Bài viết được nghiên cứu với mục tiêu nhằm phát hiện gen độc lực eae, sxt và ipaH ở các chủng E. coli phân lập từ bệnh nhân (BN) tiêu chảy bằng phản ứng multiplex-PCR. Mời các bạn cùng tham khảo tài liệu.
Tạp chí y - dợc học quân số 2-2018 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR CHẨN ĐOÁN ESCHERICHIA COLI GÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI Nguyễn Đắc Trung*; Nguyễn Thị Thu Thái*; Trần Quang Cảnh** TÓM TẮT Mục tiêu: phát gen độc lực eae, sxt ipaH chủng E coli phân lập từ bệnh nhân (BN) tiêu chảy phản ứng multiplex-PCR Đối tượng phương pháp: chủng chuẩn E coli (EPEC, EIEC, EHEC EC) 23 chủng E coli phân lập từ BN tiêu chảy tách ADN tổng số trực tiếp từ khuẩn lạc vi khuẩn Khuếch đại gen eae, sxt ipaH chủng chuẩn E coli phản ứng PCR multiplex-PCR Sử dụng phản ứng multiplex-PCR với cặp mồi tương tự để phát đồng thời gen eae, sxt ipaH từ ADN genome chủng E coli phân lập từ BN tiêu chảy Kết kết luận: khuếch đại thành công gen độc lực eae, sxt ipaH chủng chuẩn EPEC, EIEC EHEC phản ứng PCR multiplex-PCR Với phản ứng multiplex-PCR, xác định 9/23 chủng E coli phân lập từ BN tiêu chảy có mang gen độc lực Trong chủng vi khuẩn thuộc nhóm EPEC (mang gen eae), chủng thuộc nhóm EIEC (mang gen sxt) chủng thuộc nhóm EHEC (mang đồng thời gen eae sxt) * Từ khóa: E coli; Multiplex-PCR; Gen eae, sxt, ipaH Multiplex-PCR Assay for Identification of Human Diarrheagenic Escherichia coli Summary Objectives: To identify virulent gene of eae, sxt and ipaH in the strains of E coli isolated from diarrhea patients by multiplex-PCR assay Subjects and methods: Four E coli strains (EPEC, EIEC, EHEC and EC) and 23 strains of E coli isolated from diarrhea patients were subjected to extract total DNA from bacterial colonies Amplification of eae, sxt and ipaH genes in the standard E coli strains were carried out by PCR and multiplex PCR Multiplex-PCR assays with similar primer pairs were used to simultaneously detect eae, sxt and ipaH genes from the genomic DNA of E coli strains isolated from diarrhea patients Results and conclusions: Eae, sxt and ipaH genes were successfully amplified in EPEC, EIEC and EHEC strains by PCR and multiplex-PCR By using multiplex-PCR, out of 23 strains of E coli isolated from diarrhea patients were identified Two strains of EPEC (possessed single eae, four strains of EIEC (carried single sxt) and three strains of EHEC (possessed both eae and sxt) * Keywords: E coli; Multiplex-PCR; Gene eae, sxt, ipaH * Trường Đại học Y-Dược Thái Nguyên ** Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Đắc Trung (dactrung69@gmail.com) Ngày nhận bài: 31/10/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 10/01/2018 Ngày báo đăng: 24/01/2018 32 Tạp chí y - dợc học quân số 2-2018 ĐẶT VẤN ĐỀ Có nhiều tác nhân đường ruột gây tiêu chảy ghi nhận virut, vi khuẩn, ký sinh trùng Trong số vi khuẩn, nhóm E coli gây tiêu chảy thường gặp nước phát triển [4] Dựa