Sử dụng chỉ thị màu phát hiện nhanh vi khuẩn escherichia coli gây tiêu chảy ở người bằng kỹ thuật phân tử

Tiêu chảy là một trong những bệnh thường gặp, gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe và chất lượng sống của con người, đặc biệt ở trẻ em. Theo Tổ chức Y tế Thế giới mỗi năm có khoảng 1,7 tỷ lượt trẻ em bị tiêu chảy và là nguyên nhân gây tử vong của khoảng 525.000 trẻ em trên toàn thế giới 63. Tại Việt Nam, ước tính có khoảng hơn 1 triệu ca tiêu chảy mỗi năm, dịch thường diễn ra trong 4 tháng, từ tháng 4 đến tháng 7 hàng năm 4. Tây Bắc Bộ, Tây Nguyên và Đồng bằng Sông Hồng là những khu vực có tỷ lệ mắc tiêu chảy cao nhất, các vùng có tỷ lệ tiêu chảy thấp nhất là Đông Nam Bộ và Bắc Trung Bộ 4. Tiêu chảy còn là nguyên nhân hàng đầu gây suy dinh dưỡng, chậm phát triển cả về thể chất và tinh thần của trẻ và là gánh nặng về kinh tế cho gia đình và cho toàn xã hội, đặc biệt ở những nước đang phát triển trong đó có Việt Nam 1, 53, 63. Có nhiều tác nhân đường ruột gây tiêu chảy đã được ghi nhận như vi khuẩn, vi rút, kí sinh trùng, nấm... Trong số các vi khuẩn gây tiêu chảy thì vi khuẩn E. coli thường gặp hơn cả, chiếm khoảng 20% trong số các tác nhân gây tiêu chảy 5. Dựa trên đặc điểm độc lực, các chủng vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy ở người được phân thành các nhóm: STEC (shiga toxin producing E. coli), ETEC (enterotoxigenic E. coli), EPEC (enteropathogenic E. coli), EIEC (enteroinvasive E. coli), EHEC (enterohemorrhagic E. coli), EaggEC (enteroaggregative E. coli) và DAEC (diffusely adherent E. coli) 2, 7, 52. Những bệnh lý tiêu chảy do vi khuẩn E. coli có sự phối hợp của các gen độc lực khác nhau giúp cho vi khuẩn gắn bám, giải phóng yếu tố tan máu và các độc tố ruột 2. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện vi sinh vật gây bệnh, bao gồm cả những phương pháp truyền thống và các phương pháp phân tử hiện đại. Tuy nhiên, trong chẩn đoán tiêu chảy do vi khuẩn E. coli các phương pháp phân lập trên môi trường chọn lọc, thử các tính chất sinh hóa có thể phát hiện vi khuẩn E. coli nhưng không thể phân biệt giữa các vi khuẩn E. coli hội sinh cư trú bình thường ở đường ruột với các vi khuẩn E. coli mang gen độc lực gây bệnh. Các phương pháp sinh học phân tử như: PCR, RTPCR, multiplex PCR... khắc phục được những nhược điểm này do có khả năng phát hiện chính xác các gen độc lực gây bệnh. Tuy nhiên, các phương pháp này mất nhiều thời gian và cần các máy móc chuyên dụng đắt tiền, do vậy chỉ có thể tiến hành ở những nơi có điều kiện cở sở vật chất được trang bị tốt, khó áp dụng được cho các tuyến y tế cơ sở. Với mong muốn tìm ra một phương pháp chẩn đoán nhanh nhưng vẫn đảm bảo độ chính xác, có thể tiến hành bằng các thiết bị đơn giản dễ dàng áp dụng rộng rãi tại các tuyến y tế cơ sở nhằm góp phần nâng cao hiệu quả trong phòng chống, kiểm soát và điều trị vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy ở người chúng tôi tiến hành đề tài: “Sử dụng chỉ thị màu phát hiện nhanh vi khuẩn Escherichia coli gây tiêu chảy ở người bằng kỹ thuật phân tử” Với mục tiêu sau: 1. Phát hiện nhanh vi khuẩn E. coli mang gen eae gây tiêu chảy ở người bằng kĩ thuật LAMP. 2. Xây dựng được sơ đồ phát hiện vi khuẩn E. coli mang gen eae gây tiêu chảy bằng kĩ thuật LAMP ở quy mô phòng thí nghiệm. Nội dung nghiên cứu: Phân lập vi khuẩn E. coli từ các mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy thu được tại Khoa Vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. Xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng E. coli và phân loại dựa vào trình tự gen mã hóa rDNA 16S của một số chủng E. coli. Sử dụng kĩ thuật PCR để phát hiện gen độc lực eae của vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy ở người. Sử dụng kĩ thuật LAMP để phát hiện gen độc lực eae của vi khuẩn E. coli và nhận biết sản phẩm phản ứng bằng các chỉ thị màu. Xây dựng sơ đồ phát hiện vi khuẩn E. coli mang gen eae gây tiêu chảy bằng phương pháp LAMP và nhận biết bằng các chỉ thị màu.

