Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng phương pháp mới với chi phí thấp hơn, giúp phát hiện 2 type Human papillomavirus nguy cơ thấp thường gặp nhất là Human papillomavirus 6 và Human papillomavirus 11 với độ nhạy 5 copy/phản ứng 25 µL bằng kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụng Taqman probe cải tiến có gắn thêm ZEN quencher gần đầu 5-huỳnh quang HEX, song song với phát hiện gen nội chuẩn β-actin bằng Texas-Red Taqman probe.
Trang 1PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX REAL TIME PCR SỬ DỤNG TAQMAN PROBE CẢI TIẾN ĐỂ PHÁT HIỆN HPV NGUY CƠ THẤP
TYPE 6 VÀ 11 VỚI ĐỘ ĐẶC HIỆU VÀ ĐỘ NHẠY CAO
Trần Thị Ngọc Ánh 1,2# , Ngô Thị Hồng 1,2,3# , Chu Văn Sơn 1 , Trần Dụ Chi 4,5 , Bùi Thị Việt Hà 1,2 , Nguyễn Thị Vân Anh 1*
*Tác giả liên hệ; #: Đồng tác giả thứ nhất
1 Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; 2 Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội
3 Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh, Thành phố Bắc Ninh
4 Bệnh viện Da liễu Trung ương; 5 Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec Human papillomavirus (HPV) là tác nhân gây bệnh phổ biến lây nhiễm qua đường tình dục, gồm nhiều sub-type được phân thành nhóm nguy cơ cao gây ung thư và nhóm nguy cơ thấp gây các bệnh lý về da và niêm mạc với tỷ lệ nhiễm và khả năng tái phát cao Trên thị trường đã có sinh phẩm nhập ngoại để phát hiện một số type Human papillomavirus nguy cơ thấp, tuy nhiên giá thành cao nên khó triển khai thành kít sàng lọc trong cộng đồng Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng phương pháp mới với chi phí thấp hơn, giúp phát hiện 2 type Human papillomavirus nguy cơ thấp thường gặp nhất là Human papillomavirus 6 và Human papillomavirus 11 với độ nhạy 5 copy/phản ứng 25 µL bằng kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụng Taqman probe cải tiến có gắn thêm ZEN quencher gần đầu 5-huỳnh quang HEX, song song với phát hiện gen nội chuẩn β-actin bằng Texas-Red Taqman probe Kết quả so sánh trên 30 mẫu dịch âm đạo với sinh phẩm thương mại có uy tín cho kết quả tương đồng về tỷ lệ mẫu dương tính và chu kỳ ngưỡng phát hiện Human papillomavirus 6/11
Từ khoá: HPV, nguy cơ thấp, real time PCR Taqman, dịch âm đạo
Địa chỉ liên hệ: Nguyễn Thị Vân Anh, Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên
Email: vananhbiolab@gmail.com
Ngày nhận: 30/7/2018
Ngày được chấp thuận: 04/9/2018
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Human papiloma virus (HPV) là một trong
những tác nhân gây bệnh quan trọng lây
nhiễm qua đường tình dục ở cả nam và nữ
trên toàn thế giới và được cho là bệnh truyền
nhiễm qua đường tình dục phổ biến nhất ở
Hoa Kỳ [1] Các type Human papillomavirus
16 và 18 và 12 type khác như 31, 33, 35, 39,
45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 đã được nghiên
cứu và chứng minh có nguy cơ cao gây bệnh
ung thư cổ tử cung [2,3,4] Ngoài các type có
nguy cơ cao, một số type nguy cơ thấp được
