PHÁT HIỆN 1 SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA E.COLI PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ PHÂN VÀ THỊT BÒ, HEO BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX

PHÁT HIỆN 1 SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA E.COLI PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ PHÂN VÀ THỊT BÒ, HEO BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX

Download» Agriviet.com 1 Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế nhất trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật. Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp, một số nhóm E. coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non (tiêu chảy trên bê nghé, tiêu chảy phân trắng ở heo con theo mẹ, tiêu chảy phù thủng trên heo cai sữa). E. coli được thải qua phân ra môi trường bên ngoài. Nếu qui trình vệ sinh kém thì E. coli dễ vấy nhiễm vào thòt tươi, đặc biệt là trong quá trình giết mổ. Từ đó nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm không thích hợp thì ngộ độc thực phẩm do E. coli hoàn toàn có thể xảy ra. Trong số các tác nhân gây tiêu chảy ở người thì E. coli luôn là tác nhân phổ biến nhất ở những nước công nghiệp phát triển lẫn những nước đang phát triển. Do đó E. coli được xem là vi khuẩn chỉ danh ô nhiễm thực phẩm và nước được đánh giá dựa trên số lượng của chúng. Dựa trên đặc điểm gây bệnh, E. coli được chia thành nhiều nhóm. Mỗi nhóm đều có những yếu tố độc lực khác nhau được qui đònh bởi những gen độc lực. Một số gen độc lực quan trọng của E. coli gồm: gen stx1, stx2, stx2e, hly của nhóm STEC (Shiga toxin-producing E. coli); gen eae của nhóm STEC và EPEC (Enteropathogenic E. coli); gen sta, stb, lt-I của nhóm ETEC (Enterotoxigenic E. coli )… E. coli là vi khuẩn bình thường ở đường ruột và cũng thường có mặt trong thực phẩm nên việc phân lập được vi khuẩn E. coli trong phân để tìm nguyên nhân gây bệnh hay xác đònh được số lượng vi khuẩn trong thực phẩm hoàn toàn không phản ánh được khả năng gây độc của chúng. Do vậy việc xác đònh các gen Download» Agriviet.com 2 độc lực của E. coli là một bước rất cần thiết phục vụ cho việc đánh giá nguy cơ gây bệnh trên vật nuôi và con người. Các kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật PCR thường được áp dụng để phát hiện các gen độc lực này. Cho đến nay, ở Việt Nam việc xác đònh E. coli là nguyên nhân gây bệnh thường chỉ thực hiện bằng kỹ thuật phân lập và xác đònh các đặc tính sinh hóa, và theo Tiêu chuẩn Việt Nam, đánh giá tình trạng vệ sinh thực phẩm hiện chỉ dừng lại ở mức độ xác đònh số lượng vi khuẩn, việc phát hiện những gen độc lực của vi khuẩn chưa được quan tâm. Hơn nữa việc ứng dụng kỹ thuật multiplex - PCR để phát hiện đồng thời các yếu tố độc lực của E. coli chưa được thực hiện ở Việt Nam. Với mục tiêu phát hiện một số gen độc lực mã hóa các protein gây độc của E. coli phân lập được từ phân và thòt bò, heo bằng kỹ thuật multiplex – PCR, được sự hướng dẫn của Thầy Nguyễn Ngọc Tuân, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phát hiện một số gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân và thòt bò, heo bằng kỹ thuật multiplex - PCR”. Bước đầu áp dụng kỹ thuật này, chúng tôi lần lượt thực hiện khảo sát trên các nhóm đối tượng mẫu phân tiêu chảy, phân bình thường, và thòt tươi. Đề tài hy vọng trở thành cơ sở để áp