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát bệnh tiêu chảy người 1.2.1 Hình thái 1.2.2 Tính chất ni cấy 1.2.3 Tính chất sinh hóa 1.2.5 Khả gây bệnh vi khuẩn E coli .7 1.2.6 Phân loại vi khuẩn E coli CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.2 Địa điểm nghiên cứu 28 DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát bệnh tiêu chảy người 1.2.1 Hình thái 1.2.2 Tính chất ni cấy 1.2.3 Tính chất sinh hóa 1.2.5 Khả gây bệnh vi khuẩn E coli .7 1.2.6 Phân loại vi khuẩn E coli CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.2 Địa điểm nghiên cứu 28 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Vi khuẩn E coli .5 Hình 1.2 Bộ kit API-20E với giếng phản ứng sinh hóa 14 Hình 1.3 Nguyên tắc thiết kế mồi cho phản ứng LAMP 19 Hình 1.4 Nguyên lý khuếch đại DNA phản ứng LAMP 22 Hình 1.5 Quy trình phát tác nhân gây bệnh phương pháp LAMP .23 Hình 1.6 Nguyên tắc phát quang Calcein 24 Hình 1.7 Phát phản ứng LAMP đo độ đục, huỳnh quang soi đèn UV 25 Hình 2.1 Sơ đồ bước thực trình nghiên cứu 30 Hình 3.1 Hình dạng khuẩn lạc môi trường DCL 37 Hình 3.2 Hình ảnh nhuộm Gram E1-E25 38 Hình 3.3 Kết phẩn ứng sinh hóa chủng E1, E2, E10, E11, E25 .39 Hình 3.4 Kết điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA .42 Hình 3.5 Kết PCR đoạn gen 16S rDNA E1, E2, E4 43 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR gen eae 25 chủng vi khuẩn E coli .48 Hình 3.7 Kết khuếch đại gen eae PCR (A) LAMP (B) .50 Hình 3.8 Giới hạn phát (A) phản ứng PCR, (B) phản ứng LAMP 51 Hình 3.9 Phát sản phẩm LAMP thị Calcein 53 Hình 3.10 Phát sản phẩm LAMP thị Calcein ánh sáng UV 53 Hình 3.11 Phát sản phẩm LAMP thị màu SYBR Green I .54 Hình 3.12 Sơ đồ bước tiến hành chẩn đốn vi khuẩn E coli từ phân .55 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair DCL Deoxycholate Citrate Lactose DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate E coli Escherichia coli E ictaluri Edwardsiella ictaluri EA/EAEC Enteroadherent E coli EDTA Ethylene diaminete traacetic acid EH1/EHEC1 Enterohaemorrhagic E coli EH2/EHEC2 Enterohaemorrhagic E coli EI/EIEC Enteroinvasive E coli ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay EP/EPEC Enteropathogenic E coli ET/ETEC Enterotoxigenic E coli Kb Kilobase kDa Kilodalton LAMP Loop-mediated isothermal amplifications ONPG Ortho - nitrophenyl - β - D - galactoryranoside PCR Polymerase Chain Reaction rDNA Ribosomal DNA RT - PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction S aureus Staphylococcus aureus SS Shigella - Salmonella TAE Tris - acetic acid EDTA TE Tris - HCl EDTA WHO World Health Organization ĐẶT VẤN ĐỀ Tiêu chảy bệnh thường gặp, gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe chất lượng sống người, đặc biệt trẻ em Theo Tổ chức Y tế Thế giới năm có khoảng 1,7 tỷ lượt trẻ em bị tiêu chảy nguyên nhân gây tử vong khoảng 525.000 trẻ em tồn giới [63] Tại Việt Nam, ước tính có khoảng triệu ca tiêu chảy năm, dịch thường diễn tháng, từ tháng đến tháng hàng năm [4] Tây Bắc Bộ, Tây Nguyên Đồng Sơng Hồng khu vực có tỷ lệ mắc tiêu chảy cao nhất, vùng có tỷ lệ tiêu chảy thấp Đông Nam Bộ Bắc Trung Bộ [4] Tiêu chảy nguyên nhân hàng đầu gây suy dinh dưỡng, chậm phát triển thể chất tinh thần trẻ gánh nặng kinh tế cho gia đình cho toàn xã hội, đặc biệt nước phát triển có Việt Nam [1], [53], [63] Có nhiều tác nhân đường ruột gây tiêu chảy ghi nhận vi khuẩn, vi rút, kí sinh trùng, nấm Trong số vi khuẩn gây tiêu chảy vi khuẩn E coli thường gặp cả, chiếm khoảng 20% số tác nhân gây tiêu chảy [5] Dựa đặc điểm độc lực, chủng vi khuẩn E coli gây tiêu chảy người phân thành nhóm: STEC (shiga toxin producing E coli), ETEC (enterotoxigenic E coli), EPEC (enteropathogenic E coli), EIEC (enteroinvasive E coli), EHEC (enterohemorrhagic E coli), EaggEC (enteroaggregative E coli) DAEC (diffusely adherent E coli) [2], [7], [52] Những bệnh lý tiêu chảy vi khuẩn E coli có phối hợp gen độc lực khác giúp cho vi khuẩn gắn bám, giải phóng yếu tố tan máu độc tố ruột [2] Hiện nay, có nhiều phương pháp khác để phát vi sinh vật gây bệnh, bao gồm phương pháp truyền thống phương pháp phân tử đại Tuy nhiên, chẩn đoán tiêu chảy vi khuẩn E coli phương pháp phân lập môi trường chọn lọc, thử tính chất sinh hóa phát vi khuẩn E coli phân biệt vi khuẩn E coli hội sinh cư trú bình thường đường ruột với vi khuẩn E coli mang gen độc lực gây bệnh Các phương pháp sinh học phân tử như: PCR, RT-PCR, multiplex PCR khắc phục nhược điểm có khả