công nhận là nguyên nhân gây ra các tổn thương lành tính trên da (mụn cơm, mụn cóc thông thường, mụn cơm phẳng) Hai type HPV nguy cơ thấp 6 và 11 là nguyên nhân của 90% các bệnh lý về da [5] Nhiễm trùng papillomatosis chủ yếu gặp ở trẻ nhỏ được sinh ra từ những bà mẹ có tiền sử nhiễm HPV trong giai đoạn chu sinh [6 - 8] Những tổn thương này có thể chuyển đổi thành ác tính [9] Nhiễm trùng HPV thường không biểu hiện lâm sàng nên không thể có thống kê chính xác
số lượng người nhiễm trên toàn thế giới Ước tính trên thế giới, hàng năm, HPV gây ra mụn cóc sinh dục cho 0,1 - 0,2% dân số, chủ yếu ở tuổi vị thành niên, thanh thiếu niên [10] Các type này rất dễ lây truyền qua tiếp xúc (da, niêm mạc, dịch tiết có virus) Do đó, việc chẩn
Trang 2đoán sàng lọc tại cộng đồng HPV 6 và 11
cũng góp phần quan trọng để phòng tránh lây
nhiễm, đặc biệt là cho trẻ sơ sinh Hiện nay,
phương pháp hiệu quả nhất để chẩn đoán
HPV là dựa vào vật liệu di truyền (kỹ thuật
PCR/real time PCR) Trên thế giới, đã có công
bố của một vài tác giả về phát triển kỹ thuật
multiplex real time PCR để phát hiện đồng
thời một số type nguy cơ cao và nguy cơ thấp
trong sàng lọc HPV ở các mẫu dịch âm đạo
Điển hình là công bố của tác giả Lindh và
cộng sự (2007) về phát hiện 12 type HPV
nguy cơ cao và 2 type nguy cơ thấp HPV 6/11
đồng thời trên cùng một chu trình nhiệt [11]
Tuy nhiên, hạn chế của nghiên cứu là sử
dụng Taqman probe thông thường có huỳnh
quang TAMRA ở đầu 3’ nên tín hiệu nền còn
cao và chưa tối ưu được master mix để phát
hiện của 14 type trong cùng 1 ống phản ứng
mà vẫn phải thực hiện 14 ống phản ứng riêng
rẽ cho mỗi mẫu Một hạn chế khác là chưa có
thông tin tối ưu về độ nhạy và độ đặc hiệu của
phản ứng Nghiên cứu của tác giả Seaman và
cộng sự (2010) có cải tiến hơn trong việc phát
triển được kỹ thuật multiplex real time PCR
phát hiện đồng thời HPV 16, 18 và 2 type HPV
nguy cơ thấp 6, 11 [12] Tuy nhiên, độ nhạy
của ngưỡng phát hiện chỉ đạt 103 copy/phản
ứng 25 µL, một phần do sử dụng Taqman
probe thông thường có BHQ1 quencher ở đầu
3’ Tác giả Yu và cộng sự (năm 2012) đã sử
dụng probe huỳnh quang AllGlo để phát hiện
đồng thời 4 type HPV 6, 11, 16, 18 với độ
nhạy 10 copy/phản ứng 25 µL [13] Trên thị
trường có bộ kít phát hiện HPV type 6 và 11
nguy cơ thấp HPV 6/11 Real-TM (Sacace
Biotechnologies, Ý) có độ nhạy đạt tới 2,5
copy/phản ứng 25 µL nhưng thành phần và
công thức chưa được công bố Ngoài ra, giá
thành sinh phẩm nhập ngoại cao (178.000
VNĐ/ phản ứng) nên khó khăn khi triển khai thành xét nghiệm sàng lọc tại cộng đồng Ở trong nước, chúng tôi chưa tìm thấy thông tin
về nghiên cứu phát triển phương pháp hay bộ sinh phẩm phát hiện các type HPV nguy cơ thấp mà mới chỉ có thông tin về các bộ sinh phẩm phát hiện các type HPV nguy cơ cao
Do vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi đặt mục tiêu bước đầu phát triển phương pháp multiplex real time PCR sử dụng Taqman probe cải tiến gắn thêm ZEN quencher để phát hiện 2 type HPV nguy cơ thấp thường gặp nhất là HPV 6 và HPV 11 có độ đặc hiệu 100% và độ nhạy đạt tới ≤ 5 copy phản ứng