đặc điểm độc lực, chủng E coli gây tiêu chảy người phân thành nhóm STEC (shiga toxin producing E coli), ETEC (enterotoxigenic E coli), EPEC (enteropathogenic E coli), EIEC (enteroinvasive E coli), EHEC (enterohemorrhagic E coli), EaggEC (enteroaggregative E coli) DAEC (diffusely adherent E coli) [7] Những bệnh lý tiêu chảy E coli có phối hợp gen độc lực khác giúp cho vi khuẩn gắn bám, giải phóng yếu tố tan máu độc tố ruột Có khác biệt đáng kể trình tự đa hình thái tính đồng phân tử gen mã hóa cho yếu tố độc lực Trong số gen độc lực nhóm E coli gây tiêu chảy phải kể đến ipaH - gen nằm nhiễm sắc thể plasmid, mã hóa cho kháng nguyên 60 kDa phát chủng EIEC; gen nhiễm sắc thể eae (E coli attaching and effacing) mã hố cho protein màng ngồi có trọng lượng phân tử 94 - 97 kDa, gọi intimin, protein đóng vai trò quan trọng định vị vi khuẩn ruột Intimin gây tổn thương dạng bám dính phá huỷ đại tràng vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô Gen eae diện tất chủng EPEC, EHEC; chủng EHEC tạo cytotoxin, gọi độc tố Shiga sxt (Shiga toxins) Kỹ thuật multiplex-PCR phát triển để phát đồng thời vài gen độc lực E coli phản ứng PCR, kỹ thuật cho độ nhạy độ đặc hiệu cao phát chủng E coli gây tiêu chảy người [1, 2, 5, 6, 8] Việc xác định chủng E coli gây tiêu chảy Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên dựa thử nghiệm hóa sinh Vì vậy, chưa thể khẳng định chắn chủng vi khuẩn có thực gây tiêu chảy, mang gen độc lực hay không? Đề tài thực nhằm mục tiêu: Phát gen độc lực eae, sxt ipaH chủng E coli phân lập từ BN bị tiêu chảy phản ứng multiplex-PCR ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu chủng E coli chuẩn quốc tế Phòng Vi khuẩn Đường ruột, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp, gồm: EPEC, EHEC, EIEC EC (EC chủng đối chứng khơng có gen độc lực) 23 chủng E coli phân lập từ BN tiêu chảy điều trị Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên từ tháng 01 đến tháng - 2017 Phương pháp nghiên cứu Các chủng vi khuẩn E coli phân lập định danh hệ thống máy tự động Vitek compact 60 Các chủng chuẩn E coli E coli phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng nuôi cấy qua đêm môi trường thạch MPA, thu khuẩn lạc Tách trực tiếp ADN tổng số từ khuẩn lạc theo phương pháp Cebula CS [3] Khuếch đại gen độc lực eae, stx ipaH chủng E coli phản ứng PCR multiplex-PCR với mồi đặc hiệu 33 T¹p chÝ y - dợc học quân số 2-2018 cho gen eae 376 bp 5’-CACACGAATAAACTGACTAAAATG-3’, gen stx 298 bp: 5’-ACCGTTTTTCAGATTTTGCACATA-3’ gen ipaH 620 bp: 5’GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACC G-3’ Hỗn hợp PCR mix (Hãng Thermo Scientific) cho phản ứng multiplex-PCR gồm: 200 µM loại dNTP; 2,5 mM MgCI2; 0,2 pmol loại ADN mồi; U Taq ADN polymerase 1x đệm PCR (20 mM Tris-HCI, pH 8,4, 50 mM KCI), bổ sung nước khử ion tới thể tích 25 µl Trên hệ thống luân nhiệt BioRad, thực phản ứng PCR với chu trình nhiệt: phút biến tính 940C, 30 chu kỳ (940C/1 