phát xác gen độc lực gây bệnh Tuy nhiên, phương pháp nhiều thời gian cần máy móc chuyên dụng đắt tiền, tiến hành nơi có điều kiện cở sở vật chất trang bị tốt, khó áp dụng cho tuyến y tế sở Với mong muốn tìm phương pháp chẩn đoán nhanh đảm bảo độ xác, tiến hành thiết bị đơn giản dễ dàng áp dụng rộng rãi tuyến y tế sở nhằm góp phần nâng cao hiệu phòng chống, kiểm sốt điều trị vi khuẩn E coli gây tiêu chảy người tiến hành đề tài: “Sử dụng thị màu phát nhanh vi khuẩn Escherichia coli gây tiêu chảy người kỹ thuật phân tử” Với mục tiêu sau: Phát nhanh vi khuẩn E coli mang gen eae gây tiêu chảy người kĩ thuật LAMP Xây dựng sơ đồ phát vi khuẩn E coli mang gen eae gây tiêu chảy kĩ thuật LAMP quy mơ phòng thí nghiệm Nội dung nghiên cứu: - Phân lập vi khuẩn E coli từ mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy thu Khoa Vi sinh - Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên - Xác định số đặc điểm sinh hóa chủng E coli phân loại dựa vào trình tự gen mã hóa rDNA 16S số chủng E coli - Sử dụng kĩ thuật PCR để phát gen độc lực eae vi khuẩn E coli gây tiêu chảy người - Sử dụng kĩ thuật LAMP để phát gen độc lực eae vi khuẩn E coli nhận biết sản phẩm phản ứng thị màu - Xây dựng sơ đồ phát vi khuẩn E coli mang gen eae gây tiêu chảy phương pháp LAMP nhận biết thị màu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát bệnh tiêu chảy người 1.1.1 Khái niệm tiêu chảy Tiêu chảy tình trạng ngồi phân lỏng bất thường (phân tóe nước, phân có nhày máu, mủ ) từ lần trở lên vòng 24 Kèm theo triệu chứng nơn, sốt, đau bụng, chóng mặt, mệt mỏi Trên lâm sàng, tiêu chảy chia làm ba loại: tiêu chảy cấp tính với thời gian từ vài đến không 14 ngày bao gồm dịch tả, tiêu chảy máu cấp tính hay gọi bệnh lỵ tiêu chảy kéo dài với thời gian 14 ngày [1], [63] Tiêu chảy gặp lứa tuổi, người lớn bệnh thường nguy hiểm đến tính mạng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, khả lao động sinh hoạt người bệnh Tiêu chảy nguy hiểm trẻ em tuổi, đặc biệt trẻ từ đến tuổi Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới, tỷ lệ mắc tiêu chảy trung bình trẻ em tuổi lần/ trẻ em/ năm Tuy nhiên, số nước phát triển số cao tới 12 lần/trẻ em/năm [63] Tại Việt Nam, số nghiên cứu cho biết, số lần bị tiêu chảy năm trẻ 2,2 lần [1] Đây bệnh đứng thứ hai tỷ lệ tử vong trẻ tuổi sau nhiễm khuẩn đường hơ hấp, 80% số ca tử vong trẻ từ 0-2 tuổi [1], [63] Nguyên nhân gây tử vong bị tiêu chảy nước điện giải, suy dinh dưỡng Suy dinh dưỡng tiêu chảy tạo thành vòng xoắn bệnh lý: tiêu chảy dẫn đến suy dinh dưỡng trẻ bị suy dinh dưỡng lại có nguy bị tiêu chảy cao [1], [63] 1.1.2 Nguyên nhân gây tiêu chảy Có nhiều tác nhân dẫn đến tiêu chảy Trong đó, vi rút nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy trẻ em Những loại vi rút gây tiêu chảy thường gặp Rotavirus, Adenovirus, Norwalk virus, Rotavirus tác nhân gây bệnh cho trẻ em tuổi Một số vi khuẩn nguyên nhân gây tiêu chảy thường gặp như: E coli, Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae [1], [6], [63] Vi khuẩn E coli đường ruột xác định nguyên nhân hàng đầu gây số ca tiêu chảy cấp từ vừa tới nặng người Chủng E coli O157H7 gây vụ dịch vào năm 1982, Mỹ, kể từ đó, E coli O157H7 trở thành mầm bệnh quan trọng nhóm bệnh lây qua thực phẩm [49] Gần nhất, năm 2011, E coli O104H4 xác định nguyên nhân gây dịch tiêu chảy kèm theo tan máu urê miền Bắc nước Đức lan 15 nước Châu Âu Chỉ tính riêng Đức E coli O104H4 gây 4000 ca nhiễm bệnh 60 ca tử vong [14] Nhiễm kí sinh trùng đơn bào Entamoeba histolytica, Giardia lamblia thường phát nguyên nhân gây tiêu chảy Suy dinh dưỡng, dị ứng thức ăn, hay tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh nước phát triển góp phần làm cho nguy mắc tiêu chảy gia tăng [1], [55], [63] Theo nghiên cứu Nguyễn Yến Bình (2003), số tác nhân gây tiêu chảy thường gặp trẻ em Việt Nam đứng đầu Rotavirus chiếm tỷ lệ cao (39,3%), vi khuẩn E coli (21,0%), vi khuẩn Shigella (6,7%), vi khuẩn Campylobacter (6,0%) gặp vi khuẩn Salmonella (1,0%) [6] 1.1.3 Đường lây truyền Cũng giống hầu hết tác nhân gây tiêu chảy khác, vi khuẩn E coli lây truyền chủ yếu qua đường tiêu hóa, thơng qua thực phẩm nhiễm khuẩn, nước uống bị nhiễm phân người súc vật mang mầm bệnh Theo WHO, tồn giới có khoảng 780 