Dựa trên sự khác biệt trong cấu trúc genome của từng nhóm, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã ứng dụng thành công kĩ thuật PCR với hai cặp mồi đặc hiệu để phát hiện 2 trong số 5 nhóm khác nhau của E.coli gây tiêu chảy từ các chủng chuẩn EPEC và EIEC.
Nguyễn Phú Hùng cs Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ 65(03): 155 - 158 PHÁT HIỆN HAI NHĨM ESCHERICHIA COLI EPEC VÀ EIEC GÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT PCR Nguyễn Phú Hùng1*, Phạm Thị Nhàn1 Lê Thị Thu Hà1, Lê Thành Công1 Phùng Đắc Cam2 Trường Đại học Khoa Học – ĐH Thái Nguyên Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương) TÓM TẮT Escherichia coli tác nhân gây bệnh tiêu chảy hầu hết quốc gia giới Đây đối tƣợng gây viêm ruột theo nhiều chế khác Dựa sở này, E.coli gây tiêu chảy đƣợc phân thành nhóm khác ETEC, EHEC, EIEC, EPEC, EAEC, nhóm có chế sinh bệnh đặc trƣng Dựa khác biệt cấu trúc genome nhóm, nghiên cứu này, ứng dụng thành công kĩ thuật PCR với hai cặp mồi đặc hiệu để phát số nhóm khác E.coli gây tiêu chảy từ chủng chuẩn EPEC EIEC Đây tiền đề quan trọng để tiến hành tối ƣu hoá phát triển thành sinh phẩm phát nhanh tác nhân gây tiêu chảy E.coli ngƣời Ƣu điểm kỹ thuật cho phép phát tác nhân gây bệnh với độ đặc hiệu gần nhƣ 100% Từ khóa: Tương đồng di truyền, tiêu chảy, PCR, nhiễm trùng bệnh viện, Ecoli ĐẶT VẤN ĐỀ Tiêu chảy bệnh phổ biến toàn cầu, đặc biệt phát triển Việt Nam nƣớc nằm vùng nhiệt đới, điều kiện vệ sinh kém, bệnh tiêu chảy phổ biến Theo nghiên cứu đây, bệnh tiêu chảy nƣớc ta đứng thứ 10 bệnh phổ biến đứng hang thứ tƣ 10 bệnh có tỉ lệ tử vong cao Trẻ em đối tƣợng dễ mắc tiêu chảy nhất, trung bình trẻ dƣới tuổi năm mắc tiêu chảy – 2,2 lần [2], [3] Có nhiều tác nhân sinh học khác dẫn tới tiêu chảy ngƣời nhƣ: tác nhân virus (ví dụ: virus rota, virus adeno, virus Norwalk…), kí sinh trùng (ví dụ: giun tròn, sán dây, sán lá, loại đơn bào (protozoa) vi khuẩn (Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholera…) Để kiểm sốt dịch tiêu chảy, cơng tác chẩn đoán, xác định tác nhân gây bệnh giữ vai trò đặc biệt quan trọng Trong số tác nhân kể trên, E.coli đối tƣợng đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều Các E.coli gây tiêu chảy đƣợc chia làm nhóm là: E.coli gây bệnh đƣờng ruột(Enteropathology E.coli * * – EPEC); E.coli sinh độc tố ruột (Enterotoxigenic E.coli – ETEC); E.coli xâm nhập ruột (Enteroinvasive E.coli – EIEC), E.coli gây xuất huyết ruột (Enterohaemorrhagic E.coli – EHEC) E.coli bám dính đƣờng ruột (Enteroaggregative E.coli – EAEC) Hiện có nhiều cơng trình nghiên cứu chẩn đốn phân biệt nhóm E.coli gây bệnh khác đƣợc thực hiện[1], [4],[5], [10] Trong báo này, tiến hành áp dụng kĩ thuật PCR đặc hiệu để xác định xác hai nhóm E.coli EPEC EIEC nhóm nêu Đây phần nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định nhóm E.coli gây tiêu chảy ngƣời NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu nghiên cứu chủng E.coli chuẩn quốc tế Giáo sƣ Phùng Đắc