dụng kỹ thuật multiplex – PCR trong việc phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn E. coli trong chẩn đoán bệnh và đánh giá tình trạng vệ sinh thực phẩm. Yêu cầu: - E. coli được phân lập đònh lượng theo qui trình của FAO (1992) và phân lập đònh tính bằng môi trường chọn lọc MacConkey đối với mẫu phân hoặc bằng môi trường tăng sinh chọn lọc CT-SMAC (Sorbitol MacConkey với kháng sinh cefixime và tellurite potassium) đối với mẫu thòt. - Ly trích DNA từ vi khuẩn E. coli phân lập được; - Phát hiện một số gen độc lực (eae, hly, stx1, stx2, stx2e, sta, stb, lt-I) của E. coli phân lập được bằng kỹ thuật mutiplex - PCR. Download» Agriviet.com 3 Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 Vi khuẩn E. coli 2.1.1 Đònh nghóa Vi khuẩn Escherichia coli được phân lập và mô tả đầu tiên vào năm 1885 bởi nhà nghiên cứu người Đức Theodor Escherich. Theo hệ thống phân loại của Bergey, vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia. E. coli là trực khuẩn Gram âm, di động, kích thước khoảng 2 – 3 x 0,5 μm, không hình thành bào tử và có giáp mô. E. coli có mặt thường xuyên và chiếm ưu thế trong ruột của người và động vật máu nóng, ở phần cuối của ruột non và ở ruột già. 2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa E. coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp là 35 - 37 0 C, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu nhất là 7,2 – 7,4). Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ E. coli làm đục nhẹ môi trường, càng để lâu càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thể có váng mỏng trên mặt môi trường. E. coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc dạng S màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt bóng, kích thước khoảng 2 – 3 mm. Trên môi trường thạch EMB: E. coli cho khuẩn lạc tím ánh kim. Trên môi trường thạch MacConkey: E. coli cho khuẩn lạc đỏ hồng. Trên môi trường thạch nghiêng TSI: E. coli tạo acid / acid (vàng / vàng). Download» Agriviet.com 4 Để phân biệt E. coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng thử nghiệm IMVC. E. coli cho kết quả IMVC là + + − − (biotype 1) hoặc − + − − (biotype 2). 2.1.3 Yếu tố kháng nguyên E. coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp. Trước kia, kỹ thuật xác đònh kháng nguyên bề mặt là phương tiện chính để phân biệt các dòng E. coli gây bệnh. Năm 1947, Kauffmann đưa ra hệ thống phân nhóm serotype mà vẫn còn được sử dụng đến ngày nay. Hệ thống phân nhóm này dựa vào việc xác đònh kháng nguyên bề mặt O, H, K. * Kháng nguyên thân O (somatic antigen): có bản chất là lipopolysaccharide của màng ngoài tế bào, bền với nhiệt và cồn. Khi đun nóng ở 100 0 C trong 2 giờ vẫn giữ được tính kháng nguyên. Kháng nguyên O có thể được phát hiện bằng phản ứng ngưng kết. Kháng nguyên O giữ vai trò nhất đònh đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ. Kháng nguyên O tạo nền tảng cho việc phân loại serogroup của E. coli. Có hơn 170 serogroup kháng nguyên O. Trong mỗi serogroup có 1 hay nhiều serotype được phân loại dựa vào kháng nguyên lông H. * Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có bản chất là protein, tạo nên khả năng di động của E. coli, kém chòu nhiệt. Có khoảng 56 type kháng nguyên H. * Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): Kháng nguyên K lúc đầu được xác đònh bằng phản ứng ngưng