25 µL Kết quả của nghiên cứu là tiền đề cho việc phát triển phương pháp phát hiện đồng thời các type HPV nguy cơ cao và nguy cơ thấp trong tương lai, hướng tới việc chế tạo
bộ sinh phẩm có chất lượng tương đương và giá thành cạnh tranh so với bộ sinh phẩm thương mại có uy tín trên thị trường Nhờ đó, góp phần tầm soát tỷ lệ nhiễm HPV và đánh giá hiệu quả vacxin
II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1 Đối tượng
Mẫu tham chiếu dùng để xây dựng phương pháp:
+ Mẫu HPV: các mẫu DNA được tinh sạch
và xác định dương tính với các HPV genotypes khác nhau Trong đó có 14 type HPV nguy cơ cao phổ biến (HPV 16, 18, 31,
33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) do bệnh viện Phụ Sản Trung ương cung cấp đã được xác định đồng thời bằng kit thương mại
Diagnostics - Thuỵ Sỹ và GenoFlow human papillomavirus array test (GF test) của hãng Diagcor - Hồng Kông và có 2 type nguy cơ
Trang 3thấp (HPV 6, 11) do bệnh viện Da liễu Trung
ương cung cấp đã được xác định đồng thời
GF test (Diagcor – Hồng Kông) và HPV 6/11
Real-TM của hãng Saccase – Ý Các mẫu
được lựa chọn có giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct)
l, tương đương với nồng độ chuẩn dương hay
được sử dụng trong các kit thương mai DNA
của các mẫu tham chiếu được sử dụng làm
khuôn để nhân bản trình tự đặc hiệu bằng
PCR sử dụng cặp mồi GP5+/6+ (theo khuyến
cáo của CDC) và giải trình tự DNA để khẳng
định type
+ Mẫu nhiễm các vi sinh vật gây bệnh
khác: các mẫu DNA dương tính với các tác
nhân gây bệnh bao gồm: Hepatitis B virus
(HBV), Hepatitis C virus (HCV), Human
tuberculosis (MTB), Epstein - Barr virus (EBV),
Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium
do Bệnh viện Bạch Mai, Học Viện Quân Y và
Bệnh viện Da liễu Trung ương cung cấp Mẫu
HBV, HCV và HSV type 1 - 2 được xác định
bằng các kít thương mại (Real time PCR
Diagnostics - Thuỵ Sỹ; mẫu CMV được xác
qPCR, mẫu MTB được xác định bởi
mẫu M hominis và M genitalium được xác
qPCR của hãng ANABIO R&D - Vietnam, và
Diagcor STD array test - Hồng Kông) Các
của các vi sinh vật nhiễm được sử dụng là
khá cao, tối thiểu là 103 copies/µl
Mẫu thử nghiệm: Mẫu bệnh phẩm (n = 95)
được lấy từ dịch âm đạo của bệnh nhân và được bảo quản trong dung dịch nước muối sinh lý đã khử trùng Mẫu được sử dụng ngay
để tách chiết DNA tổng số và DNA được sử
khi tiến hành real time PCR Mẫu được thu thập theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện, tại Trung tâm kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh
từ năm 2017 đến 2018 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân là phụ nữ trong độ tuổi từ 18 - 65 tuổi, đến khám và tự nguyện tham gia nghiên cứu; tiêu chuẩn loại trừ là những bệnh nhân
đã cắt cổ tử cung hoàn toàn, đang trong thời