Cam, Phòng Vi khuẩn đƣờng ruột - Viện vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng cung cấp Hóa chất dùng cho tách chiết DNA tổng số loại hóa chất chuyên dụng dùng cho kỹ thuật sinh học phân tử có chất lƣợng tốt, hãng có uy tín cung cấp Tel 0914791904, Email: hungnguyenphu@gmail.com 155 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Nguyễn Phú Hùng cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ Phương pháp nghiên cứu bao gồm phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số từ chủng vi khuẩn làm nguyên liệu cung cấp cho phản ứng PCR Phƣơng pháp khuếch đại gen đích phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết tách DNA tổng vi khuẩn E.coli Từ chủng E.coli chuẩn quốc tế: EPEC, EIEC chủng đối chứng EC đƣợc giữ ống thạch nghiêng, lấy vài khuẩn lạc đem nuôi cấy môi trƣờng LB lỏng nhiệt độ 370C qua đêm Dịch nuôi cấy đƣợc li tâm, thu sinh khối để tiến hành tách chiết tinh DNA tổng số E.coli vi khuẩn gram âm, nghiên cứu tiến hành tách chiết theo phƣơng pháp Sambrock cộng DNA thu đƣợc trình tách chiết đƣợc kiểm tra phƣơng pháp điện di phƣơng pháp đo mật độ quang máy quang phổ Kết điện di DNA tổng số đƣợc trình bày hình 2.1 Từ kết điện di cho thấy, phân tử DNA thu đƣợc bị đứt gãy, có băng gọn Các băng xuất với độ đậm nhuộm ethidium bromide chứng tỏ phƣơng pháp tách chiết cho phép thu đƣợc lƣợng DNA lớn Tiếp theo tiến hành xác định nồng độ DNA phƣơng pháp quang phổ làm sở để pha loãng DNA đến nồng độ cuối cho phản ứng PCR đặc hiệu Kết điện di DNA tổng số đƣợc trình bày hình Hìnhquả DNA tổng số củagen đối tƣợng nghiênnhóm cứu: Kết khuếch đại đặc hiệu EPEC Chủng EPEC; Chủng EIEC Cơ chế gây bệnh nhóm liên quan mật thiết tới khả bám dính, khu trú, truyền tín hiệu vào tế bào làm thoái hoá vi nhung mao, làm rối loạn trình hấp thu 65(03): 155 - 158 nƣớc điện giải Sự truyền tín hiệu vào tế bào protein mã hoá gen eae, esp B, espA, esp D, sep, esp nằm nhiễm sắc thể quy định Trong protein đƣợc gọi intimin có trọng lƣợng phân tử 97 kDa mã hố gen eae liên quan tới chế gắn mật thiết đóng vai trò chủ yếu chế gây bệnh nhóm Trên sở đó, chúng tơi thiết kế cặp mồi đặc hiệu gen eae có kí hiệu trình tự là: eae F: CACACGAATAAACTGACTAAAATG eae R: AAAAACGCTGACCCGCACCTAAAT Theo lý thuyết thiết kế, cặp mồi cho phép khuếch đại phân đoạn gen eae có kích thƣớc 376 cặp nucleotide Nhiệt độ bắt cặp mồi 520C Sản phẩm phản ứng PCR đƣợc phát phƣơng pháp điện di gel agarose 1% M 603 360 310 Hình Sản phẩm khuếch đại gen eae M Macker cắt2, Từ kết điện X di174 hình cănHind III vào kích Đối chứng EC,cho EPEC thƣớc 1.macker chuẩn thấy phân đoạn DNA đƣợc khuếch đại cặp mồi eae F eae R có kích thƣớc khoảng 370 cặp nucleotide Kích thƣớc phù hợp với tính tốn lý thuyết q trình thiết kế mồi Sản phẩm đƣợc nhân lên có tính đặc hiệu cao, khơng có sản phẩm phụ Mặt khác đƣờng chạy số 1, chủng EC đƣợc sử dụng làm đối chứng âm cho kết âm tính Nhƣ vậy, khẳng định khuếch đại thành công gen eae đặc hiệu cho nhóm EPEC Kết chúng tơi hồn