triệu người không tiếp cận với nguồn nước 2,5 tỷ người thiếu kiện điều vệ sinh [1], [55], [63] Do đó, điều kiện thuận lợi cho tiêu chảy nhiễm trùng lan rộng khắp nước phát triển Tại Việt Nam, tập quán chăn nuôi gia súc thả rông, giết mổ nhỏ lẻ nhà dân không qua kiểm dịch, nguồn nước dùng cho chăn nuôi, nuôi trồng sử dụng canh tác nông nghiệp ô nhiễm tiềm ẩn nhiều nguy bùng phát dịch tiêu chảy Ngoài ra, vi khuẩn E coli lây truyền từ người sang người khác thông qua tiếp xúc, chủ yếu qua bàn tay, đồ vật nhiễm bẩn với phân người bệnh Đây đường lây quan trọng thành viên gia đình, gia đình có trẻ mắc tiêu chảy lây thành viên tập thể trường học, nhà trẻ [1] 1.2 Vi khuẩn E coli gây tiêu chảy người Vi khuẩn E coli phân lập mô tả lần vào năm 1885 nhà nghiên cứu người Đức Theodor Escherich [2] Theo phân loại khoa học, vi khuẩn E coli thuộc: - Giới: Bacteria - Ngành: Proteobacteria - Lớp: Gramma Proteobacteria - Bộ: Enterobacteriales - Họ: Enterobacteriaceae - Giống: Escherichia - Loài: coli - Tên khoa học: Escherichia coli 1.2.1 Hình thái Vi khuẩn E coli trực khuẩn, kích thước dài ngắn khác nhau, trung bình từ 2-3 µm, rộng 0,5 µm, đơi mơi trường ni cấy trực khuẩn dài 6-8 µm, trực khuẩn có vỏ, có lơng, di động (có thể số chủng không di động), không sinh nha bào bắt màu Gram âm [2] A B Hình 1.1 Vi khuẩn E coli (A): kính hiển vi điện tử (B) nhuộm Gram Hình ảnh của: Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH 1.2.2 Tính chất ni cấy E coli vi khuẩn hiếu kị khí tuỳ tiện, phát triển nhiệt độ 15-40 oC, tốt 37oC, pH 7,0-7,2 Trong môi trường lỏng, sau 4-5 vi khuẩn E coli làm đục nhẹ môi trường, để lâu đục nhiều, sau vài ngày có váng mỏng bề mặt mơi trường, để lâu vi khuẩn lắng xuống đáy ống Trên môi trường thạch thường, sau 18-24 khuẩn lạc có hình tròn, bờ đều, bóng, khơng màu hay màu xám nhẹ, đường kính 2-3 mm Trên mơi trường phân lập, vi khuẩn E coli thường làm thay đổi màu môi trường lên men đường lactose, khuẩn lạc có màu vàng môi trường Istrati, màu đỏ môi trường SS, màu hồng mơi trường DCL [2] 1.2.3 Tính chất sinh hóa Vi khuẩn E coli lên men sinh số loại đường thông thường lactose, glucose, manitol, ramnose v.v Căn vào khả lên men đường lactose cho phép phân biệt vi khuẩn E coli với số vi khuẩn đường ruột khác Thử nghiệm ONPG (+), urease (-), H2S (-), LDC (+) Nghiệm pháp IMVIC: I + M + - - V I C : indol (+), đỏ methyl (+), vosges proskauer (-), lên men đường inositol (-), Simmons citrat (-) Sức đề kháng: vi khuẩn E coli có sức đề kháng yếu, bị tiêu diệt chất sát khuẩn thông thường nước javel 1/200, phenol 1/200 sau 2-4 phút Nhiệt độ 55oC giết chết vi khuẩn E coli sau 60oC sau 30 phút [2] 1.2.4 Cấu tạo kháng nguyên Cấu tạo kháng nguyên vi khuẩn E coli phức tạp, E coli có đủ loại kháng nguyên O, H K [2] Kháng nguyên O: kháng nguyên thân, có đến 142 loại, dựa vào kháng nguyên O để phân chia vi khuẩn E coli thành 142 typ huyết Kháng nguyên K: kháng nguyên bề mặt, dựa vào nhạy cảm với nhiệt độ kháng nguyên này, người ta chia kháng nguyên thành loại A, B, L Kháng nguyên A bền vững với nhiệt độ, kháng nguyên L không bền vững với nhiệt độ kháng ngun B có tính chất trung gian hai loại kháng nguyên Kháng nguyên H: kháng nguyên lông, ghi số 1, 2, 3, 4, v.v có 48 loại khác KẾT LUẬN Đã phân lập xác định đặc điểm hóa sinh điển hình 25 chủng vi khuẩn E coli từ mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên Tỷ lệ vi khuẩn E coli mang gen độc eae 13/25 chiếm 54% Đã ứng dụng thành công phương pháp LAMP để xác định gen độc lực gây bệnh eae vi khuẩn E coli Đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân gen eae đặc trưng vi khuẩn E coli gây tiêu chảy phân lập Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên kĩ thuật LAMP Đồng thời ứng dụng thành công việc phát sản phẩm phản ứng LAMP mắt thường thị kim loại Calcein thị SYBR Green I Bộ mồi LAMP khuếch đại gen eae hoàn toàn đặc hiệu cho với giới hạn phát 1.5 pg, cao gấp 100 lần so với phương pháp PCR với độ đặc hiệu cạo Đã xây dựng sơ đồ phát vi khuẩn E coli mang gen eae gây tiêu chảy kĩ thuật LAMP phòng thí nghiệm 56 KIẾN NGHỊ Tiếp tục hoàn thiện phương pháp LAMP để xác định gen độc lực khác gây bệnh tiêu chảy vi khuẩn E coli nghiên cứu với số mẫu lớn để đánh giá tỷ lệ loại vi