Mục tiêu của bài báo là tối ưu quy trình multiplex real-time PCR nhận diện DNA bò, trâu, heo, từ đó ứng dụng quy trình để phân biệt nhanh, chính xác loại thịt và sản phẩm chế biến từ thịt bò, heo, trâu trong gian lận thượng mại. Quy trình tối ưu có nồng độ mồi 200 nM và đoạn dò 100 nM (bò và trâu), nồng độ mồi 300 nM và đoạn dò 150 nM (heo); chu trình nhiệt 500C/2 phút, 950C/2 phút, 45 chu kỳ gồm biến tính ở 950C/15 giây và bắt cặp - kéo dài ở 600C/40 giây. Quy trình có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện của phương pháp đối với hỗn hợp mẫu thịt tươi và thịt đã xử lý nhiệt (80 - 1200C/15 phút) là 0,1% theo khối lượng hoặc 0,005 ng DNA/phản ứng.
63 Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh A multiplex real-time PCR method for differentiation of beef, buffalo meat and pork Tan M Tran1∗ , & Tuan N Nguyen2 Regional Animal Health Office No.6, Ho Chi Minh City, Vietnam Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, Vietnam ARTICLE INFO ABSTRACT Research Paper The objective of this study was to optimize a multiplex real-time PCR protocol for detection of DNA of beef, buffalo meat and pork, serving for food authenticity The optimized concentrations were 200 nM primer and 100 nM specific probe for beef/buffalo meat, and 300 nM primer and 150 nM probe for pork The amplification was performed using initial denaturation at 500 C for min, 950 C for min, followed by 45 cycles of denaturation at 950 C for 15 sec, and annealing and extension at 600 C for 40 sec This protocol had high sensitivity and specificity The detection limit of this method was found to be 0.1% in raw and heat-treated meat mix (80 - 1210 C/15 min) or 0.005 ng DNA/reaction The protocol of testing was applied for the commercial products both fresh and processed meats The results demonstrated that 50% of raw beef sample (6/12) weren’t found beef DNA Eight of twelve beef sausage samples (66.67%) contained buffalo DNA Beef DNA were found in all 12 samples of beef meatballs, but eight out of the 12 meatball samples were confirmed to have buffalo DNA (66.67%) and two out of the 12 meatball samples (16.67%) also contained porcine DNA Received: May 15, 2018 Revised: July 28, 2018 Accepted: August 14, 2018 Keywords Beef Buffalo DNA Multiplex real-time PCR Pork ∗ Corresponding author Tran Minh Tan Email: tranminhtan06@gmail.com Cited as: Tran, T M., & Nguyen, T N (2019) A multiplex real-time PCR method for differentiation of beef, buffalo meat and pork The Journal of Agriculture and Development 18(1), 63-71 www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển 18(1) 64 Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Phân biệt thịt bị, trâu, heo kỹ thuật multiplex real-time PCR Trần Minh Tấn1∗ & Nguyễn Ngọc Tuân2 Chi Cục Thú Y Vùng VI, TP Hồ Chí Minh Khoa Chăn Ni Thú Y, Trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh THƠNG TIN BÀI BÁO TĨM TẮT Bài