phút; 520C/1 phút; 720C/1 phút), chu kỳ tổng hợp cuối 720C/10 phút; chu trình nhiệt phản ứng multiplex-PCR: phút biến tính 940C, 35 chu kỳ (940C/1 phút; 520C/1 phút; 720C/1 phút), chu kỳ tổng hợp cuối 720C/10 phút Kiểm tra hiệu q trình khuếch đại kích thước sản phẩm PCR gel agarose 1,5% dung dịch đệm TAE 1x, nhuộm gel ethidium bromide chụp ảnh gel hệ thống ghi phân tích gel BioDoc KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết khuếch đại gen độc lực chủng chuẩn E coli phản ứng PCR * Gen độc lực eae: Trên sở nghiên cứu trình tự gen eae công bố Ngân hàng Gen quốc tế, cặp mồi đặc hiệu thiết kế nhằm khuếch đại gen kỹ thuật PCR Theo tính tốn lý thuyết, việc sử dụng cặp mồi eae cho phản ứng PCR khuếch 34 đại băng ADN có kích thước 376 bp chủng: EPEC EHEC Các chủng EIEC EC cho kết âm tính genome chúng khơng chứa gen Hình 1: Kết khuếch đại gen eae chủng chuẩn E coli (M: Marker ФX 174 cắt Hae III; 1: EPEC; 2: EIEC; 3: EHEC; 4: EC) Phân tích kết điện di cho thấy phân đoạn ADN khuếch đại có kích thước khoảng 376 bp gen eae, hồn tồn phù hợp với tính tốn lý thuyết Các chủng EPEC, EHEC cho kết dương tính, chủng EIEC EC âm, kết thu hoàn tồn phù hợp với nghiên cứu cơng bố [1, 5, 6, 8] Như vậy, sử dụng gen eae làm thị phân tử để chẩn đốn, khơng phân biệt E coli thuộc nhóm chủng EPECvà EHEC có ý nghĩa quan trọng để nhận biết E coli gây bệnh E coli thông thường * Gen độc lực stx: Các chủng thuộc E coli nhóm EHEC sinh độc tố cytotoxin hay Shiga toxin T¹p chÝ y - dợc học quân số 2-2018 (stx) Stx l mt protein có tính kháng ngun mạnh, mang tính chất ngoại độc tố, có gen mã hố nằm nhiễm sắc thể Hình 2: Kết khuếch đại gen stx chủng chuẩn E coli (M: Marker ФX 174 cắt Hae III; 1: EPEC; 2: EHEC; 3: EIEC; 4: EC) Trên hình ảnh điện di cho thấy băng ADN khuếch đại có kích thước khoảng 298 bp xuất chủng EHEC (đường số 2), chủng lại (EPEC, EIEC EC) khơng mang gen Kết hoàn toàn phù hợp với tính tốn lý thuyết * Gen độc lực ipaH: EIEC nhóm E coli gây bệnh chế xâm nhập vào tế bào biểu mô niêm mạc đại tràng Các gen mã hoá cho yếu tố liên quan đến trình nằm plasmid nhiễm sắc thể Những plasmid chứa số gen mã hố cho protein cần thiết q trình xâm nhập gồm IpaA, IpaB, IpaC, IpaD IpaH Trong đó, IpaH gen có E coli thuộc nhóm EIEC, gen có kích thước khoảng 620 bp [5, 6, 8] Trên sở đó, cặp mồi IpaH lựa chọn thiết kế để khuếch đại gen phản ứng PCR Hình 3: Kết khuếch đại gen ipaH chủng chuẩn E coli (M: Marker ФX 174 cắt Hae III; 1: EPEC; 2: EIEC; 3: EHEC; 4: EC) Kết điện di sau phản ứng PCR cho thấy băng ADN có kích thước khoảng 620 bp tìm thấy chủng EIEC (đường số 2); băng ADN có kích thước tương tự khơng thấy xuất chủng EPEC (đường 1), EHEC (đường 3) EC (đường 4) Do đó, gen sử dụng marker chuẩn cho nhận diện chủng EIEC Bảng 1: Kết khuếch đại gen độc lực chủng chuẩn E coli phản ứng PCR Gen Chủng EPEC EHEC EIEC EC eae (376 bp) + + - - stx (298 bp) - + - - ipaH (620 bp) - - + - 35 T¹p chÝ y - dợc học quân