tồn phù hợp với nghiên cứu trƣớc [5], [7] Kết khuếch đại gen đặc hiệu nhóm EIEC 156 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Nguyễn Phú Hùng cs Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ 65(03): 155 - 158 EIEC gây bệnh cách xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng Các gen mã hố protein liên quan đến q trình xâm nhập nằm plasmid nhiễm sắc thể Plasmid nhóm đƣợc ký hiệu pInv có trọng lƣợng phân tử 140 mDa chứa gen mxi ipa mã hoá cho protein cần thiết cho trình xâm nhập gồm IpaA, IpaB, IpaC, IpaD, IpaH Trong nghiên cứu thiết kế cặp mồi đặc cho nhóm EIEC dựa đặc hiệu nhóm IpaH Trình tự cặp mồi là: cộng sự, thu đƣợc DNA tổng số từ đối tƣợng nghiên cứu với độ tinh cao, không đứt gãy, phục vụ tốt cho trình PCR Kết PCR nhân lên đƣợc hai băng với kích thƣớc khoảng 360 cặp nucleotide đặc hiệu cho gen eae nhóm EPEC phân đoạn thứ hai có kích thƣớc khoảng 620 cặp nucleotide đặc hiệu cho gen ipH nhóm EPEC Kết tiền đề quan trọng để tiến hành nghiên cứu, tạo sinh phẩm chẩn đoán E.coli gây tiêu chảy nghiên cứu IpaH F: GTT CCT TGA CCG CCT TTC CGA TAC CGT C IpaH R: GCC GGT CAG CCA CCC TCT GAG AGT AC TÀI LIỆU THAM KHẢO M 873 603 620 Hình Sản phẩm khuếch đại gen ipaH M Macker X 174 cắt Hind III Đối chứng EC EPEC Phân tích hình ảnh điện di sản sản phẩm PCR (hình 3) cho thấy, mẫu đối chứng âm (EC) sản phẩm đƣợc khuếch đại với cặp mồi ipHF ipHR mà thiết kế đặc hiệu cho nhóm EIEC Tuy nhiên, đƣờng chạy số mẫu chuẩn EIEC, nhận đƣợc kết dƣơng tính, có băng DNA với kích thƣớc khoảng 620 cặp nucleotit, tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết thiết mồi Có thể khẳng định kết chúng tơi thu đƣợc hồn tồn phù hợp với nhiều công bố tác giả khác giới [4], [8], [9] KẾT LUẬN Bằng phƣơng pháp tách DNA tổng số đối tƣợng vi khuẩn gram âm Sambrock [1].Adrienne W Paton and James C Paton (1998), “Detection and Characterization of Shiga Toxigenic Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stx1, stx2, eaeA, Enterohemorrhagic E coli hlyA, rfbO111, and rfbO157”, J Clin Microbiol, Vol 36, Pp: 598-602 [2].Phùng Đắc Cam (2009), Bệnh tiêu chảy, Nxb Y học [3].Hoàng Thủy Long (2007), Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật y học, Nxb Văn hoá [4].Jaims P Natoro, Jaims B Kaper (1998), “Diarrheagenic Escherichia coli” Cnilical Microbiology Review, Vol 11, No Pp 142–201 [5].Hornitzky MA, Bettelheim KA, Djordjevic SP (2001), “The detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli in diagnostic bovine faecal samples using vancomycin-cefixime-cefsulodin blood agar and PCR”, FEMS Microbiol Lett, Vol 198, No 1, Pp 17 – 22 [6].Seker E, Kuyucuoğlu Y, Sareyyüpoğlu B, Yardımcı H (2009), “PCR Detection of Shiga Toxins, Enterohaemolysin and Intimin Virulence Genes of Escherichia coli O157:H7 Strains Isolated from Faeces of Anatolian Water Buffaloes in Turkey”, Zoonoses Public Health [7] Ooka T, Terajima J, Kusumoto M, Iguchi A, Kurokawa K, Ogura Y, Asadulghani M, Nakayama K, Murase K, Ohnishi M, Iyoda