báo khoa học Mục tiêu báo tối ưu quy trình multiplex real-time PCR nhận diện DNA bị, trâu, heo, từ ứng dụng quy trình để phân biệt nhanh, xác loại thịt sản phẩm chế biến từ thịt bò, heo, trâu gian lận thượng mại Quy trình tối ưu có nồng độ mồi 200 nM đoạn dò 100 nM (bò trâu), nồng độ mồi 300 nM đoạn dò 150 nM (heo); chu trình nhiệt 500 C/2 phút, 950 C/2 phút, 45 chu kỳ gồm biến tính 950 C/15 giây bắt cặp - kéo dài 600 C/40 giây Quy trình có độ nhạy độ đặc hiệu cao, giới hạn phát phương pháp hỗn hợp mẫu thịt tươi thịt xử lý nhiệt (80 - 1200 C/15 phút) 0,1% theo khối lượng 0,005 ng DNA/phản ứng Áp dụng quy trình để kiểm tra thịt tươi sản phẩm thịt chế biến thị trường phát gian lận Kết nghiên cứu sơ cho thấy 50% (6/12) mẫu thịt bị tươi khơng phát DNA bị Có 66,67% (8/12) mẫu xúc xích bị chứa thịt trâu sản phẩm Tất 12 mẫu bò viên kiểm tra phát có chứa DNA bị, 66,67% mẫu lẫn thịt trâu 16,67% mẫu lẫn thịt heo Ngày nhận: 15/05/2018 Ngày chỉnh sửa: 28/07/2018 Ngày chấp nhận: 14/08/2018 Từ khóa Bị DNA Heo Multiplex real-time PCR Trâu ∗ Tác giả liên hệ Trần Minh Tấn Email: tranminhtan06@gmail.com Đặt Vấn Đề Việc xác định loài sản phẩm thịt lĩnh vực phát triển nhanh chóng có liên quan đến sức khỏe người tiêu dùng, tôn giáo gian lận thương mại Trên thị trường, nhiều sản phẩm thịt tươi sản phẩm thịt chế biến không ghi nhãn hiệu, thành phần loại thịt để gian lận, lừa dối người tiêu dùng nhằm thu lợi bất Người Ai Cập số người châu Âu thích sử dụng thịt trâu để thay thịt bò lo sợ bệnh bò điên - BSE (Sakaridis & ctv., 2013) Việt Nam số nước không cho phép nhập bột thịt xương có nguồn gốc từ bị nước vùng lãnh thổ có bệnh BSE để làm nguyên liệu cho thức ăn gia súc Một số báo cáo cho thấy có gian lận thương mại gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm sức khỏe người tiêu dùng Theo Ayaz & ctv (2006), khoảng 22% thịt sản phẩm thịt chế biến Thổ Nhĩ Kỳ chứa loại thịt không ghi nhãn Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển 18(1) Ở Trung Quốc, cảnh sát thu giữ 20 thịt bò giả làm từ thịt heo xử lý với hóa chất (Jeanette, 2013) Tháng 02/2016, Chi cục Thú y TP Hồ Chí Minh bắt tang cơng ty ngâm thịt heo nái với hóa chất huyết bò để làm giả thịt bò (Hoang, 2016) Tháng 07/2016, Trung tâm giám định pháp y (Sở Y tế TP.HCM) thơng báo kết giám định bị viên cơng ty (quận Bình Tân) cho thấy mẫu bị viên nhãn hiệu GoGo có DNA cá, khơng tìm thấy DNA bò mẫu bò viên nhãn hiệu Merlion có DNA trâu cá khơng có DNA bị (NCVTV24, 2016) Như vậy, thịt bò sản phẩm từ thịt bị có giá trị kinh tế cao bị làm giả từ thịt trâu, thịt heo Ngày nay, có nhiều phương pháp phân biệt loại thịt sản phẩm chế biến từ thịt Phương pháp phát dựa vào protein điện di, miễn dịch, sắc ký Nhược điểm phương pháp lại cho kết chậm áp dụng với sản phẩm thịt xử lý nhiệt độ cao Phương www.jad.hcmuaf.edu.vn 65 Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh pháp dựa vào DNA khuếch đại ngẫu nhiên