kết. Người ta xác đònh có sự hiện diện của kháng nguyên K ở vi khuẩn nếu vi khuẩn chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh O khi bò đun nóng. Dựa vào khả năng chòu nhiệt người ta chia kháng nguyên K thành 3 type là A, L và B. Về sau người ta phân loại kháng nguyên K dựa vào thành phần hóa học của chúng và đã có hơn 80 type kháng nguyên K đã được xác đònh. Một vài E. coli, đặc biệt là E. coli tiết độc tố ruột có những lông bám kháng mannose (mannose resistant - MR) cũng được dùng để phân loại về mặt Download» Agriviet.com 5 huyết thanh học. Một vài lông bám kháng mannose này (ví dụ như K88 và K89) đã từng được coi là kháng nguyên K. Về sau, khi xác đònh được thành phần hóa học của những lông bám này có bản chất là protein nên việc xếp chúng vào kháng nguyên K không còn phù hợp, chúng được xếp vào nhóm kháng nguyên tiêm mao F. * Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial antigen): Tiêm mao (fimbriae) dài khoảng 4μm, đường kính 2,1 – 7,0 nm, dạng thẳng hay xoắn. Tiêm mao không tham gia vào sự di chuyển, ngắn hơn và nhiều hơn flagella. Tiêm mao giúp vi khuẩn kết dính vào tế bào niêm mao ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Hiện nay có hơn 700 type kháng nguyên hay serotype của E. coli từ sự tổ hợp của các nhóm kháng nguyên O, H, K, F. Tuy nhiên nói chung, chỉ những E. coli ngoài đường ruột mới không có capsul (Jann và Jann, 1992), do đó đối với những E. coli gây tiêu chảy, thường thì việc xác đònh serotype chỉ là sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên O và kháng nguyên H. 2.1.4 Phân loại E. coli Mặc dù E. coli là vi khuẩn cộng sinh vô hại trong đường ruột. Tuy nhiên trong một điều kiện thuận lợi, giống như hầu hết các tác nhân gây bệnh trên màng nhầy, E. coli có các yếu tố cần thiết để gây bệnh gồm (1) cư trú trên màng nhầy, (2) kháng được sự phòng vệ của vật chủ, (3) nhân lên, và (4) gây tổn hại vật chủ. Đặc tính quan trọng nhất của dòng E. coli gây tiêu chảy là khả năng cư trú trên màng nhầy ruột bất chấp nhu động ruột và sự cạnh tranh dinh dưỡng của hệ vi sinh vật bình thường ở ruột (gồm cả những dòng E. coli khác). Sự hiện diện của những lông bám là một đặc điểm của hầu hết các dòng E. coli, cả ở những dòng E. coli không gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998). Tuy nhiên những dòng E. coli gây tiêu chảy có những kháng nguyên lông đặc hiệu giúp E. coli có thể bám dính vào màng nhầy ruột non mặc dù đây không phải là vò trí cư trú bình thường Download» Agriviet.com 6 của E. coli (Levine và ctv, 1984). Một khi sự cư trú đã được thiết lập, việc gây bệnh của các dòng E. coli gây tiêu chảy rất đa dạng. Dựa trên đặc điểm gây bệnh (gồm các đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng nhầy ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dòch tễ của bệnh), E. coli được chia thành 5 nhóm chính: - STEC (Shiga toxin-producing E. coli) hoặc VTEC (Verotoxigenic E. coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli) - EPEC (Enteropathogenic E. coli ) - ETEC (Enterotoxigenic E. coli) - EAggEC hay EAEC (Enteroaggregative E. coli) - EIEC (Enteroinvasive E. coli) Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli: (1) Sản xuất độc tố (ETEC, EAEC, STEC) (2) Tấn công / xâm lấn (EIEC) (3) Bám dính, truyền tín hiệu qua màng (EPEC và EHEC) Tuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thể vật chủ và màng nhầy ruột thì đặc hiệu cho mỗi loại (Nataro và Kaper, 1998). 