khuẩn E coli gây tiêu chảy bệnh nhân Tối ưu hóa phản ứng LAMP để phát vi khuẩn E coli gây tiêu chảy tác nhân gây bệnh khác ứng dụng kĩ thuật LAMP sở khám chữa bệnh tỉnh Thái Nguyên 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Y tế (2009), Tài liệu hướng dẫn xử trí tiêu chảy trẻ em, Ban hành kèm theo định số 4121/QĐ-BYT ngày 28/10/2009, Hà Nội Bộ Y tế (2013), Vi sinh vật y học, NXB Y học, tr 172-174 Hồng Thị Bích Ngọc (2017), Xác định phân bố số đặc điểm sinh học phân tử nhóm Escherichia coli gây tiêu chảy trẻ em tuổi địa bàn Hà Nội, Luận án tiến sỹ Y học, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Hà Nội Nguyễn Thanh Thảo, Lê Thị Tài, Nguyễn Văn Hiến, Lê Thị Hoàn, Nguyễn Hồng Long, Lê Thị Thanh Xn (2014), “Tình hình bệnh tiêu chảy Việt Nam giai đoạn 2002 – 2011”, Tạp chí Y học dự phòng, 24(7), tr 156 Nguyễn Vũ Trung, Lê Huy Chính, Lê Văn Phủng, Andrej Weintraub (2003), “Phát triển ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi chẩn đoán E coli gây tiêu chảy từ phân” Tạp chí Nghiên cứu Y học tr 7-14 Nguyễn Yến Bình (2003), Nghiên cứu số vi sinh vật gây tiêu chảy cấp trẻ từ tháng đến tuổi bệnh viên Xanh Pôn- Hà nội tính kháng thuốc chúng, Luận văn Bác sỹ chuyên khoa 2, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội Phùng Đắc Cam (2009), Bệnh tiêu chảy, Nxb Y học, tr 110-122 Trần Thị Thanh Huyền (2010), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP (Loop mediated isothermal amplification) để xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Hà Nội 58 TIẾNG ANH Bii C.C, Taguchi H., Ouko T.T, Muita W., Wamae N., Kamiya S (2005), “Detection of virulencerelated genes by Multiplex PCR in multidrugresistant diarrhoeagenic Escherichia coli isolates from Kenya and Japan”, Epidemiol Infect, 133(4), pp.627-633 10 Bista BR, Ishwad C, Wadowsky RM, Manna P, Randhawa PS, Gupta G, Adhikari M, Tyagi R, Gasper G, Vats A (2007), “Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of BK Virus”, J Clin Microbiol, 45 (5), pp.1581-1587 11 Bui T.H, Flemming S., Phung D.C, Oralak S., Tran T.H, Tran M.T, Anders D (2008), “Diarrheagenic Escherichia coli and Shigella Strains Isolated from Children in a Hospital Case-Control Study in Hanoi, Vietnam”, Journal of Clinical Microbiology, 46(3), pp.996-1004 12 Teh C S J, Chua K H, Lim Y, Lee S C, Thong K L(2014), “Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Detection of Generic and Verocytotoxin-Producing Escherichia coli among Indigenous Individuals in Malaysia”, The Scientific World Journal ,pp.6 13 D J Evans, Jr , D G Evans (1977), “Direct serological assay for the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli, using passive immune hemolysis”, Inun Immun, 16 (2), pp.604-609 14 Rasko DA1, Webster DR, Sahl JW, Bashir A, Boisen N, Scheutz F, Paxinos EE, Sebra R, Chin CS, Iliopoulos D, Klammer A, Peluso P, Lee L, Kislyuk AO, Bullard J, Kasarskis A, Wang S, Eid J, Rank D, Redman JC, Steyert SR, Frimodt-Moller J, Struve C, Petersen AM, Krogfelt KA, Nataro JP, Schadt EE, Waldor MK, (2011), “Origins of the E coli Strain Causing an Outbreak of Hemolytic–Uremic Syndrome in Germany”, N Engl J Med, 365, pp.709-71 15 Davidson G, Barnes G, Bass D, Cohen M , Fasano A, Fontaine O , Guandalini S (2002), “Infectious diarrhea in children: working group report of the First 59 World Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition” J Pediatr Gastroenterol Nutr, 35(2), pp.143-150 16 Engku Nur Syafirah EAR, Nurul Najian AB, Foo PC, Mohd Ali MR, Mohamed M, Yean CY(2018), “An ambient temperature stable and ready-to-use loop-mediated isothermal amplification assay for detection of toxigenic Vibrio cholerae in outbreak settings” Acta Trop;182:223-231 17 Fei Wang, Qianru Yang, Yinzhi Qu, Jianghong Meng, Beilei Ge(2014), “Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Suite for the Rapid, Reliable, and Robust Detection of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Produce”, Appl Environ Microbiol, 80(8), pp.2516-2525 18 Fratamico P.M., Bagi L.K (2012), “Detection of Shiga toxin- producing Escherichia coli in ground beef using the GeneDisc real-time PCR system”, Front Cell Infect Microbio,l 2,pp 152 19 Gomes T A T, Rassi V, Macdonald K L, Ramos S R