đa hình DNA-RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), PCR đặc trưng cho loài (speciesspecific PCR) thường sử dụng nhiều để xác định loài thịt bò (Mane & ctv., 2012), thịt trâu (Girish & ctv., 2013), thịt heo (Erwanto & ctv., 2014) Tuy nhiên, phương pháp chủ yếu phát loài nhất, đoạn DNA mục tiêu kích thước lớn nên dễ bị hư hỏng nhiệt chế biến Hậu làm cho kỹ thuật tin cậy đắt tiền (Ali & ctv., 2015) Với phát triển sinh học phân tử, kỹ thuật cho phép phát nhiều gene đích nhiều loài khác sản phẩm thịt, đồng thời tăng độ tin cậy phản ứng sử dụng đoạn dò (probe) đặc hiệu rút ngắn thời gian thu kết (Ali & ctv., 2014) Tuy nhiên, đến thời điểm tại, chưa có nhiều cơng trình ứng dụng multiplex real-time PCR phát lúc thịt bò, trâu, heo từ thịt tươi sản phẩm thịt chế biến Đây ba loại thịt mà người tiêu dùng khó phân biệt mặt cảm quan, người sản xuất giả nhãn hiệu thành phần sản phẩm Vì vậy, mục tiêu báo tối ưu quy trình phân biệt thịt bị, trâu, heo phản ứng multiplex real-time PCR nhằm phân biệt nhanh xác loại thịt sản phẩm chế biến từ thịt bò, heo, trâu chứng minh gian lận thượng mại; kiểm soát thức ăn gia súc có thành phần bị từ vùng bị bệnh bò điên nhập vào Việt Nam Vật Liệu Phương Pháp Nghiên Cứu 2.1 Chuẩn bị mẫu Hai mươi bốn mẫu thịt tươi (bò, heo, trâu) thu thập từ số lò mổ mẫu thịt kiểm dịch nhập TP Hồ Chí Minh Mẫu bảo quản lạnh đông -200 C đến tiến hành thử nghiệm Mỗi mẫu thịt tươi lấy khoảng 100 g cho vào túi nylon sạch, dán nhãn riêng Ba mươi mẫu thịt từ 15 loài động vật thủy sản khác thu thập để kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu (02 mẫu lồi) Bao gồm nhóm thú ăn cỏ (cừu, dê, ngựa), nhóm gia cầm (gà, cút, vịt, ngan), nhóm thú ăn thịt (chó, mèo), nhóm thú gậm nhấm (thỏ, chuột) nhóm hải sản (tơm, cá) Ngoài ra, đậu nành kiểm tra đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu thành phần thường thêm vào chế biến xúc xích thịt Khảo sát thu thập 12 mẫu thịt bò tươi www.jad.hcmuaf.edu.vn thớt thịt lẻ; xúc xích bị (12 mẫu) bò viên (12 mẫu) từ siêu thị, cửa hàng thực phẩm TP.HCM để kiểm tra thành phần thịt ghi nhãn sản phẩm 2.2 Chiết tách DNA 25 mg sản phẩm cho mẫu tách chiết DNA kít DNeasy blood and tissue (Qiagen, Đức Cat.No 69606) Độ tinh DNA kiểm tra cách đo mật độ quang (OD) bước sóng 260 nm 280 nm máy quang phổ (Nanodrop 2000) Mẫu DNA tách chiết tinh có tỷ số OD260 /OD280 đạt từ 1,8 - 2,0 Nồng độ DNA tổng số (ng/µL) ước lượng theo cơng thức: OD260 × 50 × độ pha lỗng 2.3 Đoạn mồi đoạn dị Trình tự đoạn mồi đoạn dị theo Bảng 2.4 Quy trình multiplex real-time PCR Mỗi ống phản ứng 25 ➭l PCR chứa mastermix µL DNA, nồng độ mồi theo Bảng Sử dụng kít Platinum Quantitative PCR SuperMixUDG(Invitrogen, Cat.No 11730-017) Phản ứng real-time PCR thực máy Agilent Stratagene Mx 3005P Systems, 500 C/2 phút, 950 C/2 phút, 45 chu kỳ biến tính 950 C/15 giây bắt cặp - kéo dài 600 C/40 giây Tối ưu hóa phản ứng simplex để khẳng định