kỳ kinh nguyệt, viêm nhiễm nặng và đang đặt thuốc Nghiên cứu được phê duyệt bởi hội đồng khoa học, trên cơ sở quyết định số 1124/QĐ-ĐHKHTN của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, và được thực hiện theo đúng đạo đức nghiên cứu trong Y học Bệnh nhân được cung cấp đầy đủ thông tin về nghiên cứu, được bảo mật thông tin cá nhân và ký vào phiếu đồng thuận tham gia nghiên cứu
2 Phương pháp
2.1 Thiết kế primer và probe cho phản ứng real time PCR phát hiện đồng thời type HPV 6 và HPV 11
Hai cặp mồi và probe sử dụng trong nghiên cứu này được thiết kế sử dụng IDT’s PrimerQuest kết hợp với phần mềm SnapGen
version 4.1.3 dựa vào trình tự vùng gen E6-E7
đặc hiệu cho HPV 6 (Acession No
HG793938.1), trình tự vùng gen E1 đặc hiệu
cho HPV 11 (Acession No JQ773411.1) được công bố trên ngân hàng gen NCBI Hai trình
tự probe đặc hiệu cho HPV 6 và HPV 11 được cải tiến gắn thêm ZEN quencher dye tại oligonucleotide thứ 9 gần đầu 5’-huỳnh quang HEX để tăng khả năng hấp thụ hay dập tắt tín
Trang 4hiệu của HEX khi probe chưa gắn vào khuôn,
nhờ đó tín hiệu nền giảm và độ nhạy của phản
ứng được tăng lên Cặp mồi và probe đặc
hiệu cho human β-actin (ACTB) được thiết kế
theo công bố của Nguyen và cộng sự [14]
Mồi và probe được tổng hợp bởi hãng IDT (Hoa Kỳ) và được trình bày ở bảng 1
Bảng 1 Các cặp mồi và probe đặc hiệu cho HPV 6 và HPV 11
Mồi/
Gen đích
Kích thước (bp)
Lượng (pmol/
pứ)
5
6-HEX
probe
/5HEX/AAGGGTCGC/ZEN/TGCCTACACTGCT
5
11-HEX
probe
/5HEX/CGGAATGG A/ZEN/TAAC GCGCCA
ACTB-Fw GATGTCCACGTCACACTTCA
β-actin 115
3
ACTB-
Texas
probe
/5TexasRed/ATGCCTGAGAGGGAAATGAGG
2.2 Tách chiết DNA của HPV và nhân
dòng tạo chuẩn dương chứa trình tự đặc
hiệu của HPV 6 và HPV 11
DNA tổng số của virus được tách chiết từ
mẫu bệnh phẩm dịch âm đạo sử dụng bộ sinh
phẩm ANAPURE VIRAL DNA/RNA mini kit
(ANABIO R & D, Việt Nam) theo hướng dẫn
của nhà sản xuất, sau đó được lưu trữ ở
-20oC cho các phản ứng PCR và real time
PCR DNA sau tinh sạch từ mẫu tham chiếu
dương tính HPV 6 và HPV 11 được sử dụng
làm khuôn cho phản ứng PCR nhân bản trình
tự gen đặc hiệu E6 - E7 và E1 kích thước
tương ứng 165 bp và 174 bp của HPV 6 và
HPV 11 Thành phần phản ứng PCR gồm 1X Hot - Taq Buffer; 0,2 mM dNTP; 1U Hot - Taq;
Phản ứng PCR được thực hiện với chế độ
950C - 30 giây, 600C - 30 giây, 720C - 30 giây;
tra bằng điện di trên gel agarose 2%, nhuộm Ethidium bromide và chụp ảnh bằng hệ thống Gel Doc XR (Biorad)
Sản phẩm PCR 165 bp đặc hiệu cho HPV
6 và 174 bp đặc hiệu cho HPV 11 được nhân dòng trực tiếp vào vector pTOP sử dụng bộ sinh phẩm TOPcloner ™ TA Kit (Enzynomics,
Trang 5Hàn Quốc) Plasmid tái tổ hợp mang đoạn
chèn 165 bp và 174 bp được được biến nạp
vào E coli DH5 α, sau đó nuôi cấy trên môi
trường LB đặc bổ sung ampicillin 50 mg/L, rồi
tiến hành chọn lọc khuẩn lạc xanh-trắng và
sàng lọc bằng colony - PCR sử dụng cặp mồi
vector M13 - Fw/Rv (đi kèm bộ sinh phẩm) và
mồi đặc hiệu 6, 11 - Fw/Rv Khuẩn lạc tái tổ
hợp được sử dụng để tách plasmid để làm
chuẩn dương cho phản ứng real time PCR
phát hiện HPV 6 và HPV 11 và được đặt tên