T S, Trabulsi L R, Vieira M A M, Guth B E C, Candeias J A N, Ivey C, Toledo M R F, Blake P A(1991), “Enteropathogens associated with acute diarrheal disease in urban infants in Sao Paulo, Brazil” J Infect Dis, 164, pp.331-337 20 Goto M, Honda E, Ogura A, Nomoto A, Hanaki K (2009), “Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue”, Biotechniques, 46(3), pp.167-72 21 Hsu YH , Chou SJ , Chang CC , Pan MJ , Yang WC , Lin CF , Chan KW , (2017), “Development and validation of a new loop-mediated isothermal amplification for detection of pathogenic Leptospira species in clinical materials” J Microbiol Methods.,141, pp.55-59 22 Jams PN, Jams BK(1998), “Diarrheagenic Escherichia coli”, Cnilical Microbioly Review; 11(1), pp.142-210 23 Jenkins C., Lawson A J., Cheasty T., Willshaw G A (2012), ”Assessment of a real-time PCR for the detection and characterization verocytotoxigenic Escherichia coli” J Med Microbiol 61, pp.1082–1085 60 of 24 Li JJ, Xiong C, Liu Y, Liang JS, Zhou XW (2016), “Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): Emergence As an Alternative Technology for Herbal Medicine Identification”, Front Plant Sci, 7, pp.1956 25 Joshua Hill, Shilpa Beriwal, Ishwad Chandra, Vinod K Paul,Aarti Kapil, Tripti Singh, Robert M Wadowsky, Vinita Singh, Ankur Goyal, Timo Jahnukainen, James R Johnson, Phillip I Tarr, Abhay Vats (2008), “LoopMediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli”, J Clin Microbiol 46(8), pp 2800-2804 26 Karlsen F., Steen H.B., and Nesland J.M (1995), “SYBR green I DNA staining increases the detection sensitivity of viruses by polymerase chain reaction”, J Virol Methods, 55 (1), pp.153-156 27 Kim A Piera, Ammar Aziz, Timothy William, David Bell, Iveth J González, Bridget E Barber, Nicholas M Anstey, Matthew J Grigg (2017), “Detection of Plasmodium knowlesi, Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax using loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in a co-endemic area in Malaysia” Malaria Journal, pp.16-29 28 Konaté A, Dembélé R, Kagambèga A, Soulama I, Kaboré WAD, Sampo E, Cissé H, Sanou A, Serme S, Zongo S, Zongo C, Fody AM, Guessennd NK , Traoré AS, Gassama-Sow A, Barro N, (2017), “Molecular Characterization of Diarrheagenic Escherichia Coli in Children Less Than Years of Age with Diarrhea in Ouagadougou, Burkina Faso” Eur J Microbiol Immunol, 7(3), pp.220-228 29 Kuboki N., Inoue N., Sakurai T., Di Cello F., Grab D.J., Suzuki, and H S., C., Igarashi I, (2003), “Loop-mediated isothermal amplification for detection of African trypanosomes”, J Clin.Microbiology, 41, pp 5517-5524 30 Karthik K , Rathore R , Thomas P , Arun TR , Viswas KN , Agarwal RK , Manjunathachar HV , Dhama K,(2016), “Rapid and visual loop mediated isothermal amplification (LAMP) test for the detection of Brucella spp and its applicability in epidemiology brucellosis”, Veterinarski Arhiv ; 86 (1), pp.35-47 61 of bovine 31 Levine M.M, Ristaino P, Marley G, Smyth C, Knutton S, Boedeker E, Black R, Young C, Clements M.L, Cheney C, Patnaik R (1984), “E coli surface antigens and of colonization factor antigen II positive enterotoxigenic Escherichia coli: morphology, purification, and immuneresponses inhumans, Infect” Immun, 44, pp.409-420 32 Lin J, Ma B, Fang J, Wang Y, He H, Lin W, Su W, Zhang M (2017) “Colorimetric Detection of 23 Human Papillomavirus Genotypes by LoopMediated Isothermal Amplification” Clinical Laboratory , 63(3):495-505 33 Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T, “Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation”, Biochem Biophys Res Commun 289(1), pp.150 34 Mori Y., Hirano T., and Notomi T (2006), “Sequence specific visual detection of LAMP reactions by addition of cationic polymers”, BMC Biotechnol, 6, pp 35 Nagamine K.W., K Ohtsuka, K Hase, T Notomi, T (2001), “Loopmediated isothermal amplification reaction using a nondenaturated template”, Clinical Chemistry, 46, pp.1742-1743 36 Niessen L and Zudi F.V (2010), “Detection of Fusarium graminearum DNA using a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay”, International Journal of Food Microbiology, 140, pp 183–191 37 Notomi T, Mori Y, Tomita N, Kanda H (2015), “Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects”, Journal