nồng độ mồi thích hợp cho lồi điều kiện phịng thí nghiệm DNA lồi pha lỗng bậc 10 từ mẫu gốc để chạy đường chuẩn Có hai thơng số thể tính ổn định đường chuẩn (Pham, 2009) Thông số hệ số tương quan R2 Trị số R2 phải đạt (≥) 0,99 Có nghĩa đường biểu diễn chuẩn phải đạt độ tuyến tính cao Thơng số thứ hai hiệu PCR gọi E% (PCR efficiency) PCR đạt hiệu lý tưởng sau chu kỳ cường độ huỳnh quang ống phản ứng tăng gấp đơi Hai ống phản ứng có số lượng DNA đích ban đầu cách hệ số pha lỗng A, hai đường biểu diễn khuếch đại cách n chu kỳ với cường độ huỳnh quang hai ống cách hệ số pha loãng A = 2n Hiệu PCR chấp nhận E% khoảng 90% đến 110% Với công thức E% = (E - 1) × 100%; E = 10- 1/slope , với slope độ dốc đường chuẩn Đường biểu diễn chuẩn lý tưởng slope -3,32 Độ dốc phép dao động khoảng -3,58 đến -3,1 Tạp chí Nông nghiệp Phát triển 18(1) 66 Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Trình tự mồi (5’– 3’) AGTTAGAGATTGAGAGCCATATACTCTCC TTGATAAGATCATTGTCAGTCATGTTG FAM-TGGTGACATGCCGCAACTAGACACG-BHQ1 CGAGAGGCTGCCGTAAAGG TGCAAGGAACACGGCTAAGTG HEX-TCTGACGTGACTCCCCGACCTGG-BHQ2 TCTGGGGAGGATTCTCAGTAG AAGTGCTGCGATAATGAATGG ROX-AGCAACCCTCACCCGATTCTTCGC-BHQ1 Bảng Trình tự đoạn mồi đoạn dị Ký hiệu mồi Mồi xi bị F Mồi ngược bị R Đoạn dị bị P Mồi xi heo F Mồi ngược heo R Đoạn dị heo P Mồi xi trâu F Mồi ngược trâu F Đoạn dò trâu P Sau thực real-time PCR đơn, hai tổ hợp mastermix lồi chọn Ba lồi: bị, heo trâu với tổ hợp mastermix đơn loài tạo thành tổ hợp master mix đa mồi để chạy realtime PCR Tổ hợp master mix chọn có đường khếch đại huỳnh quang xuất sớm (giá trị Ct nhỏ) giai đoạn bình nguyên ổn định Tổ hợp mồi thích hợp chọn có nồng độ theo Bảng 2.5 Độ đặc hiệu, độ nhạy Mẫu thịt bò đối chứng dương lấy từ nhiều nguồn gốc khác bò ta vàng nước, bò nhập từ Mỹ, Úc, Nhật, Thịt trâu lấy từ trâu nước trâu từ Ấn Độ Thịt heo lấy từ giống heo địa phương, heo rừng, heo ngoại lai thịt heo nhập Mẫu âm tính lấy từ loài khác mẫu thịt cừu, dê, ngựa, gà, cút, vịt, ngan, chó, mèo, thỏ, chuột, tơm, cá tra, cá ngừ bột đậu nành Độ nhạy tỷ lệ % dương tính phương pháp chẩn đốn tổng số mẫu dương tính thật Độ đặc hiệu tỷ lệ % âm tính phương pháp chẩn 2.6 Giới hạn phát (LOD) Để xác định giới hạn phát phương pháp, DNA tách chiết pha loãng bậc 10 với nồng độ giảm dần từ 10 ng/µL đến 0,0001 ng/µL Sau đó, phản ứng multiplex real-time PCR thực để tìm nồng độ thấp phát DNA bò, trâu heo Nồng độ (nM) 200 200 100 300 300 150 200 200 100 2.7 Xử lý số liệu Số liệu thu thập xử lý Excel Kết Quả Thảo Luận Tham khảo Koppel & ctv., 2010 Koppel & ctv., 2008 Koppel & ctv., 2013 3.1 Tách chiết DNA Tất 56 mẫu tách chiết DNA Nồng độ DNA thu từ 40,6 - 94,6 ng/µL tỷ số OD260 /OD280 nằm khoảng 1,8 - 2,0 Như vậy, DNA tinh tốt, sẵn sàng sử dụng cho phản ứng real-time PCR 3.2 Quy trình multiplex real-time PCR Hệ số tương quan R2 DNA bò 0,992 với heo 0,990 trâu 0,995 (Hình 1) Những hệ số tương quan hoàn toàn phù hợp với