tương ứng là pHPV6 - E6/7 và pHPV11 - E1
2.3 Xác định ngưỡng phát hiện của
phản ứng và tối ưu nồng độ của chuẩn
dương
Plasmid tái tổ hợp pHPV6-E6/7 và pHPV11
- E1 sau khi tinh sạch được xác định nồng độ
ở bước sóng 260 nm bằng máy quang phổ
Nanodrop Xác định ngưỡng phát hiện của
kỹ thuật multiplex real time PCR bằng cách
pha loãng nồng độ khuôn plasmid pHPV6 -
E6/7, pHPV11 - E1 và hỗn hợp 2 plasmid tỷ lệ
1: 1 ở dải nồng độ 103, 102, 10, 1 copies/µl
5 µl DNA khuôn được bổ sung vào 20 µl
mas-ter mix của multiplex real time PCR gồm:
TO-Preal Taqman PCR master mix 1X
(Enzynomics); 250 nM 6, 11 - Rv/Fw; 250 nM
11- Rv/ Fw; 50 nM 6, 11 - HEX probe; 150 nM
đạt tổng thể tích là 25 µl Phản ứng được thực
hiện với chu trình nhiệt là 950C - 10 phút;
trên hệ thống Light Cycler 96 (Roche
Diagnos-tics) Ngưỡng phát hiện là nồng độ thấp nhất
của chứng dương pHPV6 - E6/7 và pHPV11 -
E1 trong ống phản ứng mà vẫn phát hiện
được tín hiệu huỳnh quang với giá trị Ct < 40,
được tính bằng giá trị copies/µl DNA khuôn
đầu vào x 5)
2.4 Xác định độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu của multiplex real time PCR nêu trên được đánh giá thông qua kết quả dương tính giả (nếu có) khi sử dụng 5 µl DNA
của 14 type HPV nguy cơ cao phổ biến gồm HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58,
59, 66, 68, và của một số vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm khác gồm HBV, HCV, HSV,
CMV, MTB, EBV, Mycoplasma hominis, M
genitalium bổ sung vào hỗn hợp 20 µl master
mix có thành phần được mô tả trong mục 2.3 Phản ứng được thực hiện với chu trình nhiệt giống như áp dụng cho type HPV 6 và 11, được mô tả trong mục 2.3
2.5 Thử nghiệm phát hiện HPV 6 và HPV 11 trên mẫu bệnh phẩm và so sánh độ tương đồng với sinh phẩm thương mại
Tổng cộng 95 mẫu được sử dụng để thử nghiệm phát hiện HPV 6 và HPV 11 bởi master mix chế tạo và chu trình nhiệt thiết lập trong nghiên cứu này Trong đó, 30 mẫu gồm
10 mẫu dương tính và 20 mẫu âm tính với HPV 6 và 11 được sử dụng để so sánh tương đồng (tỷ lệ dương tính/âm tính) và độ nhạy (Ct) giữa sinh phẩm tạo thành trong nghiên cứu và sinh phẩm thương mại HPV 6/11 REAL-TM (Sacace Biotechnologies, Ý) Toàn bộ thí nghiệm từ mục 2.1 đến 2.4 được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên từ năm 2017 đến
2018 Thí nghiệm ở mục 2.5 được thực hiện tại cả Khoa Xét nghiệm - Chẩn đoán hình ảnh
- Thăm dò chức năng của Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật tỉnh Bắc Ninh và Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên trong năm 2018
Trang 6III KẾT QUẢ
1 Vector mang chuẩn dương HPV 6 và
HPV 11
Trong nghiên cứu này, đoạn gen đặc hiệu
cho vùng E6 - 7 của HPV 6 có kích thước 165
bp và đoạn gen đặc hiệu cho vùng E1 của
HPV 11 có kích thước 174 bp được khuếch
đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu
Kết quả trình bày ở Hình 1A cho thấy: sản
phẩm PCR với cặp mồi 6 - Fw và 6 - Rv cho
duy nhất một băng sắc nét với kích thước
tương ứng là 165 bp (giếng 3); tương tự, sản