S, Watanabe H, Hayashi T (2009), “Development of a multiplex PCR-based rapid typing method for enterohemorrhagic Escherichia coli O157 strains”, J Clin Microbiol, Vol 47, No.9, Pp, 2888-2894 157 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Nguyễn Phú Hùng cs Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ [8] S Stacy-Phipps, JJ Mecca and JB Weiss (1995), “Multiplex PCR assay and simple preparation method for stool specimens detect enterotoxigenic Escherichia coli DNA during course of infection” J Clin Microbiol, Vol 33, No 5, 1054-1059 [9] Pina M Fratamico, Connie E Briggs, Danielle Needle, Chin-Yi Chen, and Chitrita DebRoy (2003), “Sequence of the Escherichia coli O121 O-Antigen Gene Cluster and Detection of 65(03): 155 - 158 Enterohemorrhagic E coli O121 by PCR Amplification of the wzx and wzy Genes” J Clin Microbiol, Vol 41, Pp: 3379-3383 [10] Sensitivities and Specificities of Premier (1998), “E coli O157 and Premier EHEC Enzyme Immunoassays for Diagnosis of Infection with Verotoxin (Shiga-Like Toxin)-Producing Escherichia coli”, J Clin Microbiol Vol 36, Pp: 1608-1611 DETECTION OF TWO GROUP OF DIARRHEAGENIC ESCHERICHIA COLI IN HUMAN EPEC AND EIEC BY PCR TECHNIQUE Nguyen Phu Hung12, Pham Thi Nhan1, Le Thi Thu Ha1, Le Thanh Cong1 College of Science – Thai Nguyen University Phung Dac Cam2 National Institute of hygiene and epidemiology2 SUMMARY Escherichia coli is an underestimated diarrheal pathogen in almost countries in the wold This organism may cause gastroenteritis by many different mechanisms, and on the basis of this, diarrheagenic E coli has been subdivided into different groups are ETEC, EHEC, EIEC, EPEC, EAEC Each of groups has a special pathogenic mechanisms On the basis of genomic structure of these every strains, in this this study, has been applied successfully PCR technique with two pairs of primers to detect of different types of diarrheogenic Escherichia coli are EPEC and EIEC from standar samples This is important prime to deverloping diagnosistic technique for diarrheagenic E coli The advantages of this technique are that it allows to screen and diagnose these pathogens with its sensitivity and specificity nearly 100% Key words:E.coli, PCR, diarohea hopitol Infections, Genetic Similarity Tel 0914791904, Email: hungnguyenphu@gmail.com 158 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ... eae nhóm EPEC phân đoạn thứ hai có kích thƣớc khoảng 620 cặp nucleotide đặc hiệu cho gen ipH nhóm EPEC Kết tiền đề quan trọng để tiến hành nghiên cứu, tạo sinh phẩm chẩn đoán E .coli gây tiêu chảy. .. cấp cho phản ứng PCR Phƣơng pháp khuếch đại gen đích phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết tách DNA tổng vi khuẩn E .coli Từ chủng E .coli chuẩn quốc tế: EPEC, EIEC chủng đối... cho nhóm EIEC dựa đặc hiệu nhóm IpaH Trình tự cặp mồi là: cộng sự, thu đƣợc DNA tổng số từ đối tƣợng nghiên cứu với độ tinh cao, không đứt gãy, phục vụ tốt cho trình PCR Kết PCR nhân lên đƣợc hai