giới Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển 18(1) www.jad.hcmuaf.edu.vn 67 Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh hạn cho phép (R2 ≥ 0,99) Hệ số cho thấy giá trị Ct điểm pha loãng bậc 10 có độ tuyến tính cao, thao tác pha lỗng mẫu, thao tác pipet hút lượng thể tích cần sử dụng Một tiêu chí khác để đánh giá phản ứng real-time PCR hiệu phản ứng PCR (E%) Khoảng giới hạn cho phép E% khoảng 90 - 110% Giá trị E% đạt phản ứng real-time PCR đa mồi từ 96,2 - 104,3% (Hình 1) nằm giới hạn cho phép Mặt khác, độ dốc (slope) từ -3,417 đến - 3,222 phù hợp với khoảng giới hạn từ -3,58 đến -3,10 0,005 ng/phản ứng, giá trị Ct trung bình mẫu DNA bị 36,72 ➧ 0,240 Ct mẫu heo trâu nồng độ 37,75 ➧ 0,125 37,71 ➧ 0,100 Ở nồng độ pha lỗng sau cho kết âm tính với ba lồi khơng ghi nhận tín hiệu huỳnh quang, RSD tất nồng độ pha lỗng có giá trị nhỏ 1,0 (0,08 0,886) Như vậy, giới hạn phát DNA quy trình 0,005 ng/phản ứng 3.4 Ứng dụng giới hạn phát hỗn hợp thịt tươi thịt xử lý nhiệt Trong thí nghiệm này, thịt gà sử dụng làm mẫu để thêm loại thịt bị, heo, trâu tạo thành hỗn hợp có tỷ lệ khác nhau, giảm dần từ 32,0% đến 0,1% Sở dĩ thí nghiệm chọn tỷ lệ phối trộn thấp 0,1% gian lận thương mại mức tỷ lệ không đem lại hiệu kinh tế, giá thành sản phẩm giảm không đáng kể Kết Bảng cho thấy khơng có khác biệt lớn giá trị Ct mẫu xử lý nhiệt mẫu thịt tươi Và tỷ lệ 0,1% trọng Hình Đường khuếch đại DNA bò (a), heo (b) lượng, giá trị Ct mẫu thịt tươi thịt xử trâu (c) Đường chuẩn DNA bò, heo, trâu (d) lý nhiệt nằm khoảng 29,02 đến 34,61 Như vậy, bò, heo, trâu phát mức 0,1% Độ đặc hiệu phản ứng đánh giá trọng lượng hỗn hợp thịt tươi thịt xử lý mẫu thịt loài mục tiêu loài khác nhiệt Tổng số mẫu thực 56 mẫu Trong có mẫu bị, mẫu heo, mẫu trâu 30 mẫu 15 3.5 Áp dụng để kiểm tra số mẫu thịt tươi thịt chế biến lưu hành thị trường loài khác gồm cừu, dê, ngựa, gà, cút, vịt, ngan, chó, mèo, thỏ, chuột, tơm, cá tra, cá ngừ mẫu đậu nành Tín hiệu huỳnh quang màu FAM 3.5.1 Mẫu thịt tươi ghi nhận mẫu có nguồn gốc từ Trong 12 mẫu thịt bò kiểm tra, kết bị Những mẫu có nguồn gốc từ heo, trâu nhận diện 06 mẫu thịt bò, 02 mẫu thịt lồi khác khơng ghi nhận tín hiệu màu FAM trâu 04 mẫu diện vừa thịt heo thịt bò Tương tự, màu HEX ghi nhận trâu (Bảng 4) Bốn mẫu mẫu thịt mẫu có nguồn gốc từ heo màu ROX người bán thái mỏng trước thu ghi nhận mẫu có nguồn gốc thập mẫu Có lẽ người bán thịt pha lẫn thịt từ trâu Các mẫu bò, heo, trâu phát phản ứng multiplex real- trâu với thịt heo để tạo hương vị màu sắc thịt time khơng có phản ứng chéo lồi bị nhằm đánh lừa người tiêu dùng Như vậy, khác Độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng nửa số mẫu thịt bị tươi kiểm tra có gian lận, làm giả thịt bò từ thịt heo thịt trâu đạt 100% bò, heo trâu 3.3 Giới hạn phát DNA Giá trị Ct độ lệch chuẩn tương đối (relative standard deviation: RSD) thể Bảng Giá trị RSD biến thiên thấp cho thấy phản ứng multiplex