2.1.5 Shiga toxigenic E. coli (STEC) 2.1.5.1 Thuật ngữ: Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những thuật ngữ khác nhau để gọi tên cho nhóm E. coli này. Tên gọi Verotoxigenic E. coli (VTEC) được Konowalchuk và ctv (1977) đặt cho nhóm này khi phát hiện việc sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào Vero. Tên gọi Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) là do dòng này gây viêm kết tràng xuất huyết (HC) và hội chứng huyết niệu (HUS) (Nataro và Kaper, 1989). Và thuật ngữ Shiga toxin-producing E. coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga-like toxin- produccing E. coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sản sinh độc tố gây độc tế bào giống như độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1996). Download» Agriviet.com 7 STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau, và cả hai đều chỉ ra rằng nhóm E. coli sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào. Mặc dù vậy không phải chỉ cần có gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có các yếu tố độc lực khác. Những dòng E. coli mang gen sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe mạnh với một số lượng rất ít, nhưng những dòng này thiếu một vài hay tất cả những yếu tố độc lực khác của STEC (Beutin và ctv, 1994). Do đó không phải tất cả STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998). 2.1.5.2 Shiga toxin và những yếu tố độc lực liên quan đến đặc tính gây bệnh của STEC: STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt), còn gọi là Shiga toxin (Stx) hay Verotoxin (VT). Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2. Trong khi Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất thay đổi về trình tự, tạo ra nhiều subtype như Stx2c, Stx2hb, Stx2e (Calderwood và ctv, 1996), Stx2g (Leung và ctv, 2003). Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1, Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, và thậm chí nhiều dạng của Stx2. Cả hai độc tố Stx1 và Stx2 đều được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vò B 7,7 kDa và 1 tiểu đơn vò A 32 kDa. Tiểu đơn vò A gồm peptide A 1 28 kDa và peptide A 2 4 kDa nối với nhau bằng cầu nối disulfur. Peptide A 1 có hoạt tính enzyme và peptide A 2 có nhiệm vụ gắn kết tiểu đơn vò A vào những tiểu đơn vò B. Những tiểu đơn vò B giúp độc tố kết hợp với receptor đặc hiệu Gb 3 (globotriaosylceramide) hiện diện trên bề mặt của những tế bào eukaryote (Stx2e có receptor là Gb 4 ). Sau khi được chuyển vào bên trong tế bào, tiểu đơn vò A đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome. Peptide A 1 có hoạt tính enzyme hoạt động như một N-glycosidase cắt một gốc adenin khỏi rRNA 28S của ribosome, do đó gây trở ngại cho sự tổng hợp protein. Do không tổng hợp được protein, những tế bào bò Stx tác động (tế bào nội mô của thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào Hela hay bất cứ tế bào nào có receptor là Gb 3, receptor Gb 4 đối với Stx2e) sẽ chết. Hậu quả gây độc cho tế bào ruột do Stx và các yếu tố Download» Agriviet.com 8 độc lực khác của STEC là gây sự hư hại những tế bào nhung mao ruột, gây tiêu chảy và viêm kết tràng xuất huyết (Haemorrhagic colitis – HC). Sự hư hại những tế bào thành mạch máu do Stx2e sẽ gây nên hiện tượng phù thủng ở heo. Những tổn thương ở tế bào nội mô thận gây nên hội chứng huyết niệu (Haemolytic uraemic syndrome - HUS) ở người. Yếu tố bám dính của STEC/EHEC đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong sự đònh vò vi khuẩn ở ruột. Đó chính là intimin, một protein màng ngoài có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa. Intimin được mã hóa bởi gen eae (E. coli attaching and effacing). Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy (attaching-and-effacing, A/E) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv, 1993). Gen eae này cũng được tìm thấy ở nhóm EPEC. Gen eae gây kiểu tổn thương A/E là một trong số các gen nằm trên vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư hại tế bào ruột – locus of enterocyte effacement, LEE). Vùng LEE của STEC/EHEC chứa những gen mã hóa cho intimin, mã hóa receptor của intimin Tir (translocated intimin receptor) và một số gen khác. Vùng LEE không chỉ là điều kiện cần mà còn là điều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương A/E. Tuy nhiên không phải tất cả STEC đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có gen eae (Nataro và Kaper, 1998). Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác giữa protein màng ngoài của vi khuẩn (intimin) và protein Tir. Protein Tir được tiết ra khỏi vi khuẩn, chuyển vò vào màng của tế bào vật chủ (Paton và ctv, 1996). Yếu tố khác có liên quan đến độc lực của STEC là việc tạo ra enterohaemolysin (EHEC-Hly) và có thể cả độc tố ruột chòu nhiệt EAST1. EHEC-Hly được mã hóa bởi gen trên plasmid 60 MDa (pO157) mà plasmid này được tìm thấy ở gần như tất cả các dòng O157:H7 và cũng khá phổ biến cả những dòng STEC non-O157 nữa (Nataro và Kaper, 1998). Trên plasmid Download» Agriviet.com 9 này có sự hiện diện của một operon gồm 4 khung đọc mở (open reading frame - ORF) là hlyCABD. Trong đó hlyA là gen cấu trúc khởi đầu cho haemolysin. Độc tố ruột chòu nhiệt EAST1 (đầu tiên được mô tả ở nhóm EAEC là EAEC heat-stable enterotoxin 1), cũng được tìm thấy ở nhiều dòng STEC. Tầm quan trọng của EAST1 đối với khả năng gây bệnh của STEC vẫn chưa được biết, nhưng nó có ở một vài trường hợp tiêu chảy không có máu mà thường thấy ở những người nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998). Hầu hết các ổ dòch của STEC/EHEC là do O157:H7, nên người ta cho rằng có thể serotype này độc hơn và dễ lây truyền hơn những serotype khác (Nataro và Kaper, 1998). Tuy nhiên cũng có nhiều serotype khác ngoài O157:H7 có liên quan đến HC và HUS trên người. Những serotype non-O157 phổ biến nhất liên quan đến bệnh trên người thuộc O26, O91, O103, O111 (Paton, 1989). Hầu hết tính chất sinh hóa của E. coli O157:H7 đều tương tự như những E. coli khác. Điểm khác biệt về sinh hóa của dòng O157:H7 là không lên men đường sorbitol và β-glucuronidase dương tính. 93% chủng E. coli thì lên men sorbitol trong 24 giờ, trong khi E. coli O157:H7 lại không. 