số 2-2018 Bng vic s dụng cặp mồi đặc hiệu, thông qua phản ứng PCR, nhóm nghiên cứu phát số gen độc lực ADN tách trực tiếp từ khuẩn lạc chủng chuẩn E coli Qua bảng cho thấy gen eae tìm thấy chủng EPEC EHEC, gen stx xuất chủng EHEC có chủng EIEC mang gen ipaH, chủng E coli thông thường không mang gen độc lực Kết thu phù hợp với nghiên cứu công bố giới Việt Nam [1, 2, 5, 6, 8] Như vậy, sử dụng gen độc lực eae, stx ipaH thị phân tử để phát chủng E coli gây tiêu chảy Nếu kết phản ứng PCR phát gen eae cho chủng E coli thuộc nhóm EPEC, gen ipaH chủng E coli nhóm EIEC, phát đồng thời hai gen eae ipaH, chứng tỏ chủng E coli thuộc nhóm EHEC Kết khuếch đại gen độc lực chủng chuẩn E coli phản ứng multiplex-PCR Đối với phản ứng PCR, để phát chủng E coli gây tiêu chảy (EPEC, EHEC EIEC), cần thực loạt phản ứng PCR khác với cặp mồi tương ứng đặc hiệu cho chủng vi khuẩn Với cách thức này, phản ứng PCR cho kết có độ xác cao, chưa thể coi phương pháp tối ưu, tốn nhiều thời gian hố chất, hạn chế phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đơn lẻ Để tìm phương pháp tối ưu hơn, kỹ thuật multiplex-PCR lựa chọn nghiên cứu, với phản ứng multiplex-PCR, cặp mồi đặc hiệu 36 sử dụng để khuếch đại đồng thời gen eae, stx ipaH có ADN khn tách trực tiếp từ khuẩn lạc chủng EPEC, EHEC EIEC Điều có nghĩa xác định chủng E coli gây tiêu chảy kể phản ứng PCR, giúp khắc phục hạn chế phản ứng PCR sử dụng cặp mồi riêng lẻ Hình 4: Kết khuếch đại gen độc lực phản ứng multiplex-PCR (1: EHEC; 2: EIEC; 3: EPEC; M: Marker ФX 174 cắt Hae III) Từ kết điện di sản phẩm phản ứng multiplex-PCR cho thấy, đường chạy xuất băng ADN rõ, khơng có sản phẩm phụ Tại đường chạy số (EHEC), thu băng ADN có kích thước khác nhau, đối chiếu với ADN marker chuẩn, băng có kích thước khoảng 298 bp (gen stx), băng lại có kích thước khoảng 376 bp (gen eae) Tại đường chạy số (EIEC) số (EPEC), thu băng ADN với kích thước khoảng 620 bp (gen ipaH) 376 bp (gen eae) Kết chúng tơi hồn tồn phù hợp với T¹p chÝ y - dợc học quân số 2-2018 tớnh toỏn lý thuyt với công bố số tác giả khác giới Việt Nam [1, 2, 5, 6, 8] Như vậy, khẳng định, nhóm nghiên cứu thực thành công kỹ thuật multiplexPCR với cặp mồi đặc hiệu để xác định gen độc lực giúp chẩn đoán nhanh chủng E coli gây tiêu chảy EPEC, EHEC EIEC Kết chẩn đoán chủng E coli gây tiêu chảy BN kỹ thuật multiplex-PCR Sau thực thành công phản ứng multiplex-PCR để phát gen độc lực eae, stx ipaH chủng E coli chuẩn quốc tế, nhóm nghiên cứu tiến hành phản ứng muliplex-PCR có sử dụng cặp mồi tương tự để xác định xem chủng E coli phân lập từ BN tiêu chảy lâm sàng có mang gen độc lực kể hay không? Kết cho thấy số chủng E coli phân lập từ BN có mang gen độc lực Bảng 2: Kết chẩn đoán E coli gây tiêu chảy phản ứng multiplex-PCR eae sxt ipaH Số chủng Chẩn đoán E.coli + - - EPEC - - + EIEC + + - EHEC - - - 14 Chưa xác định Trong tổng số 23 chủng E coli phân lập từ BN tiêu chảy lâm sàng, phản ứng multiplex-PCR