real-time PCR có tính ổn định cao nồng độ DNA khác lần chạy kiểm tra khác Tại nồng độ www.jad.hcmuaf.edu.vn 3.5.2 Mẫu xúc xích Trong 12 mẫu kiểm tra, tất phát thành phần heo cơng bố bao bì nhà sản xuất (Bảng 5) Tuy nhiên, thịt trâu phát tất mẫu công ty A B Đó thành phần thịt mà cơng ty không công bố nhãn sản phẩm Thịt Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển 18(1) Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 68 Giá trị Ct 22,45 22,30 22,14 26,44 26,20 26,05 29,88 29,80 29,88 33,12 33,32 33,53 36,9 36,45 36,82 36,72 33,32 29,85 26,23 Bị Trung bình 22,30 0,240 0,205 0,046 0,197 SD 0,155 0,654 0,615 0,155 0,750 RSD 0,695 Giá trị Ct 23,58 23,88 23,97 27,59 28,00 28,02 31,21 31,4 31,37 33,96 33,91 33,96 37,84 37,61 37,81 - Bảng Giá trị Ct pha lỗng bậc 10 DNA thịt bị, heo, trâu DNA (ng) 50 0,5 0,05 0,005 0,0005 37,75 33,94 31,33 27,87 Heo Trung bình 23,81 0,125 0,029 0,102 0,243 SD 0,204 0,331 0,085 0,326 0,871 RSD 0,858 Giá trị Ct 23,65 23,69 23,60 27,46 27,18 226,98 30,96 30,87 30,96 34,11 34,03 34,12 37,71 37,61 37,81 - 37,71 34,12 30,93 27,21 Trâu Trung bình 23,65 0,100 0,095 0,052 0,241 SD 0,045 0,265 0,279 0,168 0,886 RSD 0,191 www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển 18(1) www.jad.hcmuaf.edu.vn 32 10 3,2 0,32 0,1 Tỷ lệ (%) Thịt tươi 20,10 21,61 23,48 25,45 27,4 29,02 1210 C/15’ 21,59 22,88 24,77 26,91 29,38 31,60 Thịt tươi 22,83 24,86 26,93 29,44 32,71 34,32 Heo 800 C/15’ 22,51 24,44 27,13 29,49 31,01 33,96 Ký hiệu mẫu T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 Lồi Thịt bị Thịt bị Thịt bò Thịt bò Thịt bò Thịt bò Thịt bò Thịt bò Thịt bò Thịt bò Thịt bò Thịt bò Hình thức Thịt thái mỏng Thịt thái mỏng Thịt nguyên miếng Thịt nguyên miếng Thịt nguyên miếng Thịt nguyên miếng Thịt thái mỏng Thịt thái mỏng Thịt nguyên miếng Thịt nguyên miếng Thịt nguyên miếng Thịt nguyên miếng Ct bò 15,94 16,68 15,75 16,09 16,01 16,78 19,99 18,77 - Ct trâu 11,49 14,47 11,9 14,01 19,52 20,4 - Thịt tươi 19,98 22,20 23,74 25,50 26,92 28,99 Ct heo 13,41 14,61 - 1210 C/15’ 22,45 23,60 26,53 28,83 30,99 34,61 Bảng Giá trị Ct mẫu thịt tươi lưu hành thị trường Bò 800 C/15’ 21,30 23,59 24,99 27,68 29,13 31,25 Bảng Giá trị Ct hỗn hợp thịt tươi thịt xử lý nhiệt Trâu 800 C/15’ 20,33 22,68 24,29 27,30 27,89 30,13 1210 C/15’ 19,56 21,85 22,98 23,51 25,72 29,11 Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 69 Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển 18(1) 70 Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Bảng Giá trị Ct mẫu xúc xích thị trường Kí hiệu mẫu X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 Công ty A A A A B B B B C C C C Thành phần nhãn Heo, gà Bị, heo Heo, tơm Heo, tơm Gà, heo, đậu nành Gà, heo, đậu nành Bò, heo, gà Bò, heo, gà Heo, gà Heo, gà, đậu nành Bò, heo, gà, cá Bò, heo, cá Bò 21,31 24,05 22,85 18,33 19,01 Heo 21,35 22,79 17,71 17,36 23,32 19,24 26,68 21,62 19,33 20,04 22,17 