phẩm PCR với cặp mồi HPV 11 cho một băng
rõ nét có kích thước 174 bp (giếng 4) Hai
băng này sau đó được tinh sạch và đem giải
trình tự Kết quả giải trình tự trùng khớp với
trình tư gen E6-7 của HPV 6 và trình tự gen
E1 của HPV 11 (không trình bày ở đây)
Sản phẩm PCR sau đó được nhân dòng
vào vector pTOP TA V2 sử dụng bộ sinh
phẩm TOPcloner™ TA Kit (Enzynomics, Hàn
Quốc) và khuẩn lạc tái tổ hợp được khẳng định bằng phương pháp colony - PCR sử dụng cặp mồi vector M13 - Fw/Rv (đi kèm bộ sinh phẩm) và mồi đặc hiệu 6, 11 - Fw/Rv Kết quả trình bày trên hình ảnh điện di ở giếng 6 (hình 1B) và giếng 2 (hình 1C) cho thấy kích thước băng điện di là 165 bp và 174 bp đúng với kích thước đoạn gen đặc hiệu của vector tái tổ hợp HPV6 - E6/7 và HPV11 - E1 Để khẳng định chắc chắn khuẩn lạc tái tổ hợp chứa gen đặc hiệu của HPV 6 và HPV 11, chúng tôi sử dụng cặp mồi vector M13 Rv/Fw cho kích thước đoạn gen khuếch đại được bằng tổng kích thước đoạn gen mồi M13 nhân lên (202 bp) cộng với kích thước đoạn gen đích Như vậy, kích thước tính toán về mặt lý thuyết khi sử dụng mồi vector cho đoạn gen đích HPV 6 và HPV 11 lần lượt là 367 bp và
376 bp Đúng như dự đoán, kết quả thể hiện trên hình 1B (giếng 2 - 4) hình 1C (giếng 4 - 6) cho thấy chúng tôi đã nhân dòng thành công plasmid tái tổ hợp pHPV6-E6/7 và pHPV11 - E1
Hình 1 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu HPV6-E6/7 và
HPV11-E1 (A) và kiểm tra sản phẩm sau nhân dòng (B, C)
(A): Giếng 1: Thang chuẩn DNA 100 bp, giếng 2: Đối chứng âm, giếng 3: sản phẩm PCR của
HPV6 - E6/7, giếng 4: sản phẩm PCR của HPV11 - E1; (B): Giếng 1: Đối chứng âm, giếng 2 - 4:
Sản phẩm PCR mồi vector M13, giếng 5: Thang chuẩn DNA 100 bp, giếng 6: sản phẩm PCR sử
Trang 7dụng mồi đặc hiệu Fw/Rv - 6; (C): Giếng 1: Đối chứng âm, giếng 4 - 6: Sản phẩm PCR sử dụng
mồi vector M13, giếng 3: Thang chuẩn DNA 100 bp, giếng 2: sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu Fw/Rv - 11
2 Ngưỡng phát hiện HPV 6 và HPV 11 bằng multiplex real time PCR
Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện của kỹ thuật multiplex real time PCR phát hiện đồng thời
cả HPV 6 và HPV 11 thể hiện ở hình 2 cho thấy tất cả các nồng độ của chứng dương ở dạng
pha loãng từ cao đến thấp giảm trung bình 3,2 Ngưỡng phát hiện HPV 6 của phản ứng lên tới 5 copy/phản ứng (1 copy/µl DNA đầu vào x 5 µl khuôn/phản ứng 25 µl) với giá trị R2: 0,993,
0,998, Efficiency: 85%, slope: -3,7) và đồng thời HPV 6,11 cũng lên tới 5 copy/phản ứng (R2: 0,999, Efficiency: 80%, slope: -3,99) Dựa trên kết quả này, ngưỡng phát hiện của kỹ thuật multiplex real time PCR phát hiện đồng thời 2 tác nhân gây bệnh HPV6, 11 được xác định là 5
copy/phản ứng 25 µl (tương đương nồng độ DNA khuôn 1 copy/µl)
Hình 2 Đường chuẩn biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của phản ứng Real time PCR
và đường hồi quy tuyến tính giá trị chu kỳ ngưỡng ở các dải nồng độ chuẩn dương
khác nhau: (A1, B1, C1)