phát chủng vi khuẩn mang gen độc lực eae, stx ipaH Những chủng vi khuẩn thuộc nhóm EPEC, EIEC EHEC có khả gây tiêu chảy 14 chủng E coli lại khơng tìm thấy gen độc lực khảo sát, điều lý giải chủng E coli thuộc nhóm EAEC, ETEC, STEC mà gen độc lực chủng chưa lựa chọn để phát nghiên cứu chủng vi khuẩn E coli thông thường đường ruột, không gây tiêu chảy KẾT LUẬN - Khuếch đại thành công gen độc lực eae, sxt ipaH chủng chuẩn EPEC, EIEC EHEC phản ứng PCR multiplex-PCR - Bằng phản ứng multiplex-PCR, xác định 9/23 chủng E coli phân lập từ BN tiêu chảy có mang gen độc lực Trong chủng vi khuẩn thuộc nhóm EPEC (mang gen eae), chủng thuộc nhóm EIEC (mang gen sxt) chủng thuộc nhóm EHEC (mang đồng thời gen eae sxt) TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Vũ Trung, Lê Huy Chính, Lê Văn Phủng, Andrej Weintraub Phát triển ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi chẩn đoán E coli gây tiêu chảy từ phân Tạp chí Nghiên cứu Y học 2003, tr.7-14 Bui T.H, Flemming S, Phung D.C, Oralak S, Tran T.H, Tran M.T, Anders D Diarrheagenic Escherichia coli and Shigella strains isolated from children in a hospital case-control study in Hanoi, Vietnam Journal of Clinical Microbiology 2008, 46 (3), pp.9961004 Cebula T.A, Payne W.L, Fegn P Simulataneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay multiplex-PCR J Clin Microbiol 1995, 33 (1), pp.248-250 37 Tạp chí y - dợc học quân số 2-2018 Davidson G, Barnes G, Bass D, Cohen M, Fasano A, Fontaine O, Guandalini S Infectious diarrhea in children: working group report of the First World Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition J Pediatr Gastroenterol Nutr 2002, 35 (2), pp.143-150 Jams P.N, Jams B.K Diarrheagenic Escherichia coli Clilical Microbioly Review 1998, 11 (1), pp.142-210 Sehand K.A, Layla IFS Identification of different categories of diarrheagenic Escherichia 38 coli in stool samples by using multiplex PCR technique Asian Journal of Medical Sciences 2010, (5), pp.237-243 Smith J.E, Fratamico P.M Diarrheainducing Escherichia coli In Foodborne pathogens: microbiology and molecular biology Caister Academic Press, Norfolk, UK 2005, pp.357-382 Tobias J, Vutukuru S.R Simple and rapid multiplex PCR for identification of the main human diarrheagenic Escherichia coli Microbiol Res 2012,167 (9), pp.564-570 ... công kỹ thuật multiplexPCR với cặp mồi đặc hiệu để xác định gen độc lực giúp chẩn đoán nhanh chủng E coli gây tiêu chảy EPEC, EHEC EIEC Kết chẩn đoán chủng E coli gây tiêu chảy BN kỹ thuật multiplex- PCR. .. lực chủng chuẩn E coli phản ứng multiplex- PCR Đối với phản ứng PCR, để phát chủng E coli gây tiêu chảy (EPEC, EHEC EIEC), cần thực loạt phản ứng PCR khác với cặp mồi tương ứng đặc hiệu cho chủng... multiplex- PCR phát triển để phát đồng thời vài gen độc lực E coli phản ứng PCR, kỹ thuật cho độ nhạy độ đặc hiệu cao phát chủng E coli gây tiêu chảy người [1, 2, 5, 6, 8] Việc xác định chủng E coli gây