23,08 Trâu 19,63 18,47 16,56 17,82 20,46 21,51 20,97 20,76 - Bò 20,33 17,95 23,15 22,15 22,1 23,46 20,06 17,44 21,16 20,59 20,16 21,08 Heo 22,36 19,38 24,36 19,16 20,03 20,57 22,03 22,78 Trâu 18,48 16,51 18,99 18,72 17,75 16,36 18,91 19,05 - Bảng Giá trị Ct mẫu bị viên thị trường Kí hiệu mẫu V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 Công ty A A B B C C D D E E F F Thành phần nhãn Bò, cá basa Bò, cá basa Bò, đậu nành Bò, đậu nành Bò, cá basa, gà Bò, cá basa, gà Bò, mỡ heo Bò, mỡ heo Bò, heo, gà Bò, heo, gà Bị, thịt heo Bị, thịt heo trâu thêm để tăng giá trị dinh dưỡng hương vị sản phẩm Mặt khác, giá trị kinh tế trâu thấp bò Cho nên việc thêm thịt trâu vào xúc xích bị xúc xích bị heo để giảm giá thành sản xuất, tăng lợi nhuận 3.5.3 Mẫu bị viên Bị viên có giá cao loại thịt viên khác Thịt viên sau xay nhỏ, chế biến, tẩm ướp gia vị khó nhận biết thành phần cảm quan Mười hai (12) mẫu bị viên từ cơng ty chọn để kiểm tra Kết từ Bảng cho thấy tất 12 mẫu phát có thịt bị sản phẩm Tuy nhiên, hai mẫu bị viên cơng ty A phát thêm thịt trâu sản phẩm Đây thành phần không công bố nhãn Đối với mẫu công ty B, heo trâu hai thành phần khơng có nhãn phát multiplex real-time PCR Tương tự, mẫu Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển 18(1) cơng ty D E phát thịt trâu sản phẩm Như vậy, có 04 12 mẫu thành phần bị, heo, trâu cơng bố sản phẩm Hai số 12 mẫu (16,67%) diện thêm thịt heo mà không công bố nhãn; có 12 mẫu (66,67%) thêm thịt trâu vào sản phẩm bò viên Kết Luận Đã tối ưu quy trình multiplex real-time PCR phân biệt thịt bò, trâu, heo với độ đặc hiệu độ tin cậy cao, giới hạn phát thịt tươi (bò, trâu, heo) thịt xử lý nhiệt (80 - 1200 C/15 phút) 0,1% theo trọng lượng hỗn hợp 0,005 ng DNA/phản ứng Ứng dụng multiplex real-time PCR để phát mẫu thịt tươi nguyên miếng thái mỏng số sản phẩm thịt chế biến thị trường cho thấy có vấn đề gian lận giả thịt bò từ thịt heo thịt trâu www.jad.hcmuaf.edu.vn Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tài Liệu Tham Khảo (References) Ali, M E., Asing, Hamid, S B A., Razzak, M A., Rashid, N R A., Al Amin, M., & Mustafa, S (2015) A suitable method to detect potential fraud of bringing Malayan box turtle (Cuora amboinensis) meat into the food chain Food Additives & Contaminants, Part A, 32(8), 1223-1233 Ali, M E., Razzak, M A., & Hamid, S B A (2014) Multiplex PCR in species authentication: Probability and prospects review Food Analytical Methods 7(10), 1933-1949 Ayaz, Y., Ayaz N D., & Erol I (2006) Detection of species in meat and meat products using enzymelinked immunosorbent assay Journal of Muscle Foods 17(2), 214-220 Erwanto, Y., Zainal Abidin, M., Sugiyono, E Y P M., & Rohman, A (2014) Identification of pork contamination in meatballs of Indonesia local market using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) analysis Asian-Australasian Journal of Animal Sciences 27(10), 1487–1492 Girish, P