C : Kéo dài – DNA polymerase tổng hợp mạch mới kể từ mồi đã bắt cặp dưới sự hiện diện của 4 loại dNTP và chất đệm thích hợp
TÀI LIỆU THAM KHẢO
CÁC VẤN ĐỀ THƯỜNG GẶP TRONG MULTIPLEX – PCR VÀ HƯỚNG GIẢI QUYẾT
VÀ HƯỚNG GIẢI QUYẾT
Vấn đề Hướng giải quyết
Sản phẩm không chuyên biệt
* Nếu dài
- Tăng nồng độ KCl (buffer) đến 1,2 - 2X nhưng giữ nguyên nồng độ
MgCl2 ở 1,5 – 2 mM.
* Nếu ngắn
- Giảm nồng độ buffer còn 0,7 - 0,9X nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 -
2 mM.
- Tăng dần nhiệt độ ủ bắt cặp. - Giảm lượng ADN xét nghiệm . - Giảm lượng primer.
- Giảm lựơng Taq - polymerase.
- Tăng nồng độ MgCl2 3 - 4,5 mM nhưng giữ nguyên nồng độ dNTP.
- Thêm chất phụ gia, tốt nhất là dùng BSA (0,1 - 0,8 μg/μl: nồng độ
cuối cùng). Có thể dùng thử 5% glycerol (v/v nồng độ cuối).
* Nếu không có sản phẩm.
- Chạy PCR cho mỗi cặp mồi được sử dụng trong multiplex với nhiệt độ ủ bắt cặp thấp hơn bình thường.
- So sánh sản phẩm không chuyên biệt cho mỗi cặp mồi kiểm tra với sản phẩm không chuyên biệt nhìn thấy khi chạy multiplex - PCR. Điều này có thể chỉ ra mỗi cặp mồi mang lại những sản phẩm không chuyên biệt trong phản ứng multiplex.
- Kết hợp một vài hoặc tất cả những phương pháp trên.
Sản phẩm yếu (mờ)
- Giảm thời gian ủ bắt cặp.
- Giảm nhiệt độ kéo dài đến 62 - 680C.
- Tăng thời gian kéo dài.
- Tăng nồng độ ADN xét nghiệm. - Tăng tất cả lượng primer sử dụng.
- Điều chỉnh nồng độ Taq - polymerase.
- Thay đổi nồng độ buffer nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2 mM.
- Tăng nồng độ MgCl2 đến 3 - 4,5 mM nhưng giữ nguyên nồng độ
dNTPs.
Vấn đề Hướng giải quyết
Sản phẩm dài và yếu
(mờ)
- Giảm nồng độ buffer còn 0,7 - 0,8X nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 –
2 mM.
- Tăng nồng độ MgCl2 lên 3 - 4,5 mM nhưng giữ nguyên nồng độ
dNTPs.
- Tăng thời gian biến tính. - Tăng thời gian ủ bắt cặp. - Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp.
- Tăng thời gian và nhiệt độ kéo dài.
- Tăng lượng primer đối với sản phẩm PCR có băng mờ đồng thời giảm lượng primer cho băng đậm.
- Thêm chất phụ gia, tốt nhất là dùng BSA ( 0,1 - 0,8μg/μl). Nên thử
5% glycerol (v/v nồng độ cuối cùng).
- Kết hợp một vài hoặc tất cả các phương pháp trên.
Sản phẩm ngắn và yếu (mờ)ø
- Tăng nồng độ buffer đến 1,2 - 2X nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2
mM.
- Giảm thời gian biến tính. - Giảm thời gian ủ bắt cặp. - Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp.
- Giảm thời gian và nhiệt độ kéo dài.
- Tăng lượng primer đối với sản phẩm PCR có băng mờ và giảm lượng primer cho băng đậm.
- Thêm chất phụ gia BSA (0,1 - 0,8 μg/μl), có thể thử 5% glycerol (v/v
nồng độ cuối cùng).