93% chủng E. coli cho β-glucuronidase dương tính trong khi E. coli O157:H7 thì không. Ngoài ra trong môi trường TSB, O157:H7 phát triển nhanh ở 30 – 42 o C, tăng trưởng khó khăn ở 43 – 44 o C và ngừng tăng trưởng ở 45 o C (dẫn liệu bởi Trần Thanh Phong, 1998). Liều gây nhiễm của E. coli O157:H7 là rất nhỏ, từ 10 – 100 vi khuẩn (Griffin, 1994; Paton, 1996), nhưng cũng may mắn là E. coli O157 hiện diện trong phân, thực phẩm với tần số thấp hơn nhiều so với nhóm non-O157 (Paton, 1998). Đây cũng là trở ngại cho việc phát hiện E. coli O157:H7. Dựa vào những tính chất riêng biệt của dòng E. coli này, nhiều môi trường tăng sinh và chọn lọc đã được tạo ra để phát hiện O157:H7 trong thực phẩm. Người ta dùng môi trường tăng sinh có bổ sung thêm kháng sinh cefixime, cefsulodin, vancomycin để hạn chế sự tăng trưởng của những vi trùng Gram âm khác. Sau đó sử dụng môi trường Download» Agriviet.com 10 tuyển lựa để phát hiện nhóm E. coli O157. Thường nhất là môi trường SMAC hoặc SMAC có bổ sung cefixime và tellurite (CT-SMAC) (FDA, 2002). 2.1.5.3 Nguồn lây nhiễm: STEC có thể được tìm thấy trong phân của nhiều loài động vật như trâu bò, cừu, dê, heo, chó và mèo (Beutin, 1993; Beutin, 1995; Chapman, 1997) và ngựa (Chalmer, 1997). Loài động vật quan trọng nhất trong việc gây nhiễm cho người là trâu bò. Đường gây nhiễm chủ yếu của STEC vào thực phẩm là việc vấy nhiễm chứa vật đường tiêu hóa và phân vào thòt trong quá trình giết mổ (Paton, 1998). STEC lây truyền qua người chủ yếu bằng con đường thực phẩm, nước và từ người qua người. Hầu hết các trường hợp là do ăn thực phẩm đã bò nhiễm, đặc biệt là thực phẩm có nguồn gốc động vật, mà thòt bò là nguyên nhân chủ yếu (Keskimaki, 2001). 2.1.6 Enteropathogenic E. coli (EPEC) EPEC là nhóm E. coli gây tiêu chảy quan trọng có liên quan đến tiêu chảy ở trẻ sơ sinh tại những nước đang phát triển. Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E (attaching-and-effacing, A/E), có thể quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay thú bò nhiễm bệnh và trong nuôi cấy tế bào (dẫn liệu Nataro và Kaper, 1998). Kiểu hình riêng biệt này được đặc trưng bởi sự hư hại của các vi nhung mao và sự kết dính chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biểu mô. Dạng tổn thương này khác với dạng tổn thương do dòng ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và V. cholerae bám theo kiểu không chặt, không gây bào mòn vi nhung). Mặc dù những nghiên cứu trước đây đã báo cáo về những tổn thương mô bệnh học dạng này, nhưng cho đến khi Moon và ctv (1983) báo cáo rằng kiểu tổn thương này có liên quan rộng rãi đến EPEC thì thuật ngữ “gắn kết và gây hư hại” (“attaching and effacing” – A/E) mới được đưa ra. Gen cần thiết cho việc tạo ra tổn thương A/E là gen eae mã hóa protein intimin. Protein này là yếu tố độc lực cần thiết của EPEC (Donnerberg, 1993). Theo Nataro và Kaper (1998), gen eae [...]... Kết quả phát hiện gen độc lực Phân bò 10 9,5 *10 6 ± 7,4 *10 6 Không phát hiện Phân heo 10 10 2 *10 6 ± 46,3 *10 6 Không phát hiện Thòt bò 8 14 ,8 *10 4 ± 4,2 *10 4 Không phát hiện Thòt heo 23 0,4 *10 4 ± 1, 1 *10 4 Không phát hiện Đối tượng mẫu PHÂN THỊT E coli là vi khuẩn thuộc nhóm coliforms sống thường trực và chiếm ưu thế trong đường ruột của người và gia súc, theo phân phát tán vào môi trường bên ngoài Số lượng... dương này được cung cấp từ Phòng thí nghiệm Trường Đại học Thú y Toulouse (Pháp) Số mẫu xét nghiệm các gen độc lực của E coli Mẫu E coli phân lập được Phương pháp phân lập Số mẫu thực hiện PCR Multiplex – PCR1 Multiplex – PCR2 Phân bò 10 10 Phân heo 10 10 Thòt bò 8 8 Thòt heo 23 23 Phân bê 10 10 Phân heo con 22 22 Phân bò 21 21 Phân heo 25 25 Thòt bò 34 34 Thòt heo 49 49 212 212 Đối tượng mẫu Phân bình... 4 .1 Tổng số vi khuẩn E coli và kết quả phát hiện các gen độc lực của E coli phân lập được từ phân và thòt bò, heo bằng qui trình đònh lượng Xác đònh tổng số vi khuẩn E coli của 10 mẫu phân bò bình thường, 10 mẫu phân heo bình thường, 8 mẫu thòt bò và 23 mẫu thòt heo theo qui trình đònh lượng, kết quả được trình bày ở bảng 4 .1 Bảng 4 .1 Tổng số vi khuẩn E coli trong phân và thòt bò, heo Số mẫu Tổng số. .. không phát hiện được các gen độc lực của E coli thu thập từ qui trình đònh lượng Do vậy tổng số vi khuẩn E coli xác đònh được bằng qui trình đònh lượng chỉ phản ánh mức độ vấy nhiễm E coli vào thực phẩm nhưng không thích hợp cho việc phát hiện các gen độc lực 4.2 Kết quả phát hiện các gen độc lực của E coli phân lập được từ phân bê tiêu chảy và phân heo con tiêu chảy Nhằm bước đầu thử nghiệm qui trình phân. .. Agriviet.com Số lượng mẫu khảo sát STT Đối tượng mẫu Phân lập đònh tính Phân lập qua đònh lượng 1 Thòt heo 49 23 2 Thòt bò 34 8 Bình thường 25 10 Tiêu chảy 22 - Bình thường 21 10 Tiêu chảy 10 - 16 1 51 3 Phân heo 4 Phân bò Tổng cộng Qui trình phân lập vi khuẩn E coli - Từ mẫu thòt và mẫu phân bình thường, vi khuẩn E coli được phân lập, đònh lượng theo qui trình FAO (19 92) - Mẫu phân bê và heo con tiêu chảy được. .. phân heo con tiêu chảy, thòt bò và thòt heo Phát hiện các gen độc lực của E coli đã phân lập đònh tính bằng kỹ thuật multiplex - PCR 23 Download» Agriviet.com 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3 .1 Phân lập vi khuẩn E coli Đối tượng lấy mẫu - Thòt bò, heo được lấy từ các chợ lẻ (dùng cho qui trình đònh lượng) - Bề mặt quày thòt bò, thòt heo được lấy trong lò mổ (dùng cho qui trình phân lập đònh tính) - Phân. .. chảy Nhằm bước đầu thử nghiệm qui trình phân lập đònh tính và qui trình phát hiện các gen độc lực của E coli, chúng tôi chọn 2 đối tượng có khả năng phát hiện các dòng E coli gây bệnh cao nhất là phân bê tiêu chảy và phân heo con tiêu chảy để khảo sát Ở phân bê tiêu chảy Kết quả phát hiện các gen độc lực của E coli phân lập được từ 10 mẫu phân bê tiêu chảy được trình bày ở bảng 4.2 36 ... - Phân lập vi khuẩn E coli trong phân và thòt bò, heo bằng phương pháp đònh lượng Từ đó đánh giá mức độ vệ sinh thực phẩm bằng cách so sánh với tiêu chuẩn Việt Nam về số lượng E coli trên thòt tươi (TCVN 7046 - 2002) Sử dụng kỹ thuật multiplex - PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn E coli phân lập được bằng qui trình đònh lượng - Phân lập đònh tính vi khuẩn E coli trong phân bê tiêu chảy, phân. .. trong 10 phút - Chuyển ngay vào tủ –70 oC, giữ trong 10 phút - Rã đông hoàn toàn - Ly tâm với tốc độ 10 .000 rpm trong 3 phút - Thu phần nổi làm DNA khuôn mẫu 3.3.3 Xác đònh gen độc lực eae, hly, stx1, stx2, stx2e, sta, stb, lt-I của E coli phân lập được từ thòt và phân Việc phát hiện các gen độc lực của E coli được thực hiện bằng 2 phản ứng multiplex – PCR với máy luân nhiệt (thermal cycler): - Multiplex. .. du lòch và liên quan đến những vụ ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn bò ô nhiễm Tóm lại, một số gen độc lực quan trọng của những nhóm E coli gồm: STT 1 2 3 4 5 6 7 8 Gen độc lực eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-I Nhóm E coli EPEC, STEC STEC STEC STEC STEC ETEC ETEC ETEC Việc phát hiện các gen độc lực của E coli thường được thực hiện dựa trên những kỹ thuật sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật PCR