S., Haunshi, S., Vaithiyanathan, S., Rajitha, R., & Ramakrishna, C (2013) A rapid method for authentication of buffalo (Bubalus bubalis) meat by alkaline lysis method of DNA extraction and species-specific polymerase chain reaction Journal of Food Science and Technology 50(1), 141-146 Hoang, L (2016) All samples of fake beef originated from sow meat are contaminated with microorganisms The Youth Newspaper Retrieved February 17, 2016, from http://tuoitre.vn/tin/kinhte/20160217/tat-ca-mau-thit-heo-nai-gia-thit-bo-deunhiem-vi-sinh/1052863.html 71 Koppel, R., Ruf, J., & Rentsch, J (2010) Multiplex realtime PCR for the detection and quantification of DNA from beef, pork, horse and sheep European Food Research and Technology 232(1), 151-155 Koppel, R., Ruf, J., Zimmerli, F., & Breitenmoser, A (2008) Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef, pork, chicken and turkey European Food Research and Technology 227(4), 1199-1203 Koppel, R., Weibel, S., Ruf, J., Eugster, A., Beck, K., & Rentsch, J (2013) Interlaboratory validation of two multiplex quantitative real-time PCR methods to determine species DNA of cow, sheep and goat as a measure of milk proportions in cheese European Food Research and Technology 236(1), 217-227 Mane, B G., Mendiratta, S K., & Tiwari, A K (2012) Beef specific polymerase chain reaction assay for authentication of meat and meat products Food Control 28(2), 246-249 NCVTV24 (News Center VTV24) (2016) No beef DNA from the samples of beef meatballs of Viet Sin is detected Retrieved July 12, 2016, from http://vtv.vn/chuyen-dong-24h/khong-tim-thay-adncua-bo-trong-2-mau-bo-vien-cua-viet-sin-201602.htm Pham, V H (2009) PCR and real-time PCR, basic problems and common applications Ho Chi Minh City, Vietnam: Medical Publishing House Sakaridis, I., Ganopoulos, I., Argiriou, A., & Tsaftaris, A (2013) A fast and accurate method for controlling the correct labeling of products containing buffalo meat using high resolution melting (HRM) analysis Meat Science 94(1), 84-88 Jeanette, T (2013) Chinese police seize more than 20,000 kg of fake beef Retrieved September 20, 2013, from https://sg.news.yahoo.com/blogs/what-isbuzzing/chinese-police-seize-more-20-000kg-fake-beef035448883.html www.jad.hcmuaf.edu.vn Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển 18(1) ... F F Thành phần nhãn Bò, cá basa Bò, cá basa Bò, đậu nành Bò, đậu nành Bò, cá basa, gà Bò, cá basa, gà Bò, mỡ heo Bò, mỡ heo Bò, heo, gà Bò, heo, gà Bò, thịt heo Bò, thịt heo trâu thêm để tăng... Thịt bị Thịt bị Thịt bị Thịt bị Thịt bò Thịt bò Thịt bò Thịt bò Thịt bò Thịt bị Thịt bị Thịt bị Hình thức Thịt thái mỏng Thịt thái mỏng Thịt nguyên miếng Thịt nguyên miếng Thịt nguyên miếng Thịt. .. nhãn Heo, gà Bị, heo Heo, tơm Heo, tôm Gà, heo, đậu nành Gà, heo, đậu nành Bò, heo, gà Bò, heo, gà Heo, gà Heo, gà, đậu nành Bò, heo, gà, cá Bò, heo, cá Bò 21,31 24,05 22,85 18,33 19,01 Heo 21,35