớp tế bào lắng lưu trữ - 200C ly trích DNA II Ly trích DNA (sử dụng ReliaPrep Blood gDNA Miniprep System kit) ➢ Chỉnh nhiệt độ máy ủ ổn định 560C ➢ Trộn mẫu máu cellpellet (tế bào lắng) cách trộn khoảng 10 giây máy trộn ống nghiệm ➢ Cho vào ống nghiệm 1,5 ml hóa chất sau: 20µl Proteinase K, 200µl mẫu máu 200µl Cell Lysis Buffer Trộn sau ly tâm nhẹ máy ly tâm ống nghiệm để kéo toàn dịch thành ống nghiệm xuống Ủ 10 phút 560C ➢ Chuẩn bị cột lọc ReliaPrepTM binding column Collection tube Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh ➢ Thêm 250µl Binding Buffer vào ống nghiệm 1,5ml chứa mẫu, Proteinase K Cell Lysis Buffer Trộn đều, ly tâm nhẹ máy ly tâm ống nghiệm ➢ Chuyển toàn hỗn hợp mẫu vào cột lọc chuẩn bị ly tâm ống nghiệm có cột lọc 14200 rpm/phút phút ➢ Ly tâm ống nghiệm có cột lọc thêm phút 14200 rpm/phút để chắn loại bỏ hết dịch phía màng ➢ Chuyển cột lọc qua Collection ống nghiệm thứ 2, thêm 500µl Column Wash Solution ly tâm 14200 rpm/phút phút, lặp lại bước thêm lần ➢ Chuyển cột lọc vào ống nghiệm 1,5ml (có ghi mã số, tên bệnh nhân, loại mẫu ngày thực hiện) Thêm 100µl Nuclease-Free Water vào cột ủ nhiệt độ phòng phút ➢ Ly tâm phút 14200 rpm/phút để thu DNA ➢ Sản phẩm DNA sau ly trích kiểm tra nồng độ độ tinh máy đo quang phổ hai bước sóng 260 nm 280 nm Mẫu DNA pha loãng với nước nuclease free water để có nồng độ DNA (ng/µL) thích hợp để sử dụng cho phản ứng PCR ➢ Thực tiếp quy trình Chimerism định lượng TREC ➢ Mẫu DNA lại lưu trữ vào hộp lưu mẫu 81 chỗ, nhiệt độ -180C đến 22oC năm III Thực Chimerism ➢ Phản ứng multiplex PCR với 18 cặp mồi khuếch đại 18 dấu ấn STR phản ứng PCR (bảng 2.1) kít thương mại PowerPlex 18D system (Promega, Mỹ) Pha hỗn hợp hóa chất vào ống nghiệm 0,2 mL bao gồm 14 µL Water Amplification Grade, µL PowerPlex D 5X Master Mix, µL PowerPlex 18D 5X Primer Pair Mix Trộn hỗn hợp máy vortex Sau thêm 1µL DNA (đã ly trích trên) nồng độ 10ng/ µL vào ống nghiệm 0,2 mL ➢ Chương trình luân nhiệt máy GeneAmp PCR System 2720 (Applied Biosystems, Mỹ) sau: 960C phút, (940C 10 giây, 600C Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh phút) x 25 chu kỳ, 600C 20 phút trì 4oC tiến hành điện di mao quản ➢ Mẫu sau thực phản ứng PCR điện di mao quản máy ABI 3130 ➢ Chuẩn bị hỗn hợp điện di ống nghiệm 0,5 mL đặt khay lạnh với thành phần cho phản ứng sau: μl Hi-Di + μl ILS500 ➢ Dùng pipet chia 9L cho phản ứng vào giếng đĩa PCR 96 giếng ➢ Thêm L DNA (mẫu, chứng dương) vào giếng thích hợp Trộn kỹ pipet tránh tạo bọt ➢ Mở máy PCR, cho đĩa 96 giếng vào máy PCR để biến tính 960C phút sốc nhiệt 00 C phút trước tiến hành điện di mao quản máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-4 polymer capillary 36 cm (Applied Biosystems) Gắn plate vào plate base plate retainer để chuẩn bị cho vào máy AB 3130 ➢ Đặt mẫu vào máy bắt đầu chạy chương trình điện di mao quản ➢ Sau chạy máy xong, kết phân tích phần mềm GeneMapper 3.1 (Applied Biosystems, Mỹ) Chiều cao peak STR điện di phải > 50 RFU không vượt thang đo RFU Kết dấu ấn STR thu được kiểm tra dựa theo danh sách 18 dấu ấn STR kít (bảng 2.1) để loại bỏ nguy bị xảy lỗi q trình PCR STR ➢ Kết phân tích xuất liệu sang dạng txt để chuyển qua phần mềm excel để tính tốn tỷ lệ chimerism IV Thực định lượng TREC ➢ Mở máy Realtime PCR, thiết lập chu trình nhiệt: 950C phút, (950C 30 giây, 600C phút) x 40 chu kỳ ➢ Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng định lượng TREC ống nghiệm 0,5 mL đặt khay lạnh với thành phần cho phản ứng sau: 10 µL Gene Expression Master Mix (2x) + 0,5 L Primers/ Probe, TREC (40x) + 0,5 L Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Primers/ Probe, Beta Actin (40x) + L Reaction Enhancer (20x) + L Nuclease Free water ➢ Dùng pipet chia 16 L cho phản ứng vào giếng dãy ống nghiệm 8-Well Real-Time PCR Strip Tubes 0,2 mL màu trắng để chạy mẫu ➢ Thêm L DNA (mẫu, calibrator DNA, chứng dương, chứng âm) vào giếng thích hợp ➢ Dãy ống nghiệm đưa vào máy Realtime để tiến hành phân tích mẫu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn