ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG VIỆC PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA E.COLI GÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG VIỆC PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA E.COLI GÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

BỘ MÔN KHOA HỌC SỰ SỐNG

- -PHẠM THỊ NHÀN

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG VIỆC

PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA E.COLI

GÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

Người hướng dẫn khoa học: ThS Nguyễn Phú Hùng

THÁI NGUYÊN - 2010

NỘI DUNG BÁO CÁO

1 Mở đầu

2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

3 Kết quả và thảo luận

4 Kết luận và kiến nghị

1 MỞ ĐẦU

Tiêu chảy là một vấn đề sức khỏe toàn cầu Một trong những nguyên nhân phổ biến gây tiêu chảy ở trẻ em là do vi khuẩn E.coli.

và độ đặc hiệu cao sẽ có ý nghĩa rất quan trọng trong việc lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân

chảy Trong đó, PCR là phương pháp được sử dụng hữu hiệu nhất.

“ Ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện các gen độc lực của

E.coli gây tiêu chảy ở người”.

 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu

nhằm phát hiện các gen độc lực của 5 nhóm E.coli

gây bệnh tiêu chảy ở người, làm tiền đề cho việc tạo

bộ sinh phẩm chẩn đoán các nhóm E.coli gây tiêu

chảy.

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Các chủng E.coli chuẩn Quốc tế do Phòng Vi khuẩn đường ruột - Viện

Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, gồm có: EPEC, EHEC1, EHEC2, EIEC, ETEC, EAEC và EC (chủng đối chứng không có gen độc lực).

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose

Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose

Hình 2.1 Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu

Các

chủng

E.coli

chuẩn

Quốc tế

Các

chủng

E.coli

chuẩn

Quốc tế

Nuôi cấy qua đêm trên môi trường MPA đặc, thu khuẩn lạc

Nuôi cấy qua đêm trên môi trường MPA đặc, thu khuẩn lạc

Tách DNA trực tiếp

từ khuẩn lạc

Tách DNA trực tiếp

từ khuẩn lạc

Khuếch đại gen bằng phản ứng PCR

Khuếch đại gen

bằng phản ứng PCR

Bảng 2.1 Các trình tự mồi được sử dụng trong các phản ứng PCR

Gen

độc lực Cặp mồi (primer) Trình tự primer (5’ → 3’)

Kích thước sản phẩm PCR (bp)

vt2 VT2 - FVT2 - R ACCGTTTTTCAGATTTTGCACATATACACAGGAGCAGTTTCAGACAGT 298

elt LT - FLT - R TCTCTATGTGCATACGGAGCCCATACTGATTGCCGCAAT 322

eae eae - Feae - R CACACGAATAAACTGACTAAAATGAAAAACGCTGACCCGCACCTAAAT 376

IpaH IpaH - FIpaH - R GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCCGCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC 620

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ TÁCH DNA TRỰC TIẾP TỪ KHUẨN LẠC

DNA được tách chiết trực tiếp từ khuẩn lạc E.coli bằng phương pháp

của Cebula và cộng sự (1995) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm.

Ưu điểm: - Tổng thời gian tách DNA là 25 phút

- Không phải tiêu tốn nhiều hóa chất

- Lượng DNA thu được là rất nhỏ, nên nó được sử dụng trực tiếp (3 µl/1 phản ứng) mà không cần tiến hành pha loãng

Nhược điểm: DNA thu được không đủ để phát hiện bằng phương pháp điện di thông thường

3.2 KHUẾCH ĐẠI CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA CÁC NHÓM E.COLI

3.2.1 Gen độc lực eae

603 bp

270 bp

376 bp

872 bp

Hình 3.1 Kết quả khuếch đại gen eae

M Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 ETEC; 3 EHEC1; X 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 ETEC; 3 EHEC1;

4 EAEC; 5 EHEC2; 6 EIEC; 7 EC

3.2.2 Gen độc lực vt1

M 1 2 3 4 5 6 7

130 bp

Hình 3.2 Kết quả khuếch đại gen vt1

M Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 ETEC; 3 EHEC1; X 174 cắt bằng Hae III; 1 EHEC1; 2 EC; 3

EAEC;

4 EPEC; 5 EHEC2; 6 EIEC; 7 ETEC

3.2.3. Gen độc lực vt2

Hình 3.3 Kết quả khuếch đại gen vt2

M Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 ETEC; 3 EHEC1; X 174 cắt bằng Hae III; 1 EHEC1; 2 EHEC2; 3

EPEC;

4 ETEC; 5 EIEC; 6 EAEC; 7 EC

298 bp

M 1 2 3 4 5 6 7

3.2.4 Gen độc lực elt

Hình 3.4 Kết quả khuếch đại gen elt

M Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 ETEC; 3 EHEC1; X 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 EHEC1;

3 EHEC2; 4 ETEC; 5 EAEA; 6 EIEC; 7 EC

322 bp

M 1 2 3 4 5 6 7

3.2.5 Gen độc lực IpaH

Hình 3.5 Kết quả khuếch đại gen IpaH

M Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 ETEC; 3 EHEC1; X 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2

EIEC;

3 EHEC1; 4 EHEC2; 5 ETEC; 6 EAEC; 7 EC

620 bp

M 1 2 3 4 5 6 7

3.2.6 Gen độc lực EAST1

M Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 ETEC; 3 EHEC1; X 174 cắt bằng Hae III; 1 EPEC; 2 EHEC1;

3 EHEC2;4 EIEC; 5 ETEC, 6 EAEC; 7 EC

630 bp

M 1 2 3 4 5 6 7

Bảng 3.1 Kết quả khuếch đại các gen độc lực của 5 nhóm E.coli

EPEC EHEC1 EHEC2 EAEC EIEC ETEC EC

-Ghi chú: EHEC1 và EHEC2 là hai phân nhóm của nhóm EHEC

+ : Dương tính

- : Âm tính Tóm tắt kết quả khuếch đại các gen độc lực của 5 nhóm E.coli

4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

2 KIẾN NGHỊ

Tiếp tục phát triển nghiên cứu, tối ưu hoá các phản ứng PCR để có thể chẩn

đoán E.coli trực tiếp trên các mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy

1 KẾT LUẬN

Đã tách chiết được DNA tổng số của các nhóm vi khuẩn E.coli bằng phương

pháp tách DNA trực tiếp từ khuẩn lạc, tiết kiệm được nhiều thời gian và hoá chất nghiên cứu

Khuếch đại thành công các gen độc lực đặc trưng của 5 nhóm E.coli là: eae, vt1, vt2, IpaH, elt, EAST1

Kết quả nghiên cứu này là tiền đề cho nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi để

tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán tác nhân gây bệnh là E.coli.