Trang 8Đường chuẩn Real time PCR biểu diễn tín hiệu khuếch đại chuẩn dương HPV 6 (A1), HPV 11
(B1) và hỗn hợp HPV 6, 11 (C1) ở nồng độ 10 3 , 10 2 , 10,1 copy/µl; (A2, B2, C2) Đường hồi quy
tuyến tính giữa giá trị chu kỳ ngưỡng C t và nồng độ chuẩn dương HPV 6 (A2), HPV 11 (B2) và
hỗn hợp HPV 6, 11 (C2)
3 Độ đặc hiệu của multiplex real time PCR phát hiện HPV 6 và HPV 11
Để xác định độ đặc hiệu của real time PCR phát hiện HPV 6 và HPV 11, chúng tôi sử dụng 20
mẫu DNA dương tính với các type HPV nhóm nguy cơ cao (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,
52, 56, 58, 59, 66, 68) và một số tác nhân khác (HBV, HCV, HSV, CMV, MTB, EBV, Mycoplasma
hominis, Mycoplasma genitalium) đã được mô tả ở phần mẫu tham chiếu, làm DNA khuôn cho
multiplex real time PCR với cặp mồi và probe đã thiết kế cho HPV type 6 và 11 Kết quả ở Bảng 2
cho thấy sinh phẩm chế tạo trong nghiên cứu cho kết quả âm tính với các tác nhân gây bệnh
Bảng 2 Kết quả thử nghiệm độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm với một số tác nhân gây bệnh
4 Khả năng phát hiện sự có mặt của virus HPV6, 11 của master mix và đánh giá mức
độ tương đồng của kỹ thuật phát triển với bộ sinh phẩm thương mại
Sử dụng DNA tách chiết từ mẫu dịch phết âm đạo của 95 bệnh nhân đến khám tại Trung tâm
Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh để đánh giá khả năng phát hiện sự có mặt của HPV 6 và HPV
11 bởi master mix chế tạo trong nghiên cứu này (thành phần được mô tả ở mục nguyên liệu và
phương pháp, kết quả bảng 1, tạm đặt tên là HPV6/11 - KLEPT), chúng tôi phát hiện thấy có
10/95 (10,5%) mẫu dương tính với một trong 2 type HPV 6/11 (bảng 3)
Trang 9Bảng 3 Kết quả phát hiện HPV 6 và HPV 11 trên các mẫu thử nghiệm bằng master mix
chế tạo trong nghiên cứu và sinh phẩm thương mại
HPV 6/11 REAL-TM
Kit (Sacace)
HPV6/11 - KLEPT
Tổng số
Trong số 95 mẫu này, 10 mẫu bệnh phẩm dương tính và ngẫu nhiên 20 mẫu bệnh phẩm âm
tính (tổng cộng n = 30) được chọn để so sánh tương đồng giữa master mix HPV 6/11 - KLEPT
với bộ sinh phẩm thương mại đạt chuẩn IVD châu Âu có tên HPV 6/11 REAL-TM Kit (Sacace Biotechnologies, Ý) Kết quả thể hiện ở bảng 4 cho thấy tín hiệu dương tính của master mix HPV 6/11 - KLEPT chế tạo trong nghiên cứu (10 mẫu tín hiệu HEX cho cả HPV type 6/11) và của bộ kit thương mại (FAM cho 6 mẫu HPV type 6 và HEX cho 4 mẫu HPV type 11) chênh lệch không
có chất lượng tương đương với bộ sinh phẩm thương mại HPV 6/11 REAL - TM Kit (Sacace, Ý)
Bảng 4 Giá trị chu kỳ ngưỡng của phản ứng real time PCR phát hiện 10 bệnh nhân dương tính HPV 6 /11 bằng master mix trong nghiên cứu so sánh với sinh phẩm thương mại
STT
HPV6/11-KLEPT
HPV 6/11 Real-TM
Ct HEX
(HPV 6/11)
Ct FAM (HPV 6)
Ct HEX (HPV 11)
Ct Texas Red (nội chuẩn)
Trang 10IV BÀN LUẬN
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây
dựng thành công phương pháp phát hiện 2
type HPV nguy cơ thấp phổ biến nhất là HPV
6 và HPV 11 bằng kỹ thuật multiplex real time
PCR với master mix được tối ưu gồm nồng độ