of Microbiology , 53(1), pp.1-5 38 Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T(2000), “Loop-mediated isothermal amplification of DNA”, Axit nucleic Res, 28 (12), pp.63 39 Oswald E, Schmidt H., Morabito S, Karch H, Marches O, Caprioli A(2000), “Typing of intimin genes in human and animal enterohemorrhagic and enteropathogenic Escherichia coli: characterization of a new intimin variant, Infect”, Immun, 68, pp.64-71 62 40 Poon LL, Wong BW, Ma EH, Chan KH, Chow LM, Abeyewickreme W, Tangpukdee N, Yuen KY, Guan Y, Looareesuwan S, Peiris JS (2006), “Sensitive and inexpensive molecular test for falciparum malaria: detecting Plasmodium falciparum DNA directly from heat-treated blood by loopmediated isothermal amplification”, Clin Chem., 52 (2), pp 303-6 41 Qiao Y.M., Guo Y.C., et al (2007), “Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis spores”, Biotechnol Lett, 29 (12), pp.1939-1946 42 R H Yolken, H B Greenberg, M H Merson, R B Sack, A Z Kapikian (1977), “Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Escherichia coli heat-labile enterotoxin” J Clin Microbiol 6(5), pp.439–444 43 Ravan H, Amandadi M, Sanadgol N (2016), “A highly specific and sensitive loop-mediated isothermal amplification method for the detection of Escherichia coli O157:H7”, Microb Pathog., 161, pp.161-5 44 Reid S D, Betting D J, Whittam T S (1999), “Molecular detection and identification of intimin alleles in pathogenic Escherichia coli by multiplex PCR”, J Clin Microbiol, 37, pp.2719-2722 45 Sambrook J and Russell D.W (2001), Sambrook J Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork 46 Savan R., Kono T., Itami T., and Sakai M (2005), “Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens”, J Fish Dis, 28 (10), pp 573-581 47 Schmidt H, Knop C, Franke S, Aleksic S, Heesemann J, Karch H (1995), “Development of PCR for screening of enteroaggregative Escherichia coli”, J Clin Microbiol, 33, pp.701-705 48 Sehand KA, Layla IFS (2010), “Identification of Different Categories of Diarrheagenic Escherichia coli in Stool Samples by Using Multiplex PCR Technique” Asian Journal of Medical Sciences, 2(5), pp 237-243 63 49 Smith JE, Fratamico PM (2005), “Diarrhea-inducing Escherichia coli In Foodborne pathogens: microbiology and molecular biology”, Caister Academic Press, Norfolk, UK, pp 357-382 50 Svenungsson B., Lagergren A., Ekwall E., Evengard B., Hedlund K.O., Karnell A., Lofdahl S., Svensson L., Weintraub A (2000), “Enteropathogens in adult patients with diarrhea and healthy control subjects: a 1-year pro-spective study in a Swedish clinic for infectious diseases”, Clin Infect Dis, 30, pp.770-778 51 Tamanai-Shacoori Z., Jolivet-Gougeon A (1994), “Detection of enterotoxigenic Escherichia coli in water by polymerase chain reaction amplification and hybridization”, Can J Microbiol, 40, pp.243-249 52 Tania A.T Gomes, Waldir P Elias, Isabel C.A Scaletsky, Beatriz E.C Guth, Juliana F Rodrigues, Roxane M.F Piazza, Luís C.S Ferreira, Marina B Martinez (2016), “Diarrheagenic Escherichia coli”, Braz J Microbiol., 47(1), pp 3-30 53 Tobias B., Matthias P., Andreas M., Hans-Gunther H., Florian G.(2001), “Rapid Detection of Enterohemorrhagic Escherichia coli by Real-Time PCR with Fluorescent Hybridization Probes”, J Clin Microbiol, 39 (1), pp.370- 374 54 Tomita N., Mori Y., Kanda H., and Notomi T (2008), “Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products”, Nat Protoc, (5), pp 877-882 55 UNICEF (2018), Diarrhoea remains a leading killer of young children, despite the availability of a simple treatment solution, UNICEF, US, 2018 56 Verma S, Singh R, Sharma V, Bumb RA, Negi NS, Ramesh V, Salotra P (2017), “Development of a rapid loop-mediated isothermal amplification assay for diagnosis and assessment of cure of Leishmania infection”, BMC Infect Dis.,17(1), pp.223 57 Xue-han Z, Qing Y, Ya-dong L, Bin L, Renata I, Kong-wang H (2013), “Development of a LAMP assay for rapid detection of different intimin 64 variants of attaching and effacing microbial pathogens”, J Med Microbiol., 62(11), pp.1665-72 58 Yu J., Kaper J B (1992) “Cloning and characterization of the eae gene of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7” Mol Microbiol, 6, pp.411- 417 59 Zablon Kithinji Njiru , Philippe Büscher, Editor (2012), “Loop-Mediated Isothermal Amplification Technology: Towards Point of Care Diagnostics”, PLoS Negl Trop Dis., 6(6), pp 1572 60 Zhang H., Thekisoe O.M., et al (2009), “Toxoplasma gondii: sensitive and rapid detection of infection by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method”, Exp Parasitol, 122 (1), pp 47-50 61 Zhao X, Chen X, Zhang Y, He X, Li W, Shi L, Chen X, Xu Z, Zhong N, Ji G, Yang L, Wang J (2012), “Development and evaluation of reversetranscription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of human immunodeficiency virus type 1”, Indian J Med Microbiol.,30(4), pp.391-6 62 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 63 http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/diarrhoeal-disease 64 http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en/ 65 PHỤ LỤC Phụ lục Trình tự rDNA 16S chủng ghiên cứu Trình tự rDNA 16S chủng E1 GGTCTGGCGGCGGCTAACCATGGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAAGCT TGCTTCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTG CCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACG TCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCC CAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATC CCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTC CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAG CCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGT ACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACG TTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT ACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAG GCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGC ATCTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGG Trình tự rDNA 16S chủng E2 ASSGGSMRGGSCCTWAACMMMATGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAA GCTTGCTTCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGASYAATGTCTGGGA AACTCCTGATGGAGRGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATA ACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATGTG CCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGAT CCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTC CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGC CTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAMSGCCTTCGGGTTGTAAAGTACT TTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGYTAATACCTTTGCTCATTGACGTTAC CCGCAKAATAAKCMCCGGCTAACTCCGTGCCWSCAGCCGCGGTAATACKG ASGGTGCAAGCGTTA Trình tự rDNA 16S chủng E4 GGGCGGGGGCAGGCTAACACATGGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAAGC TTGCTTCTTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACT GCCTGATGGAGAGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAAC GTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGC CCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGAT CCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGT CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAA GCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAG TACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGAC GTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAA TACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCA GGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTG CATCTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTCCAATTCCAGG TGTAGCGGTGAATTGCGTATAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCG NCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGG Phụ lục Hình thái khuẩn lạc 25 chủng vi khuẩn nghiên cứu Phụ lục Kết nhuộm Gram 25 chủng vi khuẩn nghiên cứu ... Escherichia coli gây tiêu chảy người kỹ thuật phân tử Với mục tiêu sau: Phát nhanh vi khuẩn E coli mang gen eae gây tiêu chảy người kĩ thuật LAMP Xây dựng sơ đồ phát vi khuẩn E coli mang gen eae gây tiêu. .. dàng áp dụng rộng rãi tuyến y tế sở nhằm góp phần nâng cao hiệu phòng chống, kiểm soát điều trị vi khuẩn E coli gây tiêu chảy người tiến hành đề tài: Sử dụng thị màu phát nhanh vi khuẩn Escherichia. .. chủng E coli phân loại dựa vào trình tự gen mã hóa rDNA 16S số chủng E coli - Sử dụng kĩ thuật PCR để phát gen độc lực eae vi khuẩn E coli gây tiêu chảy người - Sử dụng kĩ thuật LAMP để phát gen