mồi xuôi-ngược (5 pmol/phản ứng), Taqman
probe gắn huỳnh quang HEX (1 pmol/phản
ứng), cùng với việc phát hiện sự có mặt của
gen nội chuẩn β- actin thông qua tín hiệu
huỳnh quang Texas Red Ở đây, chúng tôi
chủ đích thiết kế duy nhất một kênh màu
huỳnh quang HEX cho cả 2 type HPV 6 và
HPV 11 để trong tương lai có thể ghép cặp
với các kênh màu huỳnh quang khác như
FAM phát hiện các type HPV nguy cơ cao và
Cy5 phát hiện HPV 16/18 cho việc phát triển
phương pháp phát hiện đồng thời các type
HPV nguy cơ cao và thấp trên hệ thống máy
real time PCR 4 kênh màu Ngoài ra, chúng tôi
đã nhân dòng thành công plasmid mang đoạn
gen đặc hiệu cho HPV 6 và HPV 11 để tạo
chuẩn dương cho phản ứng và đánh giá được
ngưỡng phát hiện của phản ứng phát hiện
HPV 6 và HPV 11 là 5 copy/phản ứng 25 µL
(tương đương với nồng độ DNA đầu vào là 1
copy/µl) dựa trên đường chuẩn hồi quy tuyến
tính có độ tin cậy cao (R2 = 0,999) Ngưỡng
phát hiện của master mix chế tạo tốt hơn rất
nhiều so với master mix được công bố bởi tác
25 µL) và tác giả Yu và cộng sự (10 copy/
phản ứng 25 µL), và gần như tương đương
với ngưỡng phát hiện của bộ sinh phẩm HPV
6/11 REAL - TM (2,5 copy/phản ứng 25 µL)
Kết quả trên mẫu thực cho thấy sự tương
đồng về % dương tính: âm tính (10: 20) cũng
điều kiện thu thập mẫu tham chiếu là các type
HPV nguy cơ thấp khác để thử nghiệm, kết quả bước đầu khi dùng bộ kit này trên các mẫu đã được xác định có chứa các type HPV nguy cơ cao và các virus, vi khuẩn gây bệnh phổ biến khác hay được phát hiện bằng phương pháp real time PCR trong các phòng xét nghiệm sinh học phân tử tại bệnh viện cho thấy độ đặc hiệu đạt được là 100%
Với kỹ thuật phát triển, chúng tôi tạm tính giá thành của master mix, mồi, probe chỉ khoảng 40.000 VNĐ/phản ứng trong khi sinh phẩm thương mại của Sacace HPV 6/11 REAL - TM Kit có giá thành 178.000VNĐ/phản ứng Mặc dù từ việc phát triển kỹ thuật đến việc chế tạo và thương mại kit là cả một quá trình dài tốn kém thời gian và chi phí chắc chắn sẽ còn tăng lên, phương pháp multiplex real time PCR sử dụng Taqman probe cải tiến được phát triển trong nghiên cứu này rất có tiềm năng ứng dụng trong việc chế tạo kit sàng lọc HPV 6 và HPV 11 tại cộng đồng có giá thành cạnh tranh với kit ngoại nhập Đây là kết quả tiền đề để chúng tối tiếp tục phát triển
kỹ thuật phát hiện đồng thời 14 type HPV nguy cơ cao và 02 type nguy cơ thấp bằng kỹ thuật multiplex real time PCR, nhằm tầm soát các type HPV gây bệnh qua đường tình dục
và đánh giá hiệu quả vắcxin
V KẾT LUẬN
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát triển thành công kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụng Taqman probe cải tiến để phát hiện 02 type HPV nguy cơ thấp thường gặp nhất là HPV 6 và HPV 11 với độ đặc hiệu 100% và độ nhạy đạt tới 5 copy/phản ứng 25
µL, cao hơn so với một số công bố trên thế giới Kết quả bước đầu so sánh master mix chế tạo trong nghiên cứu với sinh phẩm
thương mại đạt chuẩn IVD châu Âu cho thấy